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    止癢搽劑微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

    2009-04-29 00:00:00邱凱鋒
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2009年23期

    [摘要] 目的 建立止癢搽劑微生物限度檢查方法。方法 用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及控制菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證。結(jié)果 采用常規(guī)法后白色念珠菌及黑霉菌的試驗(yàn)組及稀釋劑對照組的回收率均大于70% ,采用薄膜過濾法后的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組及稀釋劑對照組的回收率也可達(dá)到70%以上;采用培養(yǎng)基稀釋法可檢出金黃色葡萄球菌,采用薄膜過濾法可檢出銅綠假單胞菌。結(jié)論 經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果符合現(xiàn)行《中國藥典》2005年版的要求。

    [關(guān)鍵詞] 止癢搽劑; 微生物限度; 驗(yàn)證

    [中圖分類號] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)23-56-03

    Study on the Microbial Limit Test of Zhiyangchaji

    QIU Kaifeng ZHU Jun

    The Second Affiliated Hospital of Zhongshan University,Guangzhou,510120,China

    [Abstract] ObjectiveTo establish a method for the determination of microbial limits in Zhiyangchaji. MethodsThe bacteria ,molds ,yeasts and controlled bacteria were counted by the common methods ,dilution method and membrane adhering method. ResultsThe recoveries of Candida albicans,Aspergillus niger in test group and diluted control group were above 70% when common method were used. The recoveries of Escherichiacoli,Staphy lococcus aureus,B acillus subtilis in test group and diluted control group were above 70% when membrane filtration method was used. Staphy lococcus aureus can be detected by dilution method and Pseudomonas aeruginosa can be detected by membrane filtration method. ConclusionThrough t he technological validation ,the result is consistent with the requirement of ChP.in force.

    [Key Words]Zhiyangchaji; Microbial limit; Validation

    止癢搽劑為我院傳統(tǒng)醫(yī)院制劑,其主要成分為五指柑、大風(fēng)艾、地膚子,此3味中藥在體外有不同的抑菌作用?,F(xiàn)根據(jù)《中國藥典》2005版,對其微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證,以保證測定結(jié)果的可靠性。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL),營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,改良馬丁培養(yǎng)基,改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。稀釋劑:pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(以上均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

    1.2 菌種

    大腸埃希菌[CMCC(B)(44102)],金黃色葡萄球菌[CMCC(B)(26003)],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)(63501)],白色念珠菌[CMCC(F)(98001)],銅綠假單胞菌[CMCC(B)(10104)],黑曲霉菌[CMCC(F)(98003)](以上均來源于中國藥品生物制品檢驗(yàn)所)。

    1.3 樣品

    止癢搽劑,本院自制制劑,批號分別為:0802018、0802278、0803201。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試液制備

    取樣品10mL,加入pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL,使成1∶10的供試液。

    2.2 菌液制備[1]

    ①取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24h,取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基,經(jīng)25℃培養(yǎng)24~48h,上述培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL 含菌數(shù)為50~100cfu 的菌懸液,備用。

    ②取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)5~7d的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物,加3~7mL0.9 %無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。吸取胞子懸液(用管口帶有薄的無菌或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管)至無菌試管內(nèi),加0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL 含菌數(shù)為50~100cfu的菌懸液,備用。

    2.3 細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

    ①試驗(yàn)組分別取1∶10供試液1mL、0.5mL、0.2mL,加上述菌懸液1mL,置直徑90mm的無菌平皿中,傾注溫度不超過45℃的溶化的瓊脂培養(yǎng)基15mL,待凝固后置35℃培養(yǎng)48h,白色念珠菌置25℃培養(yǎng)72h,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。②菌液組分別取菌懸液1mL 置平皿中不加供試液,余下方法及結(jié)果判斷同試驗(yàn)組。③供試品對照組取1∶10供試液1mL,除不加菌液外,余下方法及結(jié)果判斷同試驗(yàn)組。④稀釋液對照組取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL替代供試液,余下方法及結(jié)果判斷同試驗(yàn)組。⑤回收率計(jì)算回收率應(yīng)不低于70%試驗(yàn)組菌回收率=[(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)- 供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%稀釋液組菌回收率=(稀釋液組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù))×100%

    3 試驗(yàn)結(jié)果

    3.1 常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法

    由表1結(jié)果可見,用常規(guī)法試驗(yàn),白色念珠菌和黑霉菌的回收率都高于70%,而金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均未達(dá)到70%。用培養(yǎng)基稀釋(0.5mL/皿)和(0.2mL/皿)試驗(yàn)各菌株的回收率,稀釋至0.2mL/皿時(shí),枯草芽孢桿菌的回收率還是為0。因此,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查可用常規(guī)法,細(xì)菌檢查不適合用常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法。

    3.2 薄膜過濾法[2]

    取1∶10供試液1mL,加入100mLpH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液,過濾,再用300mL、400mL、500mLpH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液分3次、4次、5次沖洗濾膜,在最后1次沖洗至剩約30mL沖洗液時(shí)加入相應(yīng)的菌液1mL,搖勻,濾干。然后取出濾膜,菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。本組為試驗(yàn)組,除分別不加菌懸液、供試液外,同法制備供試品對照組、稀釋劑對照組。

    由表2結(jié)果可見,當(dāng)沖洗液為400mL時(shí),各個(gè)菌株的回收率均可達(dá)到70%以上,因此可用薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)檢查。

    4 各種檢查方法驗(yàn)證

    4.1 控制菌檢查方法驗(yàn)證

    本品為外用制劑,按藥典規(guī)定,控制菌應(yīng)檢銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。驗(yàn)證菌株的菌液制備同細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的菌液制備。

    4.2 銅綠假單胞菌檢查法的驗(yàn)證

    ①試驗(yàn)組 各取1∶10供試液1mL及1mL銅綠假單胞菌菌懸液分別加入100mL、200mL、400mL、500mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基,按銅綠假單胞菌的檢查法進(jìn)行檢查。②陰性菌對照組 將驗(yàn)證菌株改為大腸埃希菌,其余操作同試驗(yàn)組。

    4.3 金黃色葡萄球菌檢查法的驗(yàn)證

    ①試驗(yàn)組 各取1∶10供試液1mL及1mL金黃色葡萄球菌菌懸液分別加入100mL、200mL、400mL、500mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,按金黃色葡萄球菌的檢查法進(jìn)行檢查。②陰性菌對照組 將驗(yàn)證菌株改為大腸埃希菌,其余操作同試驗(yàn)組。

    4.4 試驗(yàn)結(jié)果

    各陰性菌對照菌組未檢出陰性對照菌。金黃色葡萄球菌的驗(yàn)證,當(dāng)培養(yǎng)基增加至200mL時(shí),可檢出試驗(yàn)菌,表明金黃色葡萄球菌的檢查可用培養(yǎng)基稀釋法。銅綠假單胞菌的驗(yàn)證,當(dāng)培養(yǎng)基增加到500mL時(shí),仍未能消除樣品的抑菌作用。

    4.5 薄膜過濾法驗(yàn)證銅綠假單胞菌檢查法

    試驗(yàn)組取供1∶10試液1mL分別加入100mLpH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液,過濾,再分別用300mL、400mL、500mLpH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液分3次、4次、5次沖洗濾膜,在最后1次沖洗至剩約30mL沖洗液時(shí)加入銅綠假單胞菌菌液1mL,然后取出濾膜,放入100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中,按銅綠假單胞菌檢查法檢查。陰性菌對照組除將驗(yàn)證菌株改為大腸埃希菌菌液1mL外,其余方法同試驗(yàn)組。

    結(jié)果在沖洗量達(dá)到400mL時(shí),試驗(yàn)組可檢出試驗(yàn)菌銅綠假單胞菌,而陰性對照組未檢出陰性對照菌。

    5 討論

    由于本品中的某些中藥成分具有一定的抑菌活性,故須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ驕p弱藥物的抑菌活性,使微生物正常生長。在薄膜過濾法中,沖洗濾膜時(shí)采用梯度法,少量多次,每次濾筒中沖洗液高度應(yīng)超過前一次沖洗液高度,這樣更有利于供試液中微生物的回收。采用貼膜法計(jì)數(shù)時(shí),枯草芽孢桿菌、黑曲霉兩種試驗(yàn)菌的加入量最好接近50cfu,分別培養(yǎng)24h、48h后計(jì)數(shù)。否則,因形成的菌落較多或連成片,使計(jì)數(shù)不準(zhǔn),另外原藥液本身有顏色,濾膜被染色后,亦干擾計(jì)數(shù)。以此次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),確定本品的微生物限度檢查方法如下:用常規(guī)法測定其霉菌、酵母菌數(shù);用薄膜過濾法測定其細(xì)菌數(shù);用培養(yǎng)基稀釋法測定金黃色葡萄球菌,用薄膜過濾法測定銅綠假單胞菌數(shù)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] 國家藥典委員會(huì). 中國藥典[S]. 二部. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:附錄93.

    [2] 宋勤,杜平華. 中成藥微生物限度檢查法的探討[J]. 中國藥事,2006, 20(1):46.

    (收稿日期:2009-03-20)

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