缺血性腦損傷中ＨＳＰ７２對神經(jīng)元保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

張　芳　劉紅芝　張兆成　宋遠(yuǎn)見

【摘要】 目的 探討缺血性腦損傷中HSP72對大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注對照組、熱休克處理組、HSP72反義寡核苷酸組及溶劑組。采用焦油紫染色、免疫印跡檢測大鼠缺血再灌注后海馬神經(jīng)元損傷和腦組織AKT、Bad(Ser 136)的磷酸化情況。結(jié)果 熱休克處理組與缺血再灌注對照組、HSP72反義寡核苷酸組和溶劑組相比海馬神經(jīng)元損傷減輕，腦組織AKT和Bad(Ser 136)磷酸化升高(P<0．05)。結(jié)論 HSP72可能通過升高腦組織中AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度起到海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】缺血性腦損傷；HSP72；AKT；Bad(Ser 136)

Study on the neuroprotection of HSP72 during brain injury induced by ischemia

ZHANG Fang,LIU Hong-zhi,ZHANG Zhao-cheng,et al.

Basic Medical Science,Xuzhou Medical College,Xuzhou City,Jiangsu 221004,China

【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of neuroprotection of HSP72 during Brain injury induced by ischemia.Methods SD rats were divided randomly into 5 groups:sham-operated;cerebral ischemia and reperfusion;cerebral ischemia and reperfusion+heat shock treatment;cerebral ischemia and reperfusion+antisense oligonucleotides and reperfusion+solvent.Brain injury in hippocampus of rats and change of phosphorylation of AKT and bad(ser 136)were detected by cresly violet-strained or immunoblot assay.Results Comparing with cerebral ischemia and reperfusion group, antisense oligonucleotides and solvent group,the brain injury and phosphorylation of AKT and bad(ser 136) of heat shock treatment team increased significantly.ConclusionHSP72 protected the neurons in hippocampus from ischemia by increasing phosphorylation of AKT and bad(ser 136).

【Key words】Ischemic brain injury; HSP72;AKT;Bad(Ser 128)

熱休克蛋白（HSPs）因具有細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用而成為研究的熱點(diǎn)。高溫能誘導(dǎo)熱休克蛋白合成，HSP72是增強(qiáng)熱耐受力的誘導(dǎo)型 HSPs的一種,但是它對缺血性腦損傷后神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制尚不十分清楚。2008年1月至2008年9月，筆者通過觀察HSP72對大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及AKT和Bad(Ser 136)磷酸化的影響，以探討其對大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物及分組 雄性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，清潔級(jí)。將大鼠隨機(jī)均分為兩組，缺血15 min再灌5 d為甲組，再灌12 h為乙組。各組又分為假手術(shù)組、缺血再灌注對照組、熱休克處理組、HSP72反義寡核苷酸組，各5只。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物模型制備 用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并電凝椎動(dòng)脈^[1-2]。手術(shù)第2天于動(dòng)物清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使全腦缺血15 min，然后不同的時(shí)間再灌注。缺血時(shí)保持其直腸溫度在36．5℃～37．5℃。以缺血?jiǎng)游矬w征表現(xiàn)判斷缺血模型的可靠性。假手術(shù)組的處理同實(shí)驗(yàn)組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。熱休克處理組于缺血前2 h置于42℃溫箱中熱休克預(yù)處理40 min，HSP72反義寡核苷酸組在熱休克預(yù)處理的同時(shí)腹腔注射HSP72反義寡核苷酸0．5 ml（5-TGTTTTCTTGGCCAT-3,濃度200 μmol/L）^[3]。

1．2．2樣品制備和免疫印跡 甲組于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，然后以生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行心室灌注^[1]。取腦組織在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后，于梯度乙醇溶液中脫水并在二甲苯中透明。包蠟后的腦組織進(jìn)行切片(5 μm)，經(jīng)脫蠟、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海馬CA1區(qū)1 mm 內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。乙組于再灌注12 h將大鼠快速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬，置液氮中凍存?zhèn)溆谩Ｒ韵虏僮骶诒≈羞M(jìn)行。從液氮中取出海馬，加1．7 ml勻漿緩沖液，用Teflon勻漿器高速勻漿（10 s×6次），800 g×10 min離心，棄上清液，加入0．6 ml buffer B振蕩搖勻，12 000 g×10 min離心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測蛋白后分裝，置-80℃冰箱待用。按Sambrook等方法，等量蛋白樣品經(jīng)7．5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3% BSA室溫封閉3 h后加入一抗AKT和Bad(Ser 136)，4℃過夜。用洗滌液洗膜3遍，加入二抗羊抗兔IgG-AP（Sigma公司），37℃反應(yīng)2 h，洗膜。以NBT/BCIP顯色，水洗終止反應(yīng)。結(jié)果用圖像處理儀（Gene Company）分析處理。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析(ANOVA)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HSP72能減少海馬神經(jīng)元損傷及腦組織AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度。見表1。

3 討論

研究證實(shí):與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組第5天海馬神經(jīng)元損傷嚴(yán)重；再灌注12 h腦組織中AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度顯著增高(P<0．05)^[1-2]。故本實(shí)驗(yàn)僅取甲組的存活神經(jīng)元數(shù)、存活量表示大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活情況，用乙組的AKT和Bad(Ser 136)數(shù)值表示大鼠AKT和Bad(ser 136)的磷酸化情況。

HSP是生物體細(xì)胞在一系列應(yīng)激因素作用下產(chǎn)生,是具有高度保守性的細(xì)胞保護(hù)性蛋白質(zhì),其中HSP70家族與細(xì)胞保護(hù)之間的關(guān)系最密切,它在機(jī)體細(xì)胞耐受、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、遺傳物質(zhì)保護(hù)、基因調(diào)控、細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起重要作用。HSP70家族主要有誘導(dǎo)型的HSP72和結(jié)構(gòu)型的HSP73兩個(gè)亞型,在應(yīng)激過程中主要為HSP72表達(dá)變化^[4-5]。腦海馬CA1區(qū)是對缺血最為敏感而發(fā)生大量細(xì)胞凋亡的區(qū)域之一^[2],本實(shí)驗(yàn)通過焦油紫染色法檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況證實(shí)了這一點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：熱休克處理組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯少于缺血再灌注對照組、HSP72反義寡核苷酸組，說明HSP72對腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡具有很好的保護(hù)作用。

激活后的Akt能使底物中的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化而起到抗凋亡和保護(hù)細(xì)胞的作用。目前認(rèn)為，磷酸化后的Akt可通過作用于Bad、Caspase 9等底物或下游因子抑制細(xì)胞凋亡^[6-8]。近年來研究表明, Akt活化后能經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活,其重要機(jī)制之一就是通過磷酸化 Bcl-2家族成員Bad實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)生長的作用。Bad是否磷酸化關(guān)系到細(xì)胞的成活和死亡,是神經(jīng)存活因子控制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。Bad的功能受它的Ser-112和Ser-136位點(diǎn)磷酸化所調(diào)節(jié)。磷酸化的Bad能與伴侶蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白相互作用,Bad-14-3-3結(jié)合物可釋放Bcl-2和/或 Bcl-xl,發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)。Akt是強(qiáng)有力的Bad（Ser-136）激酶,活化的 Akt可以使Bad的Ser-136位點(diǎn)磷酸化,有效阻斷 Bad誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡^[9,10]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后15 min時(shí)腦組織中Akt和Bad(Ser 136)的磷酸化程度相對假手術(shù)組明顯降低，30 min時(shí)開始升高，3 h時(shí)達(dá)到最高，而后逐漸降低，到12 h時(shí)回到與假手術(shù)組相近的水平，實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一回落導(dǎo)致了細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷^[2]。為進(jìn)一步探索HSP72對缺血性腦損傷的保護(hù)作用是否與Akt信號(hào)通路有關(guān)，在實(shí)驗(yàn)中筆者使用免疫印跡方法檢測各組大鼠腦海馬組織中Akt和Bad(Ser136)磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)熱休克處理組的磷酸化水平明顯高于其他組，因而推測Akt信號(hào)通路可能介導(dǎo)HSP72對神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:HSP72可以明顯上調(diào)Akt和Bad(Ser136)的磷酸化水平,減少神經(jīng)元凋亡,對腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。關(guān)于HSP72的腦保護(hù)作用的其他可能機(jī)制筆者將做進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 宋遠(yuǎn)見,裴冬生,孫亞峰,等.腦缺血再灌注后依達(dá)拉奉聯(lián)合黃芪對大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制.山東醫(yī)藥,2008,48(22):6-8.

［2］ Wang X T,Pei D S,Xu J,et al.Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by JNK1 and JNK3 on ischemic brain injury.Cell Signal,2007,19(9):1844-1856.

［3］ Nikaido H,Tsunoda H,Nishimura Y,et al.Potential role for heat shock protein 72 in antagonizing cerebral vasospasm after rat subarachnoid hemorrhage. Circulation,2004,110(13):1839-1846.

［4］ 唐忠志,翁少凡,彭森，等.高溫訓(xùn)練對士兵血液及淋巴細(xì)胞 HSP72表達(dá)的影響. 中國急救醫(yī)學(xué),2008,28(8):698-701.

［5］ TavariaM,Gabriele T,Kola I,et al.A hitchhickers guide to the human hsp70 family.Cell Stress Chaperones,1996,1:23-28.

［6］ Xu J,Li C,Yin XH,et al.Additive neuroprotection of GABA A and GABA B receptor agonists in cerebral ischemic injury via PI-3K/Akt pathway inhibiting the ASK1-JNK cascade. Neuropharmacology,2008，54(7):1029-1040.

［7］ Gao X,Zhang H,Takahashi T,et al.The Akt signaling pathway contributes to postconditionings protection against stroke; the protection is associated with the MAPK and PKC pathways.J Neurochem,2008，105(3):943-955.

［8］ Wu DN,Pei DS,Wang Q,et al.Down-regulation of PTEN by sodium orthovanadate inhibits ASK1 activation via PI3-K/Akt during cerebral ischemia in rat hippocampus.Neurosci Lett,2006，404(1-2):98-102.

［9］ 韓彩萍.PI3K/AKT信號(hào)通路與腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2006,33(1):88-91.

［10］ Miao B,Yin XH,Pei DS.Neuroprotective effects of preconditioning ischemia on ischemic brain injury through down-regulating activation of JNK1/2 via N-methyl-D-aspartate receptor-mediated Akt1 activation. J Biol Chem， 2005， 280(23):21693-21699.