三七總皂甙對(duì)局灶腦缺血再灌注海馬中ＮＧＦ及ＴｒｋＡ的影響

鄧　昌

摘 要：目的：探討三七總皂甙對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷的海馬神經(jīng)生長(zhǎng)因子及酪氨酸激酶A含量變化的影響。方法：120只SD大鼠體重200~220g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(n=40)，局灶腦缺血再灌注組(n=40)和三七總皂甙治療組(n=40)。線栓法制備大腦中動(dòng)脈梗阻（MCAO）模型，藥物組在腦缺血再灌注即刻和12h腹腔注射三七總皂甙，模型組和假手術(shù)組均注射等量生理鹽水。分別在缺血再灌注2h、4h、6h、12h和24h處死動(dòng)物，運(yùn)用RT—PCR技術(shù)檢測(cè)缺血側(cè)海馬組織內(nèi)NGF和TrkA的mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：再灌注損傷后，損傷側(cè)海馬組織內(nèi)NGF和TrkA的mRNA表達(dá)均增高。在三七總皂甙治療組中NGF和TrkA的mRNA于再灌注2h上升，4h達(dá)高峰。結(jié)論：腦缺血后損傷側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)NGF和TrkA的mRNA含量增多，可能有利于受損神經(jīng)元的修復(fù)。

關(guān)鍵詞：局灶性腦缺血再灌注；三七總皂甙；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；酪氨酸激酶A

中圖分類號(hào)：R322.81文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）02-0026-03

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)三七皂苷對(duì)多種動(dòng)物腦缺血及再灌注損傷有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)理與鈣離子拮抗及抗自由基等作用有關(guān)，同時(shí)三七皂苷還具有降低血粘度、抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管、降低血脂、改善學(xué)習(xí)記憶功能及改善微循環(huán)和抗炎等作用［1，2］。

本研究擬用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法建立缺血模型，采用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)海馬組織內(nèi)NGF及TrkAmRNA含量的變化，并研究三七總皂甙對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后腦內(nèi)NGF及TrkA含量變化的影響來(lái)闡明其對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

成年SD大鼠，雌雄各半，體量220～250g，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。三七總皂甙注射液(批號(hào)：ZZ-5559，商品名：腦明注射液)。TRIZOL試劑（Molecular Research Center），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Company)，PCR試劑盒PCR Master Mix Kit（Fermentas Company），DNA Ladder Marker 2000，DNA上樣緩沖液(大連寶生物)，TRIZOL(Molecular Reseach Center)。兔抗NGF多克隆抗體(Chemicon)，兔抗TrkA多克隆抗體(博士德生物工程有限公司)， 二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒PV-9000(北京中杉)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、三七總皂甙治療組(PNS組).每組根據(jù)再灌注時(shí)間不同再分為2h、4h、6h、12h和24h 5個(gè)亞組，每亞組8只動(dòng)物。

1.2.2 模型制作

參考Longa［3］的線栓法，造成右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的缺血；2h后拔出線栓恢復(fù)再灌注，并縫扎切口。假手術(shù)組僅分離血管而不插線栓。三七組在拔出線栓后立即經(jīng)腹腔注射皂苷注射液(2mL ip)，隨之每隔12h用藥1次［5］。缺血再灌注組及假手術(shù)組注射相當(dāng)劑量的生理鹽水。

1.2.3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，活體取損傷側(cè)腦皮質(zhì)組織約100mg，TRIZOL試劑提取總RNA。取4μg的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)條件是94℃ 45s，退火溫度見表1所示45s，72℃ 1min，各基因的引物序列、最佳退火溫度及擴(kuò)增產(chǎn)物大小如下表所示，引物由大連寶生物公司合成。PCR產(chǎn)物取20μL用含0.5μg/mL EB的1%瓊脂糖凝膠電泳，BIO-RAD凝膠成像儀紫外模式下分析凝膠圖片。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

組內(nèi)比較采用單因素方差分析；各組間的比較采用t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件選用SPSS 11.5。

2 結(jié)果

2.1 NGF和TrkA在各組中mRNA的表達(dá)變化

2.1.1 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性

RNA樣品1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳條帶，可見28S、18S條帶，說(shuō)明所提取RNA樣品完整，可以用于逆轉(zhuǎn)錄(圖1)。

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的結(jié)果

在各組中均有β-actin、NGF和TrkA mRNA的表達(dá)，得到目的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察到特異性擴(kuò)增條帶，大小分別為227 bp、479bp和824bp，與預(yù)期的片段長(zhǎng)度一致（見圖2~4）。

圖例說(shuō)明：1：DL2000 DNA Marker；2：再灌組2h組；3：再灌組4h組；4：再灌組6h組；5：再灌組12h組；6：再灌組24h組

2.1.3 圖片灰度掃描結(jié)果

對(duì)圖片進(jìn)行灰度掃描。以β-actin灰度值為參照，求得各組的NGF和TrkA與β-actin的相對(duì)比值。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示（見表2）。結(jié)果顯示：再灌注損傷后，海馬組織內(nèi)NGF和TrkA的mRNA表達(dá)均增高，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在三七總皂甙治療組中NGF的mRNA于再灌注2h上升，4h達(dá)高峰，與假手術(shù)組和缺血再灌注組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而缺血再灌注組NGF的mRNA于再灌注6h達(dá)到高峰。TrkA mRNA的表達(dá)在灌注2h也明顯升高，同時(shí)也在4h達(dá)到高峰（P<0.05），與假手術(shù)組和缺血再灌注組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而缺血再灌注組TrkA的mRNA亦于再灌注6h達(dá)到高峰。

3 討論

NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不僅調(diào)節(jié)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元的存活，而且能夠阻止成年神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元的死亡等許多神經(jīng)系統(tǒng)功能。高親和力NGF受體trkA被公認(rèn)為是NGF的功能性受體，是啟動(dòng)傳遞NGF生物效應(yīng)的信息物質(zhì)。當(dāng)NGF與trkA結(jié)合后，受體細(xì)胞外區(qū)構(gòu)象變化，使受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶活性增強(qiáng)。其作用途徑，首先可通過(guò)提高神經(jīng)元表面的NGF受體TrkA的表達(dá)［4］，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生生物效應(yīng)；還可以通過(guò)活化NGF受體TrkA，在細(xì)胞內(nèi)阻斷損傷因子［5］，從而保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷，縮小梗死體積，且促進(jìn)損傷后神經(jīng)組織的修復(fù)，減輕和改善患者癥狀。

三七總皂苷是從我國(guó)名貴中藥三七中提取的有效活性成分，能改善微循環(huán)、抗炎、抑制NO、興奮性氨基酸和脂質(zhì)過(guò)氧化等，可能還與NGF的表達(dá)增加有關(guān)。研究表明［6］：NGF、TrkA對(duì)維持損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和修復(fù)具有重要作用，腦缺血損傷后應(yīng)用外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不僅可減輕神經(jīng)元損傷，而且可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)軸突再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)。

短暫的全腦缺血過(guò)程能引起海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞在缺血后數(shù)天發(fā)生死亡，而頂葉皮層，海馬CA3區(qū)和齒狀回顆粒細(xì)胞(DGCs)等對(duì)這種缺血有一定耐受性。本研究結(jié)果顯示：NGF和TrkA mRNA在假手術(shù)組有一定的表達(dá)，在局灶缺血再關(guān)注后，海馬組織內(nèi)NGF和TrkA mRNA表達(dá)增加。三七總皂甙治療組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)兩項(xiàng)指標(biāo)增加更明顯，表明三七總皂甙治療可以提高大腦海馬內(nèi)源性NGF和TrkA的表達(dá)。本研究說(shuō)明，三七總皂甙可使NGF、TrkA的mRNA表達(dá)上調(diào)，從而促使受損傷海馬組織內(nèi)NGF、TrkA蛋白的表達(dá)，提示三七總皂甙可以減輕缺血后繼發(fā)性損傷的機(jī)制還可能與NGF和TrkA表達(dá)量增加有關(guān)。

綜上所述，三七總皂苷通過(guò)上調(diào)大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)海馬部位NGF和TrkA mRNA含量，從而促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)和對(duì)抗腦缺血后產(chǎn)生的損害因子，避免腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元的死亡和凋亡，從而發(fā)揮其對(duì)腦缺血損傷的治療作用，且在起效時(shí)間和作用持續(xù)時(shí)間上均強(qiáng)于缺血再灌注組。

參考文獻(xiàn)：

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［2］ 劉建輝，冀鳳云，王婷，等. 三七總皂苷對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)， 2002，10(1)：90.

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［4］ 屈澤強(qiáng)，謝智光，王乃平，等.三七總皂苷抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(2)：130-133.

［5］ Ron D and Habener JF. CHOP， a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription［J］. GenesDev，2002，6：439-453.

［6］ Levi-Montalcini R.The nerve growth factor 35 years later［J］.Science，1987， 237： 1154-1162.

（責(zé)任編輯：姜付平）