A型肉毒素對大鼠皮膚中神經(jīng)肽SP、CGRP及創(chuàng)面組織表達TGF-β1和α－SMA的影響

王琳 邰寧正 陳蕊 范志宏

A型肉毒素對大鼠皮膚中神經(jīng)肽SP、CGRP及創(chuàng)面組織表達TGF-β1和α－SMA的影響

王琳 邰寧正 陳蕊 范志宏

目的研究A型肉毒素（BTA）對皮膚神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽SP、CGRP的影響及其對皮膚創(chuàng)傷愈合的意義。方法40只SD大鼠隨機分為C組(空白對照組)和E組(肉毒素注射組)，20只/組。肉毒素A預注射后7 d，在鼠背部建立以4個注射點為中心的創(chuàng)面模型，面積1 cm×1 cm。測量術(shù)后3 d和7 d的創(chuàng)面面積。實時定量PCR（Real-time PCR）檢測BTA注射后第7天（術(shù)前）和創(chuàng)面愈合后（術(shù)后14 d）的皮膚組織中感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）以及創(chuàng)傷愈合中的重要分子TGF-β1和α－SMA的mRNA表達。結(jié)合免疫組化和圖像分析技術(shù)檢測切片中上述4種物質(zhì)陽性染色的積分光密度OD值。結(jié)果①各組創(chuàng)面于術(shù)后14 d基本愈合。與C組相比，E組術(shù)后3 d、7 d的創(chuàng)面面積無差異（P＞0.05）；②E組術(shù)前和術(shù)后14 d的皮膚組織中SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的mRNA表達和OD值較C組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論①局部皮下注射BTA不影響創(chuàng)面愈合的時間和速度；②BTA能減少創(chuàng)面愈合過程中皮膚神經(jīng)末梢對SP、CGRP的釋放和創(chuàng)面愈合過程中TGF-β1和α－SMA的表達。

肉毒素AP物質(zhì)降鈣素基因相關(guān)肽創(chuàng)面愈合瘢痕

感覺神經(jīng)末梢及其釋放的P物質(zhì)（Substance P， SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitionin gene-related peptide，CGRP）具有重要的促創(chuàng)傷愈合作用[1]，能上調(diào)成纖維細胞表達轉(zhuǎn)移生長因子β1（Transforming growth factor beta-1，TGF-β1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth musle actin A，α-SMA），但這種作用的過度持續(xù)將導致瘢痕增生[2-3]。近年來，對肉毒素A（Botulinum toxin type A，BTA）鎮(zhèn)痛機理的深入研究發(fā)現(xiàn)，它可以抑制感覺神經(jīng)末梢釋放SP和CGRP[4]。但BTA是否對創(chuàng)傷愈合過程中神經(jīng)末梢釋放的SP和CGRP具有相似的抑制作用，尚未見報道。

本實驗通過局部皮下注射BTA預先封閉大鼠皮膚內(nèi)的神經(jīng)末梢，建立全層皮膚缺損的創(chuàng)傷模型，觀察創(chuàng)傷愈合后皮膚組織中SP、CGRP和瘢痕增生攣縮中的標志性分子TGF-β1、α－SMA的表達，分析BTA對這些分子表達的影響、原理及意義，探討應用BTA改善創(chuàng)面愈合、防治瘢痕增生攣縮的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與大鼠創(chuàng)傷模型的建立

健康雄性SD大鼠（由上海交通大學醫(yī)學院動物中心提供）40只，300 g左右。隨機分為2組，20只/組。10%硫化鈉背部脫毛。2 d后，稱重，3%戊巴比妥按1 mL/kg腹腔給藥麻醉。于鼠背部描畫出4個1 cm×1 cm的正方形邊界，1－0絲線縫合標記正方形對角線上兩點并于此兩點的中點，即正方形的中心處皮下注射肉毒A。C組，空白對照組；E組，A型肉毒素注射組，2 U/創(chuàng)面（圖1）。7 d后，切除標記范圍內(nèi)的1 cm×1 cm全層皮膚，建立創(chuàng)傷模型。創(chuàng)面止血，凡士林紗布、無菌敷料包扎。

圖1 大鼠背部創(chuàng)傷模型設(shè)計圖

1.2 實時定量PCR（Real-time PCR）

分別于BTA注射后第7天（術(shù)前）和創(chuàng)面愈合后（術(shù)后14 d）取各創(chuàng)面1/2的皮膚組織，real-time PCR檢測SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的mRNA含量。RNA提取試劑盒和Taq酶（RNeasy Mini Kit，Qiagen），RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Sensiscript RT Kit，Applied Biosystems）和逆轉(zhuǎn)錄試劑（SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems）（大連寶生物公司）。ABI PRISM 7900 Real Time PCR測序儀（Applied Biosystems）。實驗步驟及方法見參考文獻[5]。4種物質(zhì)的引物由計算機輔助設(shè)計，由上海生工生物公司合成。各物質(zhì)及內(nèi)參照物GAPDH(甘油醛磷酸脫氫酶)的引物序列如下:

1.3 免疫組化和Axioplan 2 Imaging圖像分析

術(shù)后3 d和7 d，大體觀察創(chuàng)面狀況，透明塑料薄膜覆蓋傷口，勾勒傷口形狀，以Axioplan 2 Imaging圖像分析軟件計算創(chuàng)面面積。術(shù)前和術(shù)后14 d，采集各創(chuàng)面1/2的皮膚組織留做real-time PCR后，4%多聚甲醛灌注2組實驗鼠，10只/組·時間點，切取另1/2的皮膚組織，留送免疫組化（抗體均購自Sigma公司），檢測皮膚中SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的表達。每個指標10張切片/組·時間點，所有切片均在同一放大倍數(shù)（400×）、同一光強度下測量，3個視野/切片，Axioplan 2 Imaging圖像分析軟件測量各指標陽性染色的積分光密度（OD值）。

1.4 統(tǒng)計分析

想客人之所想，急客人之所急，往往是企業(yè)樹立良好形象的關(guān)鍵。恰到好處的個性化服務能使顧客真切感受到酒店的關(guān)懷，體會到酒店以顧客利益為重，這樣友好、周到的酒店形象便可深入人心。

所有數(shù)據(jù)以X±S表示，采用SAS6.12統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 肉毒素A對創(chuàng)面愈合時間和速度的影響

肉毒素A注射后，E組大鼠出現(xiàn)1 d的進食減少，但無行動障礙。創(chuàng)面愈合情況良好，傷后3 d時，創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織鮮紅，分泌物較少；傷后10 d，創(chuàng)面已明顯收縮；傷后14d，創(chuàng)面已基本愈合。E組術(shù)后3 d、7 d的創(chuàng)面面積與C組相比差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 兩組術(shù)后3 d和7 d時創(chuàng)面面積(mm2)的比較

2.2 術(shù)前和術(shù)后14 d時皮膚標本中4種物質(zhì)的mRNA含量

同一時間點下，E組各物質(zhì)的mRNA含量較C組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05（表2）。

表2 皮膚標本組織中4種物質(zhì)的mRNA含量

2.3 各組術(shù)前和術(shù)后14d時皮膚標本中4種物質(zhì)的陽性染色OD值

術(shù)前（BTA注射后7 d）和術(shù)后14 d（創(chuàng)面愈合后）的皮膚切片中，SP和CGRP在大鼠皮膚中的分布基本相似，位于表皮基底細胞層、真皮乳頭層、小血管膜及周圍（圖2、3）。TGF-β1分布廣泛，且在愈后皮膚中的表皮真皮交界處表達較多。術(shù)后14 d的皮膚切片中，可見α-SMA在成纖維細胞胞漿中呈棕黃色陽性染色（圖4、5）。

圖2 術(shù)后14 d，C組皮膚內(nèi)SP的表達及分布(200×)

圖3 術(shù)后14 d，E組皮膚內(nèi)SP的表達及分布(200×)

圖4 術(shù)后14 d，C組皮膚內(nèi)α-SMA的表達及分布(200×)

圖5 術(shù)后14 d，E組皮膚內(nèi)α-SMA的表達及分布(200×)

表3 皮膚標本組織中4種物質(zhì)的陽性染色OD值

3 討論

BTA是一種神經(jīng)毒素。近年來，對BTA鎮(zhèn)痛機理的深入研究發(fā)現(xiàn)：通過胞飲作用以及與突觸前受體序列（Arrays of presynaptic receptors，APR）和突觸囊泡蛋白（Synaptic vesicle protein，SVP）2A、B、C的結(jié)合，BTA還能直接作用于非膽堿能神經(jīng)元和感覺神經(jīng)末梢，緩慢持續(xù)地抑制SP、CGRP釋放[5－7]。SP和CGRP是神經(jīng)肽（Neuropeptide，NP）的代表物質(zhì)，在皮膚中主要分布在感覺神經(jīng)末梢。皮膚創(chuàng)傷時，感覺神經(jīng)末梢受刺激釋放SP和CGRP，啟動神經(jīng)源性炎癥反應，通過與血管內(nèi)皮細胞和免疫細胞表面的NK受體結(jié)合，發(fā)揮擴張血管、誘發(fā)免疫應答活性，促進創(chuàng)傷愈合。二者還能促進FB的生長增殖，上調(diào)TGF-β1mRNA表達，并與TGF-β1等細胞因子協(xié)同作用，促進FB向肌成纖維細胞（Myofibroblast, MFB）分化及α-SMA的表達[8]，促進傷口收縮，而辣椒素預處理的大鼠肉芽組織中SP、CGRP和α-SMA表達均減少，創(chuàng)面延遲愈合[3]。此外，創(chuàng)傷過度愈合所致的瘢痕增生、攣縮、瘢痕瘙癢與二者的持續(xù)過量表達關(guān)系密切[9-10]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在BTA預處理的大鼠創(chuàng)傷模型中，兩組的創(chuàng)面的愈合時間和愈合速度無顯著差異。同一時間點下，兩組SP、CGRP、TGF-β1和α-SMA的mRNA表達和免疫組化OD值有顯著差異，且E組小于C組。說明創(chuàng)傷刺激了上述4種物質(zhì)的分泌和合成，而BTA對此有明顯的抑制作用。與辣椒素對神經(jīng)肽的耗竭或其他化學物質(zhì)毀損神經(jīng)末梢所致的4種物質(zhì)分泌合成不足、肉芽組織發(fā)育不良，創(chuàng)面收縮減慢不同，BTA預處理的大鼠皮膚創(chuàng)面不僅具有正常的愈合進程，并且愈合皮膚中SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的基因含量和蛋白表達顯著減少。這可能是由于創(chuàng)緣皮膚內(nèi)的神經(jīng)末梢中仍殘留少量未被BTA降解的突觸小體相關(guān)蛋白（Synaptosomal associated protein，molecular mass 25 kDa，SNAP-25），或創(chuàng)傷刺激后，感覺神經(jīng)末梢適應性地新合成了少量的SNAP-25，形成突觸融合復合體，“復活”了部分突觸囊泡與神經(jīng)膜的融合，釋放少量SP、CGRP，“部分”啟動了創(chuàng)傷后的神經(jīng)源炎性反應。E組中TGF-β1和α-SMA的表達減少，提示BTA可能對瘢痕的增生攣縮有抑制作用，但是否可以作為臨床治療的有效手段仍需進一步研究。

[1]Roosterman D,Goerger T,Schneiger SW,et al.Neuronal control of skin function:the skin as a neuroimmunoendocrine organ[J]. Physiol Rev,2006,86:1309-1379.

[2]Scott JR,Muangman PR,Tamura RN,et al.Substance P levels and neutral endopeptidase activity in acute burn wounds and hypertrophic scar[J].Plast Reconstr Surg,2005,115:1095-1102.

[3]Hu D,Chen B,Zhu X,et al.Substance P up-regulates the TGF-β1 mRNA expression of human dermal fibroblasts in vitro[J].Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi,2002,18:234-236.

[4]Aoki KR.Review of a proposed mechanism for the antinociceptive action of botulinum toxin type A[J].Neuro Toxicology,2005,26: 785-793.

[5]Meng J,Wang J,Lawrence G,et al.Synaptobrevin I mediates exocytosis of CGRP from sensory neurons and inhibition by botulinum toxins reflects their anti-nociceptive potential[J].J Cell Sci,2007,120:2864-2874.

[6]Lucioni A,Bales GT,Lotan TL.Botulinum toxin type A inhibits sensory neuropeptide release in rat bladder models of acute injury and chronic inflammation[J].BUJ Int,2008,101:366-370.

[7]Wen WD,Yuan F,Wang JL,Botulinum toxin therapy in the ovalbumin-sensitized rat[J].Neuroimmunomodulation,2007,14: 78-83.

[8]Wang LL,Lai XN,Wei L.Effect of substance P and calcitionin gene-related peptide on myofibroblast differentiation in wound healing in rats[J].J Trauma Surg,2004,6:88-90.

[9]Henderson J,Trenghi G,McGrouther DA,et al.The reinnervation pattern of wounds and scars may explain their sensory symptoms[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg,2006,59:942-950.

[10]Zhang HS,Ren HT.Correlation of substance P and mast cell with scarless healing in fetal skin[J].J Clin Reha Tissue Engin Resear, 2007,11:1648-2651.

Effect of Botulinum Toxin Type A on the Expression of Substance P,Calcitionin Gene-Related Peptide,TGF-β1 and α-Smooth Muscle Actin a in Wound Healing in Rats

WANG Lin,TAI Ningzheng,CHEN Rui,FAN Zhihong.
Plastic and Cosmetic Department,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 20001,China. Corresponding author:FAN Zhihong.

ObjectiveTo investigate the effect of botulinum toxin type A on the expression of substance P and calcitionin gene-related peptide in wound healing.MethodsForty rats were randomly divided into Group C(Control)and Group E (Experimental),20 rats in each group.The wound-healing model was established by excised four full-thickness skin (1 cm×1 cm,circled the injection site)in the back of all SD rats 7 days after BTA injection.The area of wound was measured and calculated at the 3rdd and 7thday after skin lesion by computerized image analysis.On 0 and 14 days after operation,the content of substance P,calcitionin gene-related peptide,TGF-β1 and α－SMA were assayed by real-time polymerase chain reaction technique.The immunohistochemical staining and computerized image analysis were used to detect the OD value of positive staining of four substances.ResultsThe wounds in all groups healed at 14 days after operation and the area in Group E had no significant difference with that of Group C at 3 days and 7 days after operation.The positive immuno-staining of SP,CGRP,TGF-β1 and α－SMA in Group E were significantly weaker than those in Group C.ConclusionBotulinum toxin type A can decrease the expression of SP,CGRP,TGF-β1 and α－SMA in wound healing in dose-dependent manner without delaying the healing time.

Botulinum toxin type A;Substance P;Calcitionin gene-related peptide;Wound healing;Scar

R619+.6

A

1673－0364（2009）04－0202－04

2009年4月12日；

2009年5月28日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.006

上海市科委資助項目（074119606）。

200127上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院整形外科。

范志宏。