鋅誘導對力竭運動大鼠金屬硫蛋白的影響及其對心肌的保護作用

宋　晨　張　鈞

摘要：通過預先用鋅誘導后大鼠做力竭性運動，來觀察鋅誘導金屬硫蛋白（MT）合成對心肌的保護作用及其可能機制。方法：選用健康雄性SD大鼠30只，體重220～250 g，隨機A、B、C分為3組，即：A組為對照組；B組為一次性力竭運動組；C組為鋅+一次性力竭運動組，每組10只。滿8周后，測定其心肌組織中的MT含量、組織中鈣的含量、巰基（-SH）和丙二醛（MDA）含量、以及心肌中的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）和Na+-K+-ATP酶的活性。結果：1) 與對照組相比，力竭運動組大鼠心肌組織中MT的含量較對照組顯著降低（P<0.05）；心肌組織中MDA含量和總鈣量顯著增高（P<0.05）；-SH含量以及GSH-px活性和Na+-K+-ATP酶的活性顯著降低（P<0.05）。2) 與力竭運動組相比；鋅＋力竭運動組大鼠心肌組織中MT含量較力竭運動組顯著增高（P<0.05）；心肌組織中MDA含量和總Ca2+量顯著降低（P<0.05）；-SH含量及GSH-px活性和Na+-K+-ATP酶的活性顯著增高（P<0.05）。結論：預先用鋅誘導可減少力竭運動后心肌組織中MT含量的顯著下降，降低心肌組織脂質(zhì)過氧化水平，提高抗氧化酶的活性，防止鈣超載，對力竭運動后心肌細胞的損傷具有保護作用。MT和金屬鋅密切相關，二者的相互作用可能共同參與保護力竭運動后機體組織的損傷，并促進損傷組織的快速修復。

關鍵詞：金屬硫蛋白； 運動； 鋅；心肌細胞

中圖分類號：G804.21文獻標識碼：A文章編號：1007-3612(2008)02-0196-03

金屬硫蛋白（MT）是一類富含半胱氨酸的低分子量金屬結合蛋白，具有多種生物效應。它可清除氧自由基，尤其是清除超氧自由基和羥自由基，是一種強的內(nèi)源性細胞保護物質(zhì),在保護心血管系統(tǒng)損傷中發(fā)揮著重要作用。金屬硫蛋白可由多種因子誘導產(chǎn)生，其中與鋅密切相關。鋅是機體必需微量元素，具有廣泛的生物效應，兩者相互影響對機體正常的生理功能起著重要的作用。本研究預先用鋅誘導后大鼠做力竭運動，來觀察鋅誘導MT合成對心肌的可能保護作用。

1研究對象與方法

1.1實驗動物、分組選用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只（購自中科院上海實驗動物中心），體重220～250 g，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)籠選用塑料制品，并配有不銹鋼罩，塑料吸水瓶和不銹鋼吸水管，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～24°C，自由飲食、飲水。

1.2研究方法

1.2.1運動安排大鼠購進后，先適應性喂養(yǎng)兩天，稱重后，隨機分為A、B、C、三組，每組10只：A組為安靜對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，不加干預。B組為一次性力竭運動訓練組：常規(guī)飼養(yǎng)，不加干預。大鼠處死前3 d，讓大鼠做適應性游泳運動，游泳池為一150 cm×60 cm×70 cm長方體，水深50 cm，水溫(32±1)℃。每天1次，時間為30 min，滿8周后，大鼠做一次性力竭游泳運動，力竭判斷標準按Thomas文獻報道［1］。C組為鋅＋一次性力竭運動組：飼養(yǎng)與

運動條件同B組，只是在大鼠處死前一天，大鼠腹腔注射ZnSO4（0.2 mmol/L，1.5 mL/kg），24 h后，讓大鼠做一次性力竭運動。力竭判斷標準同C組。

1.2.2取材制備所有運動組大鼠，運動后即刻大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血，肝素抗凝。另取心室肌組織，去血污，置于液氮保存以備待用。

1.2.3測試方法

1.2.3.1紅細胞溶血素的制備正常大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血，肝素抗凝。取4 mL血樣，加2倍血樣體積的1.15%氯化鉀溶液洗3次，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。洗凈的紅細胞加20 mL 0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL緩沖液，室溫放置10 min，4 000 r/min離心20 min，上清液保存于4℃冰箱中備用。

1.2.3.2MT的提取及測定用鎘飽和法［4，5］略加改進測定MT。將取出的心室肌放入小平皿中，用生理鹽水洗凈、吸干水份后稱取1.00 g。加4 mL 0.05 mol/L Ph8.0 Tris-HCL緩沖液，充分勻漿后，以20 000 r/min離心60 min。取上清液0.2 mL，加1.0 mL0.089 mmol/L鎘溶液、0.5 mol/L Ph8.0 Tris-HCL緩沖液2.2 mL，混勻后靜置10 min，再加0.2 mL紅細胞溶血素，混勻后置100℃水浴3 min，然后以3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀物。再加0.2 mL紅細胞溶血素，混勻后置100℃水浴3 min，然后以3000 r/min離心10 min，重復兩次加紅細胞溶血素，上清移入帶塞試管中4℃保存待測。用火焰原子吸收分光光度計測定上清夜中鎘的含量，再按1分子MT鍵合6分子鎘換算成MT的含量。用考馬斯亮藍法測定樣本蛋白含量。

1.2.3.3大鼠心肌中Ca2+含量的測定另取心室肌組織，用預冷生理鹽水制備勻漿，4層紗布過濾后取勻漿液，離心取上清液，用火焰原子吸收分光光度計測定上清夜中Ca2+的含量。蛋白定量方法同上。

1.2.3.4其他用MDA、-SH、GSH-px和Na+-K+-ATP酶試劑盒分別測定心肌組織中MDA和-SH含量、GSH-px和Na+-K+-ATP酶的活性，以上試劑盒均有南京建成生物公司提供。嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

1.2.4試劑與儀器 試劑鎘標準液（［GBW（E）080119］由國家標準物質(zhì)研究中心提供）；ZnSO4（去離子水配制）；0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL緩沖液（0.1 mol/L Tris溶液+0.1 mol/L鹽酸溶葉29.2 mL+水至100 mL）。儀器：超速低溫離心機（HITACHI55P-72型）；SAS/727原子吸收分光光度計，721-分光光度計。

1.2.5統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±S）表示，用t檢驗進行顯著性分析。

2結果

2.1鋅誘導對力竭運動后大鼠心肌組織中MDA、-SH、GSH-px含量影響

由表1可知，一次性力竭運動組大鼠心肌組織中MDA含量較安靜對照組顯著增加，而鋅＋一次性力竭運動組大鼠心肌組織中MDA則較力竭運動組有顯著性降低（P<0.05）；一次性力竭運動組大鼠心肌組織-SH含量和GSH-px含量較安靜對照組有顯著性降低，而鋅＋一次性力竭運動組大鼠較一次性力竭運動組大鼠有顯著性提高（P<0．05）；說明一次性力竭運動可造成心肌組織產(chǎn)生大量的自由基，造成心肌組織膜脂質(zhì)過氧化水平增高，細胞受到損傷。用鋅預先誘導后，可改善力竭運動心肌組織中抗氧化酶的活性，增強心肌組織抗氧化的能力，對心肌細胞的損傷有一定的保護作用。

2.2鋅誘導對力竭運動后大鼠心肌組織中Ca2+含量、Na+-K+-ATP酶活性的影響

由表2可知，一次性力竭運動組大鼠心肌組織中Ca2+濃度較安靜對照組大鼠顯著性增加（P<0.05），而鋅＋一次性力竭運動組大鼠心肌組織中Ca2+濃度則較一次性力竭運動組大鼠有顯著性降低（P<0.05）；一次性力竭運動組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶的活性較安靜對照組大鼠顯著性降低（P<0.05），而鋅＋一次性力竭運動組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶的活性較一次性力竭運動組大鼠顯著性提高（P<0.05）；說明一次性力竭運動可造成心肌細胞內(nèi)鈣超載和Na+-K+-ATP酶的活性降低，造成心肌細胞膜功能障礙，使心肌細胞受損。預先用鋅誘導可在一定程度上緩解力竭運動造成的心肌損傷。

2.3鋅誘導對力竭運動后大鼠心肌組織中MT含量的影響

由表3可知，一次性力竭運動組大鼠心肌組織中MT的含量較安靜對照組大鼠顯著性降低（P<0.05），鋅＋一次性力竭運動組大鼠較力竭運動組大鼠顯著性提高（P<0.05）；說明一次性力竭運動可造成心肌組織中MT含量的降低，而用鋅預先誘導后的大鼠可使心肌組織中MT維持在一定的水平，對力竭運動造成的心肌損傷有一定保護作用。

3討論

本實驗結果顯示，力竭運動后大鼠心肌組織中MT的含量降低。Shinogi等報道，沒經(jīng)訓練的大鼠劇烈跑步運動后肝臟MT出現(xiàn)升高，在6 h時達到高峰，然后逐漸下［4］。運動恢復期后肝臟MT的大量升高，可能與自由基的清除有關。艾華等實驗結果顯示：大鼠急性游泳運動后即刻，肝臟MT含量已經(jīng)明顯升高，游后6 h含量大最高，隨后下降。這表明急性運動可誘導MT的大量合成［5］。這與Shinogi實驗報道一致。另外，艾華等實驗也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)游泳訓練的大鼠力竭運動后，骨骼肌和肝臟MT的高峰值均在3 h處，表明運動訓練可使MT對運動應激的誘導合成加快［6］。運動訓練促進機體MT基礎水平增高和加快MT對運動應激的誘導合成，均有利于清除運動中產(chǎn)生的自由基。然而李昭波實驗發(fā)現(xiàn)急性運動24 h后肝臟、心臟等組織中的MT含量普遍升高［7］。而本實驗結果與上述實驗結果不一致，可能和運動方式、運動時間、取樣時間和取樣組織不同有關。力竭運動造成心肌組織MT含量下降的原因可能是由于隨著運動的時間延長，自由基產(chǎn)生的量超過MT合成的量，MT在抗氧化的同時本身也被消耗，致使MT的含量降低。本實驗發(fā)現(xiàn)，在力竭運動前補充Zn2+可使力竭運動后心肌組織中GSH-px的活性顯著增高、Ca2+濃度顯著降低、MDA的含量顯著降低，-SH含量和Na+-K+-ATP酶活性升高，MT含量顯著增加。說明用Zn2+預先誘導可緩解力竭運動造成的心肌組織的損傷，促進機體向良性趨勢發(fā)展。其機制可能與鋅預先誘導MT的合成增加有關。

鋅是機體必需微量元素，具有廣泛的生物效應。MT中含有7個鋅離子，鋅離子的缺乏會導致機體MT合成的障礙。肝細胞中的鋅離子可以調(diào)節(jié)肝臟MT的基因表達，兩者呈正相關系。Zn2+是MT合成的強誘導劑，可促進心肌成纖維細胞的合成［8］。在力竭運動前用Zn2+預先誘導心肌組織中MT合成增加，在力竭運動時MT與氧自由基作用，當已結合Zn的MT巰基受到氧化時，Zn2+就從MT中釋放出來，發(fā)揮修復組織和抗炎作用，在一定程度上減緩了力竭運動造成的心肌細胞損傷。MT也為一些含鋅酶提供鋅，鋅離子是自由基清除劑，通過參與抗氧化系統(tǒng)的一些酶發(fā)揮作用。從而維持抗氧化酶的活性，減少心肌組織的損傷。鋅離子的含量下降將嚴重影響這些酶的活性，降低自由基的清除能力。最近的研究顯示，鋅的抗氧化作用是通過其誘導的MT合成增加來實現(xiàn)的，鋅對損傷細胞的保護作用也與MT合成增加有關［9］。推測MT可能參與心肌損傷狀態(tài)下心肌細胞的保護作用。其保護機制可能是通過減少脂質(zhì)過氧化，促進酶活力的升高，減少自由基對細胞膜的損傷，減輕因酶活力下降和膜損傷引起的細胞通透性升高，改善細胞內(nèi)外的離子紊亂，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外鈣的的穩(wěn)態(tài)，維持心肌的正常功能［10］。柯琴梅等［11］實驗結果表明，大鼠腹腔注射ZnSO4 24 h后心肌中MT有較高的表達，與對照組相比，Zn2+誘導組心臟對缺血/再灌注（I/R）損傷的抵抗也增強，表現(xiàn)心肌細胞膜損傷減輕（表現(xiàn)為LDH及CK漏出量減少），心肌超微結構損傷減輕，抑制了MDA的產(chǎn)生（清除自由基），心肌代謝改善（表現(xiàn)為ATP耗竭減少），增強了心肌功能（可能與抑制Ca2+內(nèi)流）有關［12］。MT具有清除羥自由基、穩(wěn)定細胞膜、抑制細胞鈣超載及促進抗氧化酶的活力升高等生物學作用。MT這些作用是MT抗心肌缺血再灌注損傷損傷的主要原因。

金慧英等實驗證明MT可通過保護抗氧化酶（SOD、GSH-px）活力，來減輕缺氧復氧所致的心肌損傷［10］。所以外源性補充MT或Zn2+預先誘導合成MT增加可減輕缺血缺氧造成心肌損傷，能有效地對抗力竭運動狀態(tài)下心肌損傷。葛淑君的研究顯示：MT能有效的拮抗氧自由基對線粒體的損傷，減輕其對Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性和Ca2+的轉(zhuǎn)運能力的抑制作用［13］。李兆萍等的實驗發(fā)現(xiàn)無論是外源性或內(nèi)源性MT都能顯著地抑制鈣反常時心肌鈣含量的增加，由于Cd、Zn等離子是鈣通道的競爭抑制劑和Na+-Ca2+交換抑制劑，MT可結合這些金屬離子而阻止鈣內(nèi)流，避免細胞鈣超負荷的發(fā)生，這可能是MT具有細胞保護作用又一機制［14］。

本實驗結果顯示：力竭運動組大鼠MT的含量降低，可能與鋅含量不足有關。鋅誘導組大鼠心肌組織中MT的含量顯著增高，可能與鋅預先誘導增加MT合成有關。在運動中，貯存鋅離子的MT對鋅需求量增加，鋅量充足增強了MT的基因表達信號，使MT的合成增加。實驗發(fā)現(xiàn)Zn2+誘導MT的表達減輕大鼠心肌I/R損傷，其機制涉及MAPK途徑［15］。

參考文獻：

［1］ Thomas DP，Maarshall KI. Effects of repeated exhaustive on myocardial subcellar membrance structures［J］. Int Sports Med，1988；9（4）：257-260.

［2］ Onosaka S, Cherian MG. Comparison of metallothionein determination by polarographic and cadmium-saturation methods［J］. Toxicol Appl Pharmacol，1982，63(2)：270-274.

［3］ 戴建國，陳景衡，楊森，等.鎘飽和法測定小白鼠肝中金屬硫蛋白［J］. 南京醫(yī)科大學學報，1995，15（3）：722-724.

［4］ Shinogi M，Sakaridani M，Yokoyama I. Metallothionein induction in rat liver by dietary restriction or exercise and reduction of exercise-induced hepatic lipid peroxidation［J］. Biol Pharm Bull，1999，22：132-136.

［5］ 艾華，周先碗，茹炳根，等.不同鋅營養(yǎng)對急性運動誘導的大鼠金屬硫蛋白合成和金屬離子代謝的影響［J］.體育科學，2000，20（3）：46-50.

［6］ 艾華，周先碗，茹炳根，等.運動訓練對大鼠骨骼肌和肝臟金屬硫蛋白誘導和金屬離子代謝的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2000，19（2）：138-141.

［7］ 李昭波，高云秋，李淑敏，等.耐力訓練和急性力竭運動對大鼠組織金屬硫蛋白含量的不同影響［J］.中國應用生理學雜志，1997，13（1）：16-17.

［8］ 高霖，王冬艷，李揚，等.大鼠心肌成纖維細胞合成金屬硫蛋白［J］.北京大學學報（醫(yī)學版），2003，35（1）：41-44.

［9］ Jourdan I，Emonet Piccardi N，Didier C，et al.Effects of cadmium and zinc on solar-stimnlated light-irradiated cells：potential role of zinc-metallothionein in zinc-induced genoprotection［J］.Arch Biochem Biophys，2002，405：170-177.

［10］ 金慧英，郁興明，李法卿，等.金屬硫蛋白對缺氧/復氧心肌細胞保護作用［J］.中國應用生理學雜志，2001，17（2）：173-197.

［11］ 柯琴梅，馮義柏，洪梅，等.Zn2+誘導金屬硫蛋白表達對離體大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用［J］.中華心血病雜志，2003，31（3）：179.

［12］ 陳魁，張鈞華，劉秀華，等.誘導金屬硫蛋白合成增強大鼠對心臟缺血再灌注損傷的抵抗［J］.中國介入心臟病學雜志，1997，5（4）：177-179.

［13］ 葛淑君，唐朝樞，龐永政，等.金屬硫蛋白對大鼠肝臟線粒體氧自由基損傷的保護作用［J］.北京醫(yī)科大學學報，1996，28(6):413-415.

［14］ 李兆萍，佟利家，蘇靜怡，等.金屬硫蛋白對離體大鼠心臟缺鈣-復鈣損傷的防治作用［J］.基礎醫(yī)學與臨床，1991，11(3):174-176.

［15］ 柯琴梅，馮義柏，成蓓，等. Zn2+誘導金屬硫蛋白表達對大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用［J］.中國藥理學通報，2003，19（11）：1274-1276.

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