ＶＥＧＦ在犬恒牙胚發(fā)育中的表達(dá)及意義

[摘要]目的：探討犬乳恒牙替換過(guò)程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在犬恒牙胚發(fā)育中的表達(dá)及意義。方法：分別對(duì)乳牙期、替牙期、恒牙期本地犬取牙胚及其周圍組織，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色和牙胚內(nèi)VEGF的免疫組化染色，用彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析各組染色強(qiáng)度灰度值。結(jié)果：乳牙期、替牙期犬牙胚的成牙本質(zhì)細(xì)胞VEGF的免疫組化強(qiáng)度明顯高于另外一組，成釉細(xì)胞中也有陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)論：VEGF可能參與恒牙胚的發(fā)育。

[關(guān)鍵詞]犬恒牙胚；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；成牙本質(zhì)細(xì)胞；成釉細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—6455(2007)04—0510—02

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)是由血小板、巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞合成和分泌的多功能細(xì)胞素，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成、增加血管通透性以及血管維持等功能。許多研究表明，VEGF在胚胎發(fā)育過(guò)程中協(xié)調(diào)著細(xì)胞外基質(zhì)的改建、血管增生的關(guān)系。而在恒牙胚發(fā)育中的作用卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)犬恒牙胚成牙本質(zhì)細(xì)胞中VEGF的表達(dá)進(jìn)行研究，探討VEGF在此過(guò)程中的作用。

1 材料和方法

1．1 材料及分組：動(dòng)物選用本地犬共6只，分為3組，每組各2只。A組：乳牙牙根穩(wěn)定犬(6周齡)，體重2.5Kg；B組：乳牙牙根吸收犬(12～16周齡)，體重6Kg；C組：成年恒牙列犬(20周齡)，體重10Kg。

1．2 試劑：兔抗鼠和人VEGF多克隆抗體(SantaCruz公司，美國(guó))；SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉)；DAB顯色試劑盒(北京中杉)。

1．3 切片標(biāo)本制作及觀察：分別將實(shí)驗(yàn)犬以速眠新Ⅱ注射液按0.2ml/Kg肌注麻醉，解剖分離雙側(cè)頸動(dòng)脈后斷頭處死，頸動(dòng)脈插管，用生理鹽水沖洗，4％甲醛固定液(含1/1000 DEPC)進(jìn)行灌注組織內(nèi)固定，分離上、下頜骨，4％甲醛固定液外固定24h，上、下頜骨于甲酸、甲酸鈉脫鈣液中4℃脫鈣，4周后分切成小塊，再脫鈣4周。脫鈣后，分切、修整、酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制作5μm厚石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)HF染色，每只犬取5張切片共30張，每張切片光學(xué)顯微鏡下觀察根尖組織。

1．4 免疫組化染色及圖像分析：切片脫蠟至水，一抗為兔源性抗體，稀釋度1：80，其余步驟按試劑盒進(jìn)行。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析染色強(qiáng)度的灰度值，每個(gè)時(shí)期10張切片，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)成牙本質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果

A組：8周犬乳牙根未發(fā)生生理性根吸收，恒牙胚牙冠發(fā)育處于牙體組織形成期，牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)開(kāi)始形成。成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞高柱狀，胞核橢圓形，遠(yuǎn)離基底膜，整齊排列，極性倒置明顯。此時(shí)可見(jiàn)恒牙胚內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞染色陽(yáng)性，染棕黃色?？瞻讓?duì)照組染色陰性。B組：12～16周犬乳牙根發(fā)生生理性吸收，恒牙胚冠部牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)進(jìn)一步形成和礦化，成釉器萎縮、上皮根鞘向根方生長(zhǎng)，形成上皮隔，并可見(jiàn)上皮根鞘發(fā)生斷裂。此時(shí)恒牙胚內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞染色陽(yáng)性，空白對(duì)照組染色陰性。C組：20周成年犬恒牙列，乳牙已脫落，恒牙萌出。恒牙成牙本質(zhì)細(xì)胞染色陰性。

經(jīng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析，成牙本質(zhì)細(xì)胞染色灰度值分析見(jiàn)表1。

經(jīng)LSD檢驗(yàn)，A、B組與C組間P＜0.05，即成牙本質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色強(qiáng)度A、B組與C組間有顯著性差異，說(shuō)明成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)VEGF的強(qiáng)度不同。A組與B組間P＞0.05，即成牙本質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色強(qiáng)度A組與B組間無(wú)顯著性差異。

3 討論

VEGF的研究始于1989年，VEGF是一種由亞基內(nèi)及亞基間二硫鍵交聯(lián)形成的同源二聚體糖蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)VEGF家族至少包括五大成員：VEGF—A、VEGF—B、VEGF－C、VEGF-D并口PGF(placentalgrowth factor，胎盤(pán)生長(zhǎng)因子)，分別定位于不同的染色體。目前已知VEGF家族有3個(gè)受體：VEGFR—1、VEGFR—2、VEGFR－3，分別由f1t—1、f1k—1/KDR、f1t一4基因編碼。其共同特點(diǎn)是催化域內(nèi)有酪氨酸激酶插入?yún)^(qū)，酪氨酸激酶的活性通過(guò)受體和配體結(jié)合而激活，由受體磷酸化而刺激蛋白酶和Ca離子內(nèi)流，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起重要作用。

研究表明，VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性最強(qiáng)的絲裂原，具有特異性促進(jìn)血管增殖的作用。在牙齒發(fā)育早期，內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF促進(jìn)血管形成。大量血管侵入牙乳頭、牙囊，以保證組織形成所需的營(yíng)養(yǎng)。Aida研究表明，VEGF表達(dá)于內(nèi)、外釉上皮及星網(wǎng)層細(xì)胞，調(diào)控成釉細(xì)胞的成熟。當(dāng)成釉細(xì)胞成熟后，對(duì)牙乳頭發(fā)生誘導(dǎo)作用，分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。成熟后的成牙本質(zhì)細(xì)胞已具備合成蛋白質(zhì)的功能。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)：VEGF的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)于發(fā)育中的恒牙胚成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞中，鏡下觀察，兩類細(xì)胞高柱狀，細(xì)胞核大、橢圓形，遠(yuǎn)離基底膜，這種細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)反映其功能和狀態(tài)正處于活躍的基質(zhì)分泌期；恒牙萌出后，其成牙本質(zhì)細(xì)胞成為扁平狀，說(shuō)明其功能處于靜止，染色結(jié)果為陰性。圖像分析的結(jié)果A、B兩組間灰度值稍有不同，但相差不顯著，提示牙胚發(fā)育期間，細(xì)胞的功能狀態(tài)可能差別不明顯，但A、B組與C組則有顯著性差異，說(shuō)明恒牙萌出后，成牙本質(zhì)細(xì)胞VEGF染色強(qiáng)度明顯減弱，提示VEGF可能參與了牙胚的形成和發(fā)育，推測(cè)可能與硬組織礦化有關(guān)。