納米微囊－ＶＥＧＦ復(fù)合體對(duì)創(chuàng)傷組織中ＶＥＧＦ、受體ＫＤＲ的表達(dá)及微血管形成的影響

[摘要]目的：研究納米微囊－VEGF復(fù)合體對(duì)創(chuàng)傷組織中VEGF、受體KDR以及微血管表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)損傷組織修復(fù)的作用機(jī)理。方法：將納米微囊－VEGF復(fù)合體作用于兔耳慢性創(chuàng)面，利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法觀察各組術(shù)后1、3、7、10、14天創(chuàng)面組織中VEGF及KDR mRNA表達(dá)的變化；利用免疫組化染色觀察創(chuàng)面肉芽組織中VEGF蛋白表達(dá)及微血管的變化。結(jié)果：VEGF mRNA在Nw(非缺血?jiǎng)?chuàng)面組)和CW+VEGF組(轉(zhuǎn)基因組)3天后的表達(dá)水平均高于其在CW組(慢性創(chuàng)面組)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平，P＜0.05；KDR mRNA在NW組7－14天，CW+VEGF組3－14天的表達(dá)水平高于CW組，P＜0.05；VEGF蛋白表達(dá)變化與mRNA表達(dá)結(jié)果基本一致；與CW組相比，7天后微血管計(jì)數(shù)在CW+VEGF組及NW組增加顯著，P＜0.05。結(jié)論：外源性VEGF基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)致創(chuàng)面中VEGF及受體KDR的表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)增加肉芽組織中微血管的生成促進(jìn)了慢性創(chuàng)面的愈合。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基因治療；納米微囊

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—645 5(2 007)04—0455—04

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelia1growth factor，VEGF)是血管生成的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，慢性創(chuàng)面中VEGF表達(dá)較正常創(chuàng)面下調(diào)而導(dǎo)致的血管生成的下降，被認(rèn)為是慢性創(chuàng)面難愈合的重要原因。在外源性VEGF的應(yīng)用中，蛋白注入給藥方式由于存在價(jià)格昂貴、半衰期短、易水解和單次較大劑量使用可能會(huì)導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)改變等缺點(diǎn)，具有明顯的局限性。

本實(shí)驗(yàn)采用新型材料納米微囊為載體包裹VEGF質(zhì)粒，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方式促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合，并從蛋白及mRNA水平對(duì)創(chuàng)面VEGF、受體KDR的表達(dá)情況以及轉(zhuǎn)基因后它們的表達(dá)變化進(jìn)行了分析，對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行探討，為臨床治療慢性創(chuàng)面提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料：VEGF、CD34單克隆抗體 (美國(guó)SantaCruz)；DEPC、APES膠、溴化乙錠、BSA(美國(guó)Sigma)；Trlzol試劑(英國(guó)GIBCO)；DTT、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑(美國(guó)Invitrogen)；PCR試劑盒(日本Kakara)；DAKO Envision?System試劑盒(丹麥DAKO)；DNA分子量Marker DL2000(日本Kakara)。引物均由上海Sangon公司合成：VEGF上游引物：5’TGC TGC TCT ACC TCC ACC AT3’，下游引物：5’TTG GTC TGC ATT CAC ATT TG3’。KDR上游引物：5’GCC GGT GCC CTG TGC TTT CC3’，下游引物：5’TCC CCT GCA AGT AAT CTG AA3’。β-actin上游引物：5’GAG GCC CAG AGC AAG AGAGG3’，下游引物：5’CCA GAG GCA TAC AGG GACAA3’。

1．2 納米微囊－VEGF復(fù)合體的制備：參照彭湃、韓巖等報(bào)道方法制備。

1．3 模型制作及取材：健康新西蘭白兔25只，48－60月齡，體重3.9－5.0kg(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，動(dòng)物模型構(gòu)建及分組詳見(jiàn)以往報(bào)道。據(jù)此將本實(shí)驗(yàn)共分為3組：轉(zhuǎn)基因組(一側(cè)兔耳慢性創(chuàng)面滴加納米微囊VEGF復(fù)合體，以CW+VEGF表示)、慢性創(chuàng)面組(另側(cè)兔耳慢性創(chuàng)面滴加納米微囊空載質(zhì)粒，以CW表示)、非缺血?jiǎng)?chuàng)面組(雙側(cè)兔耳非缺血?jiǎng)?chuàng)面滴加納米微囊一空載質(zhì)粒，以NW表示)。于術(shù)后1、3、7、10、14天，每時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)處死5只動(dòng)物。取材方式：半數(shù)創(chuàng)面切取1cm×1cm正方形組織塊，中性福爾馬林固定、石蠟包埋。其余創(chuàng)面用直徑7mm的皮膚打孔器，在耳軟骨表面環(huán)形切取創(chuàng)緣皮膚及肉芽組織，每創(chuàng)面取100mg組織迅速放入-70℃冰箱中保存，用于RT—PCR。

1．4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)：利用TRIzol試劑盒按說(shuō)明提取組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA。以93℃ 1min，適合的退火溫度30s，72℃1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min，30個(gè)熱循環(huán)的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、染色、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)后，用Labworks軟件對(duì)各陽(yáng)性條帶的密度進(jìn)行測(cè)定。

1．5 VEGF、CD34免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片常規(guī)免疫組化染色。其中一抗為VEGF、CD34單克隆抗體，稀釋度分別為1：50和1：100，同時(shí)設(shè)立已知陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照、正常未免疫小鼠血清替代對(duì)照。

1．6 創(chuàng)面微血管計(jì)數(shù)：孤立的棕色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇代表l條單獨(dú)的微血管。根據(jù)Pareek等的計(jì)數(shù)方法，先在低倍(100X)視野內(nèi)選擇染色密度高的區(qū)域，然后在高倍(200X)視野內(nèi)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，取平均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1．7 圖像分析：先在低倍鏡(100X)下篩選出染色較強(qiáng)的區(qū)域，然后在其中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(200X)，LaicaQC500圖像分析儀測(cè)定其透光度，值越小，則染色密度越高。取平均值，設(shè)定染色背底的透光度為100，陽(yáng)性染色的密度與背底密度的比值作為每張切片免疫組化染色的相對(duì)密度。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所得數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA和post—hoc檢驗(yàn)，分析組間和兩兩差異，顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2．1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)結(jié)果：VEGFmRNA在NW和CW+VEGF組3天后的表達(dá)水平均高于其在CW組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。KDR mRNA在NW組7-14天，CW+VEGF組3-14天的表達(dá)水平顯著高于CW組，P＜0.05。

2．2 VEGF免疫組化染色結(jié)果：VEGF在創(chuàng)緣主要表達(dá)于新生表皮層，炎細(xì)胞有少量表達(dá)，3天后血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性顆粒定位于胞漿。在CW+VEGF組及NW組表達(dá)較強(qiáng)，而CW組陽(yáng)性信號(hào)較弱。圖像分析結(jié)果見(jiàn)圖5，CW組雖然隨時(shí)間的延續(xù)表達(dá)上調(diào)，但曲線變化較平緩，其數(shù)值顯著低于其他兩組，P＜0.05。NW組3天后表達(dá)增高，7-10天達(dá)到峰值。CW+VEGF組自1天后表達(dá)升高明顯，7天時(shí)達(dá)到峰值。

2．3 創(chuàng)面微血管計(jì)數(shù)結(jié)果：CD34染色顯示7天后CW+VEGF組及NW組微血管數(shù)量豐富，而CW組微血管數(shù)量較少。計(jì)數(shù)結(jié)果表明，從1-14天各組微血管數(shù)量逐漸增加，在7天后CW+VEGF組及NW組與CW組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

3 討論

在影響慢性創(chuàng)面形成的諸多因素中，內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的嚴(yán)重匱乏是導(dǎo)致慢性創(chuàng)面難愈合的一個(gè)重要原因。在急性創(chuàng)面有數(shù)種促進(jìn)愈合的生長(zhǎng)因子的高水平表達(dá)，而慢性創(chuàng)面中會(huì)明顯減弱甚至缺失。Cooper證實(shí)在褥瘡創(chuàng)面中PDGF、bFGF、EGF和TGF-B表達(dá)水平明顯低于急性創(chuàng)面。同樣，在受損創(chuàng)傷愈合鼠模型中PDGF及其受體表達(dá)也下調(diào)。許多證據(jù)表明VEGF在創(chuàng)傷愈合中的表達(dá)水平與創(chuàng)傷修復(fù)的發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)聯(lián)。對(duì)大鼠創(chuàng)傷皮膚內(nèi)VEGF表達(dá)的免疫組化研究表明，創(chuàng)傷組于傷后12hVEGF表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，以24-48h表達(dá)最強(qiáng)。對(duì)放射性潰瘍的研究證實(shí)，輻射損傷的皮膚組織細(xì)胞合成分泌VEGF的功能在潰瘍形成前被電離輻射輕度激活，在潰瘍形成后，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯低于正常創(chuàng)面組，是潰瘍形成、發(fā)展及難愈合的原因之一。

從我們前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)非病毒載體納米微囊-VEGF復(fù)合體能明顯促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合。在本實(shí)驗(yàn)中，慢性創(chuàng)面組VEGF雖然隨著時(shí)間的延續(xù)表達(dá)上調(diào)，但數(shù)值顯著低于其他兩組，說(shuō)明在慢性創(chuàng)面中VEGF低表達(dá)可能是導(dǎo)致創(chuàng)面難愈合的一個(gè)重要原因。非缺血?jiǎng)?chuàng)面自3天以后VEGF表達(dá)顯著增高，7天至10天達(dá)到峰值，14天時(shí)仍維持較高水平，這有助于新生血管化，可能是該組創(chuàng)面能夠正常愈合的一個(gè)重要保證。外源性VEGF基因轉(zhuǎn)染創(chuàng)緣細(xì)胞后，表達(dá)在1天后顯著上調(diào)，可以推斷動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功。

VEGF的調(diào)控機(jī)制并不十分清楚。缺氧導(dǎo)致VEGF表達(dá)增高與其激活VEGF基因啟動(dòng)子AP-1區(qū)有關(guān)，由于創(chuàng)面形成會(huì)造成不同程度的組織氧分壓下降，因此本實(shí)驗(yàn)中各組均可能因創(chuàng)傷后局部低氧而上調(diào)VEGF表達(dá)。同時(shí)一些細(xì)胞因子對(duì)VEGF表達(dá)有正調(diào)節(jié)作用，而創(chuàng)傷修復(fù)各階段均有上述因子的表達(dá)?？梢酝茰y(cè)多種細(xì)胞因子可能通過(guò)激活某種特定的信號(hào)通路而影響VEGF的轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程。慢性創(chuàng)面多種生長(zhǎng)因子表達(dá)的減弱甚至缺失而下調(diào)了VEGF的表達(dá)，使其表達(dá)曲線與非缺血?jiǎng)?chuàng)面差異顯著。

實(shí)驗(yàn)選擇KDR作為受體研究對(duì)象，是因?yàn)镕lt-1與VEGF有高度親和力，但其表達(dá)水平較低，不易檢測(cè)。在創(chuàng)傷形成后三組KDRmRNA表達(dá)水平都有不同程度提高，但提高的幅度是有明顯差異的，其中慢性創(chuàng)面提高幅度最小，而轉(zhuǎn)基因組上升幅度最大。KDR出現(xiàn)與VEGF一致性的表達(dá)升高更有利于兩者充分的結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，比如可以增強(qiáng)血管發(fā)生信號(hào)在內(nèi)皮細(xì)胞的傳遞，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成，有利于創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。

綜上所述，外源性VEGF基因轉(zhuǎn)染可以使創(chuàng)面中VEGF及受體KDR的表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)增加肉芽組織中微血管的生成促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。但尚有一些問(wèn)題值得深入探討，如外源性VEGF上調(diào)KDR表達(dá)是在何種水平通過(guò)何種信號(hào)傳導(dǎo)通路需待進(jìn)一步的研究。