堿性蛋白酶交聯(lián)聚集體的制備及其催化性能研究

區(qū)曉陽, 曾英杰, 彭 飛, 倪子富, 熊 雋, 宗敏華, 婁文勇,2,*

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院, 廣東 廣州 510640；2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院 生物活性分子開發(fā)與應用創(chuàng)新中心, 廣東 東莞 221116)

堿性蛋白酶作為一種重要的生物催化劑，屬于絲氨酸內(nèi)肽酶，是一類最適pH值為堿性的蛋白酶。堿性蛋白酶具有催化水解蛋白質(zhì)的氨基酸酰胺鍵、酯鍵，并具有轉(zhuǎn)酯和轉(zhuǎn)肽的能力[1]，能將一些蛋白質(zhì)水解成多肽或氨基酸。堿性蛋白酶主要來源于細菌、酵母菌等微生物，具有產(chǎn)量大且蛋白分離純化方便等優(yōu)點，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、釀造、絲綢等行業(yè)[2-4]。

游離堿性蛋白酶存在穩(wěn)定性差、不可回收、產(chǎn)品分離困難等缺點，阻礙了其在工業(yè)上的應用，而酶的固定化技術可以克服這些障礙[5-7]。在固體載體上固定酶會導致非催化載體占據(jù)大量空間(約占總質(zhì)量的90%～99%)，從而降低體積活性、時空產(chǎn)率和催化劑生產(chǎn)率[8]；此外，載體通常比較昂貴，且需要對惰性基質(zhì)進行化學修飾后才能實現(xiàn)與酶的共價偶聯(lián)。交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)是一種無載體固定化技術，通過對酶進行沉淀和加入交聯(lián)劑(如戊二醛等)后，戊二醛的兩個醛基分別與酶分子表面的氨基形成希夫氏堿反應，中間以5個碳原子連接在一起[9]。與有固體載體結(jié)合的固定化技術相比，CLEAs具有更突出的優(yōu)勢，催化劑具有高體積活性，這是因為避免了引入惰性載體而造成酶活性降低[10]。交聯(lián)酶制備步驟簡單(沉淀和化學交聯(lián))[11-12]，出色的酶活回收率[13-14]，無需高純度酶[15]，并且所得到的CLEAs對高溫、有機溶劑和自保護水解造成的酶失活有很好的抵抗作用[16-18]，從而表現(xiàn)出很高的存儲穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，使CLEAs得到廣泛應用。此外，CLEAs負載酶量高，酶活性損失小，并能有效避免固體載體的引入造成酶失活[15]。聚集體制備成大分子的結(jié)構(gòu)會影響酶與底物分子的接觸，從而影響其催化活性，并且不同來源的酶對于制備CLEAs條件呈現(xiàn)較大的差異，這可能是其不具有普適性的原因，所以需要對制備條件(如沉淀劑的類型、濃度、交聯(lián)時間等)進行系統(tǒng)優(yōu)化，以期獲取具有最高催化活性的CLEAs。

本研究擬對堿性蛋白酶進行沉淀，并加入交聯(lián)劑進行交聯(lián)，制備高效的堿性蛋白CLEAs，并對影響制備過程的因素進行系統(tǒng)研究；為了防止酶在沉淀過程中變性，利用糖作為穩(wěn)定劑，輔助制備堿性蛋白酶CLEAs[19]，以期獲取更高的酶活回收率；研究堿性蛋白酶CLEAs水解催化酪蛋白的酶學性質(zhì)，并與游離堿性蛋白酶的催化性質(zhì)進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶(諾維信37071，180 U/mL)，購于諾維信公司(丹麥)；酪蛋白和戊二醛，購于Sigma公司。其他所有化學品純度均為分析純，并購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1堿性蛋白酶CLEAs的制備

向0.4 mL游離堿性蛋白酶中滴加一定量的沉淀劑(8種)，將混合物在25 ℃下用磁力攪拌器攪拌5～30 min，直到堿性蛋白酶完全沉淀。將一定量的交聯(lián)劑緩慢添加到混合物中，并在25 ℃下繼續(xù)攪拌一定時間，然后將懸浮液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，去上清液。得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，pH值7.5)清洗顆粒3次，再次離心得到沉淀并進行冷凍干燥處理，于4 ℃冰箱冷藏備用。

在沉淀過程中，使用糖來保護酶免受沉淀劑引起酶的過度脫水。40 mg的糖(包括葡萄糖、蔗糖、D-葡萄糖醇、半乳糖、三氯蔗糖和海藻糖)與100 μL游離酶混合后，在25 ℃、200 r/min下添加900 μL沉淀劑(叔丁醇、飽和銨或乙醇等)，繼續(xù)溫浴30 min。

1.2.2酶活性和蛋白質(zhì)濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度根據(jù)Lowry方法測定，并使用牛血清白蛋白為標準品[20]。以酪蛋白為底物，測定了游離酶和固定化堿性蛋白酶的活性。用紫外分光光度計測定280 nm下酪氨酸的釋放量。一單位蛋白酶相當于釋放1 μg酪氨酸/(mL·min)所需的酶量，固定化酶酶活回收率計算方法見式(1)。

(1)

1.2.3游離酶及其CLEAs的特性分析實驗

以酪蛋白為模型底物，經(jīng)堿性蛋白酶水解成為酪氨酸。研究游離酶和CLEAs的酶學性質(zhì)，包括酶的最適溫度和pH值及其穩(wěn)定性，酶的動力學參數(shù)和重復使用穩(wěn)定性。

1.2.3.1 最適溫度和pH值的確定

將40 mg酪蛋白溶解于3.6 mL 200 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.8)，并加入0.4 mL游離堿性蛋白酶或CLEAs，在不同溫度(50～75 ℃)下測定游離堿性蛋白酶和CLEAs的最佳反應溫度。在60 ℃(游離酶)和65 ℃(CLEAs)條件下，將酶加入不同pH值(7.0～9.0)的底物溶液中，分別測定最佳反應pH值。

1.2.3.2 酶的動力學參數(shù)測定

在優(yōu)化的反應條件下，將具有相同酶活單位的游離酶和堿性蛋白酶CLEAs分別加入不同質(zhì)量濃度的酪蛋白(1～11 mg/mL)中，測定酶對底物的親和力(Km)和酶最大反應速度(Vmax)，并根據(jù)Hanes-Woolf圖計算表觀Km和Vmax值。

1.2.3.3 酶的穩(wěn)定性測定

熱穩(wěn)定性測定：在不同溫度(50～70 ℃)下，將含有4.5 U/mL CLEAs或游離酶和10 mg/mL酪蛋白的4 mL磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，游離酶pH值為7.5，CLEAs pH值為8.0)于磁力攪拌器中溫浴攪拌反應4 h，測定樣品中的剩余酶活性。

酸堿穩(wěn)定測定：向4 mL不同pH值的磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L)中加入含有10 mg/mL酪蛋白和4.5 U/mL的CLEAs或游離酶，混合液在25 ℃攪拌反應4 h，按1.2.2方法測定酶樣品的剩余酶活性。

1.2.3.4 酶的重復使用穩(wěn)定性測定

將含有60 mg/mL酪蛋白的磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，pH值8.0)放置于65 ℃下進行催化反應，重復8批次(每批次反應1 h)。在各批次中，通過離心(10 000 r/min,25 ℃)回收CLEAs，并使用磷酸鹽緩沖液(200 mmol/L，pH值8.0)洗滌3次。將回收的CLEAs溶解在新的反應介質(zhì)中，并將第一批CLEAs的相對酶活性定義為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性蛋白酶CLEAs的制備及電鏡分析結(jié)果

2.1.1影響堿性蛋白酶CLEAs制備的因素分析

2.1.1.1 沉淀劑種類對堿性蛋白酶CLEAs制備的影響

CLEAs的制備包括聚集和交聯(lián)兩個步驟。在蛋白質(zhì)水溶液中加入鹽、有機溶劑、非離子聚合物或酸引起的聚集是蛋白質(zhì)沉淀的常用方法。本研究采用乙腈、叔丁醇、乙醇、飽和硫酸銨、丙酮、甲醇、異丙醇和聚乙二醇(PEG)作為沉淀劑來制備CLEAs，并測定其酶活回收率。沉淀劑對堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率的影響如圖1?？偟膩碚f，隨著沉淀劑濃度的增加，酶活回收率增加。與甲醇、乙醇等沉淀劑相比，以含有90%叔丁醇的溶液作為沉淀劑，可獲得堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率的最大值，達到91.6%。這是因為甲醇、乙醇等沉淀劑的極性強，剝奪了蛋白質(zhì)表面的水化層，改變了酶的空間結(jié)構(gòu)，使酶失活。沉淀條件的不同，制備得到的CLEAs的催化產(chǎn)率會有明顯的差異[11，21]。

圖1 不同沉淀劑對酶活回收率的影響Fig.1 Effect of different precipitants on enzyme activity recovery

2.1.1.2 糖作為沉淀輔助物對堿性蛋白酶CLEAs制備的影響

有研究表明，用糖作為輔助物能有效減少酶在沉淀過程中的活性損失[17,22]。在我們的研究工作中，多種糖已被用來保護酶因沉淀劑造成的過度脫水。以乙醇為沉淀劑時，酶活回收率較低，但糖加入對酶有一定的保護作用，可在一定程度上提高酶活回收率，見表1。與乙醇相比，以叔丁醇或飽和硫酸銨為沉淀劑時，糖輔助沉淀沒有明顯提高酶活性，可能是叔丁醇或飽和銨對酶活性損失影響較小。

表1 糖作為沉淀輔助物對聚集體重新溶解后

2.1.1.3 沉淀時間、交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)時間對堿性蛋白酶CLEAs制備的影響

圖2 多種固定化因素對酶活回收率的影響Fig.2 Effects of several immobilization factors on enzyme activity recovery of CLEAs

為了獲得高效的堿性蛋白酶CLEAs，研究固定化過程中的關鍵參數(shù)(如沉淀時間、交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)時間等)對酶活回收率的影響是非常重要的，實驗結(jié)果見圖2。圖2(a)中，CLEAs酶活回收率隨著沉淀時間的增加而增加，直至15 min，隨后繼續(xù)增加沉淀時間會使酶活回收率下降，這可能是由于酶在相對較長的沉淀時間(超過15 min)內(nèi)部分失活所致。因此，將制備堿性蛋白酶CLEAs的最佳沉淀時間確定為15 min。

交聯(lián)劑通常在制備固定化酶的過程中起重要作用[23]。戊二醛被用作固定多種酶的理想交聯(lián)劑[24]，因此本研究利用戊二醛作為交聯(lián)劑來固定堿性蛋白酶以制備CLEAs。圖2(b)中，在較低的戊二醛濃度下，酶活回收率相當?shù)停@是因為堿性蛋白酶交聯(lián)體的形成量少；但隨著戊二醛濃度逐漸增加到33 mmol/L時，CLEAs的酶活回收率不斷增加；戊二醛濃度進一步升高(超過33 mmol/L)，酶活回收率下降，這可能是由于過量的戊二醛導致酶部分失活。所以，將制備堿性蛋白酶CLEAs的最佳戊二醛濃度確定為33 mmol/L。戊二醛對堿性蛋白酶的影響趨勢與常見的實驗結(jié)果[25]大不相同，這表明了交聯(lián)時間過長會破壞酶的柔韌性，從而使酶活回收率降低。

圖2(c)表明，酶活回收率隨交聯(lián)時間的增加而顯著增加，直至6 h，繼續(xù)延長交聯(lián)時間則會使酶活回收率降低。這可能是由于在較長的交聯(lián)時間(6 h以上)內(nèi)，酶的部分失活所致。顯然，堿性蛋白酶交聯(lián)體制備的最佳交聯(lián)時間為6 h。

對堿性蛋白酶制備過程中的影響因素分析表明，以體積分數(shù)為90%的叔丁醇作為沉淀劑，沉淀時間為15 min，交聯(lián)劑濃度為33 mmol/L，交聯(lián)時間為6 h時，堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率達最大值，為22.6%。

2.1.2電鏡分析結(jié)果

CLEAs是一種多孔結(jié)構(gòu)聚合物，所制備的交聯(lián)體結(jié)構(gòu)直接影響到酶的催化活性，如交聯(lián)體的孔道直徑會影響到酶與底物的接觸面積和底物與產(chǎn)物進出孔道的快慢。為了更直接觀察所制備的CLEAs形態(tài)特征，使用電子掃描電鏡(SEM)對所制備的CLEAs表面特征進行觀察(圖3)。CLEAs表面層次分明，皺褶片狀多，并有顆粒凸起，有許多大小不一的孔道，孔道直徑介于1～2 μm，表明所制備的CLEAs表面積大，有利于酶與底物的接觸。

圖3 CLEAs的SEM圖Fig.3 SEM images of CLEAs

2.2 游離酶及其CLEAs的特性分析結(jié)果

2.2.1酶的最適反應溫度和pH值

酶的催化活性與反應溫度和pH值密切相關，過高或過低都會影響酶的催化效率，因此，探索酶的最適反應溫度和pH值對更好發(fā)揮堿性蛋白酶CLEAs的催化性能及其應用具有重要意義。反應溫度和pH值對堿性蛋白酶CLEAs活性的影響見圖4。游離堿性蛋白酶的最適溫度為60 ℃，堿性蛋白酶CLEAs則為65 ℃(圖4(a))，這可能是由于戊二醛引起了蛋白質(zhì)間共價鍵的形成，增加了酶構(gòu)象的剛性，進而防止酶因熱交換而引起扭曲或破壞[26-27]。

pH值也是影響酶活性的主要參數(shù)之一。酶的固定化通常會導致酶的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導致最優(yōu)pH值的變化。pH值對游離酶和CLEAs活性的影響見圖4(b)。游離酶的最適pH值為7.5，交聯(lián)后的堿性蛋白酶CLEAs則為8.0。pH值向堿性方向轉(zhuǎn)移是由于偶聯(lián)劑和酶之間的二次相互作用造成的。最適pH值的變化取決于酶和(或)基質(zhì)的電荷，而戊二醛與酶偶聯(lián)會將酶表面所有可用的氨基連接起來，因此酶表面的酸性基團會使酶蛋白帶負電荷，最終將最佳pH值向堿性方向移動。

游離酶和CLEAs最高的酶活性定義為100%。圖4 反應溫度和pH值對游離酶與堿性蛋白酶CLEAs活性的影響Fig.4 Influences of various temperature and pH value on activity of free enzyme and alkaline protease CLEAs

2.2.2酶動力學研究結(jié)果

通過測定不同濃度酪蛋白在各最佳反應條件下(游離酶pH值7.5, 60 ℃；CLEAs pH值8.0, 65 ℃)的初始反應速率，比較了游離酶和堿性蛋白酶CLEAs的表觀動力學參數(shù)，見表2。CLEAs的Km值(2.3 mg/mL)低于游離酶(3.6 mg/mL)，說明CLEAs對底物的親和力增強。CLEAs的Vmax為9.8 mg/(mL·min)，低于游離酶的13.3 mg/(mL·min)。酶通過固定化后會造成其構(gòu)象發(fā)生變化，使酶的活性位點更適合與底物結(jié)合[28]。CLEAs的催化效率(Vmax/Km)高于游離酶(3.7 min-1)，說明CLEAs具有更高的催化效率。游離酶的活性位點具有不同的走向，但經(jīng)過交聯(lián)固定化后，酶的活性位點排列有序，更容易與底物結(jié)合，效率更高。

2.2.3酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性分析為了更好地了解固定化堿性蛋白酶CLEAs的特性，研究其在不同溫度和pH值下的穩(wěn)定性。圖5(a)是CLEAs和游離酶在不同溫度(50～70 ℃)下的穩(wěn)定性情況。結(jié)果表明，CLEAs的耐熱性強于游離酶。由于游離酶穩(wěn)定性差，部分酶在高溫下溫浴4 h后迅速失活。在相對較高的溫度(70 ℃)下，固定化堿性蛋白酶CLEAs的初始酶活性至少保留了70.2%，而游離酶的相對活性僅為41.1%左右。結(jié)果表明，CLEAs具有較高的耐熱性，這可能與CLEAs中的共價鍵有關。

圖5 CLEAs和游離酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性Fig.5 Stabilities of CLEAs and free enzyme under different buffer pH value and temperatures

酶制劑Km/(mg·mL-1)Vmax/(mg·(mL·min)-1)Vmax/Km/min-1游離酶a3.613.33.7CLEAsb2.39.84.3

a:最優(yōu)反應條件為pH值7.5，60 ℃；b: 最優(yōu)反應條件為pH值8.0, 65 ℃。

圖5(b)表明，堿性蛋白酶CLEAs在pH值為7.0～9.0時，比游離酶更穩(wěn)定。在所測定的pH值范圍中，CLEAs的活性都要高于游離酶，而且，pH值越大，CLEAs的穩(wěn)定性比游離酶越明顯。CLEAs的酸堿穩(wěn)定性有所提高，可能是由于酶聚集體之間的共價交聯(lián)造成的[29]。

2.2.4固定化酶CLEAs的重復使用穩(wěn)定性分析

堿性蛋白酶CLEAs的重復使用穩(wěn)定性是衡量固定化酶優(yōu)劣的關鍵因素,因此生物催化劑的重復使用性能是固定化酶的一個重要指標[30]。以生物催化水解酪蛋白為模型反應，研究了堿性蛋白CLEAs的重復使用實驗，結(jié)果見圖6。圖6表明，在磷酸鹽緩沖液中重復使用5批次和8批次后，堿性蛋白酶CLEAs的剩余酶活性分別保持在82.5%和56.5%以上。由于堿性蛋白酶CLEAs具有易分離、穩(wěn)定性好、可重復利用等特點，在生物水解工業(yè)上將具有更大應用潛力。

圖6 堿性蛋白酶CLEAs水解酪蛋白的重復使用穩(wěn)定性Fig.6 Reuse stability of alkaline protease CLEAs for enzymatic hydrolysis of casein

3 結(jié) 論

通過對堿性蛋白酶固定化條件的優(yōu)化，得到最佳沉淀劑為體積分數(shù)為90%的叔丁醇，最佳沉淀時間為15 min，最佳交聯(lián)劑濃度為33 mmol/L，最佳交聯(lián)時間為6 h，最大堿性蛋白酶CLEAs的酶活回收率為22.6%。下一步實驗可以利用其他固定化方法(如磁性纖維納米晶)對堿性蛋白酶進行固定化，進一步提高堿性蛋白酶酶活回收率。雖然實驗過程中酶活回收率較低，但未固定上的堿性蛋白酶能用其他試劑(如飽和硫酸銨)沉淀析出，回收后可繼續(xù)重復利用，減少酶的浪費。堿性蛋白酶CLEAs的催化性能(如最適催化溫度和pH值)得到一定程度的提高，最適催化溫度由60 ℃提高65 ℃，最適反應pH值也由7.5提高到8.0。不但如此，堿性蛋白酶CLEAs的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性也明顯優(yōu)于游離酶，且CLEAs的Km值(2.3 mg/mL)低于游離酶(3.6 mg/mL)，這表明CLEAs對酪蛋白具有更高的結(jié)合能力，所制備的固定化酶更符合工業(yè)用酶的苛刻要求。此外，堿性蛋白酶的CLEAs具有良好的重復使用穩(wěn)定性，重復利用5和8批次后，CLEAs的剩余酶活性還能保持82.5%和56.5%以上。所制備的堿性蛋白酶CLEAs在食品、醫(yī)藥、釀造等行業(yè)的具體應用有待進一步研究，但其簡單的制備和回收步驟，優(yōu)異的催化性能和穩(wěn)定的操作性都表明，堿性蛋白酶CLEAs的優(yōu)越性要高于游離酶，這將會使其在生物催化工業(yè)上具有更大的應用潛力。