宮廷奶酪中優(yōu)良乳酸菌菌株的分離與鑒定

吳鳳玉， 鄭 喆， 李 柳， 吳夢(mèng)盈， 楊昊寰， 楊貞耐

(北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心/食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心， 北京 100048)

宮廷奶酪，也稱(chēng)為米奶酒或扣碗酪，是我國(guó)北方少數(shù)民族的傳統(tǒng)乳制品。這種利用牛乳汁與米酒混合制成的半凝固食品，口感軟嫩爽滑，具有獨(dú)特的酒香與奶香，很容易被我國(guó)消費(fèi)者接受。宮廷奶酪口感與風(fēng)味的形成與其發(fā)酵過(guò)程中米酒微生物的作用密切相關(guān)[1]。騰軍偉等[2-3]在酒曲中分離得到11株細(xì)菌和2株真菌，篩選出1株高產(chǎn)凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌； Liu等[4]分析了紹興黃酒中的微生物，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和明串珠菌等為主要菌屬；Lv等[5]報(bào)道傳統(tǒng)米酒發(fā)酵起始物中的優(yōu)勢(shì)菌株為乳酸菌和芽孢桿菌；Huang等[6]報(bào)道紅曲糯米酒中隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳桿菌和明串珠菌成為主要菌屬。甜酒曲中也存在豐富的乳酸菌如腸球菌，乳桿菌等。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中可能由于氧和營(yíng)養(yǎng)成分的變化而產(chǎn)生不同的有機(jī)酸[7]，不僅是酸香味的主要來(lái)源，還具有抑制有害菌生長(zhǎng)的特性[8]。然而，有關(guān)米酒微生物發(fā)酵制作的宮廷奶酪中乳酸菌的分離鑒定及其功能特性的研究較少。

研究采集了4種北京市售宮廷奶酪，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法，結(jié)合菌株的抑菌作用、抗氧化活性和產(chǎn)酸能力測(cè)定，分離篩選乳酸菌優(yōu)良菌株，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)功能性乳制品奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品：宮廷奶酪樣品來(lái)自4個(gè)市售品牌。

指示菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪琦桿菌、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、李斯特菌，菌株由北京工商大學(xué)乳品實(shí)驗(yàn)室菌種保藏庫(kù)保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53型顯微鏡，日本Olympus公司；U- 3900型分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；HZQ- Q型氣浴恒溫?fù)u床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VCX500型細(xì)胞破碎儀，美國(guó)Sonics公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)基的配制

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、K2HPO4·7H2O 2 g、無(wú)水乙酸鈉3.02 g、檸檬酸三銨2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL,將培養(yǎng)基調(diào)至pH值6.2，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：向100 mL液體培養(yǎng)基中添加2 g瓊脂，121 ℃，15 min滅菌。

鈣平板培養(yǎng)基：向100 mL固體培養(yǎng)基中添加1 g的碳酸鈣，121 ℃，15 min滅菌。

1.3.2乳酸菌的初篩

取10 g的樣品于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)，將富集培養(yǎng)的樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水做梯度稀釋?zhuān)『线m梯度平板涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落對(duì)其進(jìn)行平板劃線分離純化，得到形態(tài)一致的單一菌落。

1.3.3乳酸菌的復(fù)篩

鈣平板實(shí)驗(yàn)：將初篩的菌株活化后用三點(diǎn)法接種到鈣平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生溶鈣圈。

過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn): 挑取純培養(yǎng)物1環(huán)于載玻片上，與體積分?jǐn)?shù)3%H2O2混勻，若有氣泡產(chǎn)生，為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.3.4基于16S rDNA的菌種分子生物學(xué)鑒定

將樣品送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Gen Bank中已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件將實(shí)驗(yàn)菌株與選取的序列相似性較高的菌株序列進(jìn)行對(duì)比分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.5乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

采用牛津杯法[9]，取200 μL濃度一定的指示菌懸液在LB平板培養(yǎng)基上涂布。將滅菌后的牛津杯放置在平板上，吸取200 μL離心后的發(fā)酵液于牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑大小。

1.3.6乳酸菌羥自由基清除能力測(cè)定

樣品制備：將乳酸菌37 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心，用PBS(pH值7.2)緩沖溶液洗滌3次，重懸。調(diào)整菌懸液濃度為109CFU/mL，從而制得菌體細(xì)胞。取10 mL調(diào)好濃度的菌體細(xì)胞懸液置于冰浴中超聲破碎，設(shè)置超聲破碎時(shí)間為30 min，超聲4 s，間隔5 s，超聲探頭溫度4 ℃。8 000 r/min離心10 min，離心后獲得的上清液即為無(wú)細(xì)胞提取液。破碎率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

(1)

式(1)中，N表示原始細(xì)胞數(shù)量，N0表示破碎后完整細(xì)胞數(shù)量。

采用Fenton法[10]，取1 mL菌體細(xì)胞懸液和無(wú)細(xì)胞提取物，在試管中依次加入1 mL 0.435 mmol/L 亮綠，2 mL 0.5 mmol/L 硫酸亞鐵，1.5 mL體積分?jǐn)?shù)3% H2O2，37 ℃水浴20 min后在624 nm處測(cè)定上清液吸光度。羥自由基清除率計(jì)算見(jiàn)式(2)。

(2)

式(2)中，A1表示Fenton試劑、亮綠及樣品的吸光度，A0表示Fenton試劑與亮綠的吸光度，A表示亮綠的吸光度。

1.3.7乳酸菌DPPH自由基清除能力測(cè)定

樣品制備同1.3.6節(jié)，向1 mL菌體細(xì)胞懸液和無(wú)細(xì)胞提取物中加入2 mL 0.5 mmol/L DPPH和體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，充分混勻，室溫下避光靜置，反應(yīng)30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液519 nm處測(cè)吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算見(jiàn)式(3)。

(3)

式(3)中，A1表示DPPH乙醇溶液與樣品的吸光度，A0表示樣品與乙醇溶液的吸光度，AC表示DPPH乙醇溶液的吸光度。

空白組以等體積的乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液；對(duì)照組以等體積的無(wú)菌水代替菌體細(xì)胞懸液和無(wú)細(xì)胞提取液。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，Origin 8.6軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的篩選結(jié)果

富集培養(yǎng)的樣品經(jīng)過(guò)稀釋涂布平板法和平板劃線法分離純化后，共得到15株菌株。菌株產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。與原始MRS培養(yǎng)基pH值相比,除MRSC1菌株以外，其余菌株發(fā)酵液pH值都有明顯下降；其中菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3發(fā)酵液與初始發(fā)酵液相比，pH值下降明顯，培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液pH值分別低至3.73、3.79、3.71、3.87，產(chǎn)酸效果較其他菌株更好。

圖1 初篩菌株發(fā)酵液pH值Fig.1 pH values of fermentation liquor of isolated strains

對(duì)菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3進(jìn)行鈣平板鑒定、革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)以及菌落特性和菌體形態(tài)觀察，結(jié)果見(jiàn)表1。4株菌在鈣平板上均有透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明菌株產(chǎn)酸，使得pH值降低，平板中碳酸鈣溶解，形成透明圈。根據(jù)其良好的產(chǎn)酸能力、革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性等特性，初步判斷此4株菌為乳酸菌。

2.2 16S rDNA基因序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3的16S rDNA基因序列與Gene Bank內(nèi)已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)同源性比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2。菌株MRSA2、MRSD3與LeuconostoclactisLMAU40043在同一分支上，且通過(guò)Bootstrap的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度，支持率達(dá)到100%，因此可將MRSA2、MRSD3鑒定為乳明串珠菌。明串珠菌屬通常存在于乳制品、肉類(lèi)或其他食品中[11]。與其他乳酸菌一樣，明串珠菌屬是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，用于多種工業(yè)和食品發(fā)酵過(guò)程，如奶酪、黃油、酸奶和泡菜的生產(chǎn)[12]。 明串珠菌是乳制品生產(chǎn)中重要的風(fēng)味微生物[13]，在風(fēng)味酸奶、干酪生產(chǎn)中應(yīng)用較多，其通過(guò)代謝檸檬酸鹽等有機(jī)酸產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)和CO2等，不僅對(duì)發(fā)酵乳制品的風(fēng)味和組織狀態(tài)有重要影響，還具有潛在的益生作用[14]。

表1 微生物菌落形態(tài)及特性觀察

圖2 4株乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogentic tree of four isolated strains based on 16S rDNA sequence

菌株MRSA1、MRSB1與EnterococcusfaeciumHY07 CP032308在同一分支上，且通過(guò)Bootstrap的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度，支持率達(dá)到99%，因此可將MRSA1、MRSB1鑒定為屎腸球菌。

2.3 乳酸菌抑菌和抗氧化活性分析

2.3.1抑菌活性分析

菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3在37 ℃發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液pH值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、志賀氏菌、阪琦桿菌6株病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和表2。這4株乳酸菌對(duì)6株病原菌均有抑制作用，MRSA2的抑菌效果最強(qiáng)，對(duì)指示菌的抑菌效果顯著高于其余菌株 (P<0.05)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪琦桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌均具有較強(qiáng)抑菌效果，抑菌圈直徑均在16 mm以上。菌株MRSA1對(duì)金黃色葡萄球菌有良好抑菌效果，MRSB1對(duì)阪琦桿菌和沙門(mén)氏菌有良好的抑菌效果，MRSD3對(duì)指示菌的抑菌效果較弱。這些菌株的不同抑菌效果，可能與其產(chǎn)生的不同抑菌物質(zhì)有關(guān)。對(duì)發(fā)酵液用NaOH溶液調(diào)pH值至7，進(jìn)一步分析抑菌活性，表明4株乳酸菌發(fā)酵液經(jīng)堿中和后，對(duì)6株病原菌的抑菌活性全部消失，由此推測(cè)這4株乳酸菌的主要抑菌活性物質(zhì)為酸性物質(zhì)。

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生具有抑制腐敗菌的代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素和二乙酰等[15]。在中和處理酸性代謝產(chǎn)物后，大多數(shù)乳酸菌的抗菌活性喪失[16]。蘇本憲等[17]分析植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、副干酪乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)化膿性鏈球菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)主要抑菌物質(zhì)為有機(jī)酸和H2O2。某些明串珠菌能夠產(chǎn)生抑菌成分，抑制發(fā)酵乳制品中有害菌的生長(zhǎng)[18]。李東霞等[19]用牛津杯雙層法從蔬菜廢棄物中篩選出2株具有高抑菌活性的乳明串珠菌，其主要抑菌活性物質(zhì)為酸性物質(zhì)，與本研究結(jié)果一致。具有良好抑菌活性的明串珠菌可以抑制自然發(fā)酵食品中致病菌的生長(zhǎng)，因此具有重要研究意義[20]。

1—MRSA1; 2—MRSA2; 3—MRSB1; 4—MRSD3。圖3 菌株抑菌活性測(cè)定Fig.3 Antibacterial activities of strains

菌株發(fā)酵液pH大腸桿菌金黃色葡萄球菌李斯特菌阪琦桿菌沙門(mén)氏菌志賀氏菌MRSA13.99±0.04+++++++MRSA23.84±0.06+++++++++++++++++MRSB13.85±0.05++++++++MRSD34.01±0.04++++++

抑菌圈直徑包含牛津杯外徑(7.8 mm)；+：抑菌圈直徑8.00～12.00 mm，抑菌效果較弱；++：12.00～16.00 mm，抑菌效果良好；+++：16.00～20.00 mm，抑菌效果較強(qiáng)。數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.3.2抗氧化活性分析

實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞菌懸液經(jīng)細(xì)胞破碎儀處理，菌株的破碎率達(dá)100%。4株乳酸菌的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果如圖4，菌株對(duì)DPPH自由基和羥自由基均有不同程度的清除作用，且菌懸液的抗氧化能力高于無(wú)細(xì)胞提取物。菌株MRSA1和MRSA2的DPPH自由基清除能力顯著高于其他2株菌(P<0.05)，完整細(xì)胞菌懸液的清除能力顯著高于無(wú)細(xì)胞提取液(P<0.01)，因此初步推測(cè)乳酸菌清除DPPH自由基的活性物質(zhì)主要存在于細(xì)胞表面。不同菌株之間羥自由基清除能力無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

氧化作用是生物體內(nèi)重要的生理過(guò)程，在此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基超過(guò)一定量時(shí)，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷[21]。乳酸菌的抗氧化活性已經(jīng)通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明，含有乳酸菌的功能性食品也越來(lái)越受到青睞[22]。不同乳酸菌的抗氧化能力存在差異，可能是由于菌株分泌的抗氧化活性物質(zhì)種類(lèi)和含量不同引起的[23]。劉宏宇等[24]研究了25株不同乳酸菌的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌的DPPH自由基清除能力最高可達(dá)30.73%，本研究的乳明串珠菌DPPH自由基清除能力高達(dá)60.67%。

DPPH-1、Hydroxyl-1表示細(xì)胞破碎前菌懸液，DPPH-2、Hydroxyl-2表示無(wú)細(xì)胞提取液。圖4 菌株對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率Fig.4 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities of selected strains

3 結(jié) 論

從4種市售宮廷奶酪中分離并經(jīng)初篩和復(fù)篩得到4株乳酸菌，其中菌株MRSA1和MRSB1鑒定為屎腸球菌，MRSA2和MRSD3為乳明串珠菌。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此4株乳酸菌均有抑菌活性，其中MRSA2對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、阪琦桿菌和志賀氏菌有較強(qiáng)抑制作用；而將發(fā)酵液pH值調(diào)至中性后，抑菌效果消失，推測(cè)抑菌活性物質(zhì)為酸性物質(zhì)。抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4株菌均對(duì)DPPH自由基和羥自由基具有清除能力，菌懸液的自由基清除率顯著高于無(wú)細(xì)胞提取液。菌株MRSA1和MRSA2的DPPH自由基清除能力分別高達(dá)55.04%和60.67%，4株菌的羥自由基清除能力無(wú)明顯區(qū)別。本研究篩選的具有良好抑菌特性、抗氧化活性和產(chǎn)酸能力的乳明串珠菌在功能性發(fā)酵食品中有潛在的應(yīng)用前景。