體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的初步研究

[摘要]目的：探討人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞存在及體外向成軟骨細(xì)胞分化的可能性。方法：將無(wú)菌條件下采集健康產(chǎn)婦臍帶血，用相對(duì)密度為1.077g/m1的人淋巴細(xì)胞分離液分離臍血單個(gè)核細(xì)胞，利用間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特性獲得MSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面抗原標(biāo)志。聯(lián)合應(yīng)用TGF－β1和IGF－Ⅰ及含有1×ITS+I的高糖DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后第21天留取細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)，分析是否誘導(dǎo)出成軟骨細(xì)胞。結(jié)果：臍血MSC強(qiáng)表達(dá)CD44、CD105，不表達(dá)CD34、CD45。誘導(dǎo)21天甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性，特異性表達(dá)Ⅱ型膠原。結(jié)論：人足月臍帶血中存在MSCs，在TGF-β1等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下可以向具有軟骨細(xì)胞表型和功能的細(xì)胞分化。

[關(guān)鍵詞]臍帶血；間充質(zhì)干細(xì)胞；成軟骨細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2007)04-0450-05

臍帶血(human umbilical cord blood，HUCB)作為造血干細(xì)胞的來(lái)源，能夠替代骨髓移植來(lái)治療多種疾病，但是在臍血中是否含有間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)仍存在爭(zhēng)議。其中間充質(zhì)成分的鑒定仍然不明。為此，本實(shí)驗(yàn)探討其存在可能性及向軟骨分化的潛能。

1 材料

1．1 標(biāo)本：在無(wú)菌條件下采集于健康育齡產(chǎn)婦足月自然分娩的臍帶血40－60ml。經(jīng)檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)急慢性傳染性疾病和感染性疾病，無(wú)家族性疾病，新生兒無(wú)畸形。所采集樣本肝素抗凝(25U/m1)。

1．2 試劑：α－MEM、FBS及高糖DMEM(Gibco公司)、人淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD)、鼠抗人CD34－FITC、CD44-FITC、CD45－FITC、CDl05－PE(BD公司)、TGF－β1、IGF—I(Peprotech公司)、ITS+1(Sigma公司)、鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體(福州邁新)、SP奧抗試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中衫)

1．3 耗材和儀器：培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(Corning)、流式細(xì)胞儀(BD公司)、相差倒置顯微鏡(Olympus)

2 方法

2．1 臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)：將所采集臍血樣本于12h內(nèi)處理。用D—Hank’s緩沖液1:1等比稀釋，再與37℃預(yù)溫的3％明膠等比混合，室溫下靜置至血漿與紅細(xì)胞界面形成后，吸取血漿層，離心，收集細(xì)胞；用5mlα-MEM重懸所得細(xì)胞，按2：1的體積比加到人淋巴細(xì)胞分離液(1.077g/m1)表面，離心后吸取懸于分離液面的白膜層，獲得單個(gè)核細(xì)胞。D—Hank’s緩沖液洗滌2次，加入α—MEM(含20％FBS、IOOU/ml青霉素、100U/ml鏈霉素)培養(yǎng)基，吹打均勻制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以1×10⁶cells/ml濃度接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4天后首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞，以后每隔3天換液一次。在相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞生長(zhǎng)至60％時(shí)，用0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA消化，1：1傳代。第一代后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80％-90％時(shí)，按1：3傳代。

2．2 臍血MSCs生物學(xué)特性檢測(cè)

2．2．1 臍血問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇：將生長(zhǎng)情況良好的P3代細(xì)胞用消化液消化成單細(xì)胞懸液，洗滌，離心，收集細(xì)胞沉淀，用含有10％DMSO的凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度至5×10⁶/ml。無(wú)菌的凍存管分裝，封口。置于70℃冰箱中，3h后，取出凍存管移入液氮容器內(nèi)。復(fù)蘇：細(xì)胞凍存3個(gè)月后，將凍存管從液氮中取出，迅速放入40℃的水浴中，搖動(dòng)，1-2min內(nèi)解凍，復(fù)蘇，洗滌后，加入新鮮的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2．2 臍血MSCs生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)：接種細(xì)胞分為兩組：①凍存組：同一樣本來(lái)源的凍存細(xì)胞；②對(duì)照組：取生長(zhǎng)良好的P3細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以1×10⁴cells/ml濃度，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1.0ml，24h后換液，去除未貼壁的細(xì)胞。每天取6孔消化，每孔計(jì)數(shù)3次，求均值。連續(xù)8天。未測(cè)者應(yīng)及時(shí)換液。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪生長(zhǎng)曲線。并定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，包括形態(tài)特點(diǎn)，細(xì)胞到達(dá)平臺(tái)期即停止觀察。

2．3 臍血MSCs表面抗原的檢測(cè)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞，在細(xì)胞達(dá)到80-90％融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA的消化液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶ells/ml。分別加入鼠抗人CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE單克隆抗體，陰性對(duì)照管中分別加入抗鼠IG—PE、IG—FITC，孵育20min。加入3ml PBS，洗滌2次，溶于200ul PBS中。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2．4 臍血MSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)：取P3代生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，以1×10⁵cells/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加入α—MEM(含20％FBS、100U/ml青霉素、100u/ml鏈霉素)培養(yǎng)基。過(guò)夜后更換為高糖DMEM含血清軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行單層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。所用的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液含有：5％FBS，10ng/mlTGF—β1(human recombinant)，10ng/mlIGF—I(human recomb-inant)，0.1ml地塞米松，50μg/ml抗壞血酸，1×ITS+I。同時(shí)以未誘導(dǎo)MSCs作為對(duì)照。培養(yǎng)細(xì)胞每2天換液一次。在誘導(dǎo)21天后，消化誘導(dǎo)的細(xì)胞，接種于細(xì)胞爬片上，進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

2．5 鑒定

2．5．1 甲苯胺藍(lán)染色：待細(xì)胞貼壁伸展后，將細(xì)胞爬片取出，4％多聚甲醛固定1h，自來(lái)水沖洗15min，蒸餾水沖洗1次，置細(xì)胞爬片于1％甲苯胺藍(lán)染液中，2h后，蒸餾水沖洗1遍，在用95％乙醇洗去多余的染液。光鏡下觀察細(xì)胞染色情況，干燥爬片，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

2．5．2 Ⅱ型膠原免疫組化染色：取培養(yǎng)21天的誘導(dǎo)細(xì)胞爬片，用4％多聚甲醛固定1h，PBS沖洗3次。滴加過(guò)氧化物酶阻斷溶液以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育10min，PBS沖洗3次，加入正常山羊血清以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。于玻片上分別滴加一抗，以PBS作為陰性對(duì)照，置濕盒內(nèi)，4℃冰箱過(guò)夜；爬片室溫復(fù)溫1h，PBS沖洗3次。再依次滴加生物素標(biāo)記的二抗及鏈霉菌素一過(guò)氧化物酶溶液，37℃孵育30min，PBS沖洗3次。除去PBS后，于玻片上滴加1滴DAB顯色劑，在光鏡下觀察染色情況，以陽(yáng)性反應(yīng)著色最強(qiáng)而背景開(kāi)始染色為度，自來(lái)水沖洗。系列酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。其中以PBS代替一抗樣本作為空白對(duì)照。

3 結(jié)果

3．1 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與擴(kuò)增

3．1．1 MSC的原代培養(yǎng)：將臍血分離后獲得的單個(gè)核細(xì)胞接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶，48h后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，這些細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)非均一性，有大而多核的破骨樣細(xì)胞和呈紡錘形或長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞增多。經(jīng)過(guò)約3周的培養(yǎng)，成纖維樣細(xì)胞增殖可達(dá)約60％融合，細(xì)胞排列有一定方向性。

3．1．2 臍血MSC傳代培養(yǎng)：原代貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成60％融合后，用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，1：1傳代。細(xì)胞在接種后呈圓形，折光性好。2h后開(kāi)始貼壁，12h后貼壁細(xì)胞可達(dá)到90％以上，并逐漸伸展；傳代后細(xì)胞均勻散在分布，生長(zhǎng)迅速，不再形成集落；接種2天后即開(kāi)始增殖，約10天左右可達(dá)到80％融合。隨著進(jìn)一步的傳代過(guò)程，其他細(xì)胞逐漸被去除，貼壁細(xì)胞呈均一的長(zhǎng)梭形，增殖加快，1周左右即可達(dá)80％-90％融合。

3．1．3 傳代MSC的生長(zhǎng)曲線：傳代的P3代細(xì)胞和凍存復(fù)蘇后的P3代細(xì)胞相比較，凍存組細(xì)胞的細(xì)胞活性和增殖能力均較未凍存細(xì)胞略有降低。凍存組細(xì)胞在復(fù)蘇后，細(xì)胞數(shù)量有所減少。生長(zhǎng)曲線顯示，凍存組細(xì)胞潛伏期增長(zhǎng)，但在第4天其增殖能力開(kāi)始恢復(fù)，生長(zhǎng)速度加快，倍增時(shí)間和未凍存組相比沒(méi)有差異。

3．2 臍血MSCs表面標(biāo)志的檢測(cè)：MSCs經(jīng)鼠抗人CD34、CD44、CD45、CDl05單克隆抗體標(biāo)記后檢測(cè)的結(jié)果為：人臍血MSCs第3代細(xì)胞表面抗原不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)抗原CD45、CD34，而CD44、CDl05呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

3．3 臍血MSC向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)：在誘導(dǎo)初期，誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)上無(wú)明顯差異；誘導(dǎo)1周后，誘導(dǎo)組細(xì)胞伸展的胞突開(kāi)始縮短，胞體鋪開(kāi)變大，細(xì)胞逐漸向多邊形或類三角形轉(zhuǎn)變。誘導(dǎo)21天后，臍血MSCs經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后胞漿呈現(xiàn)藍(lán)色異染顆粒。誘導(dǎo)后臍血MSCa呈現(xiàn)黃褐色染色。

4 討論

目前，成體干細(xì)胞中的骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞得到了大家的認(rèn)可，其間充質(zhì)分化潛能甚至在體外重復(fù)傳代后仍然保持，被認(rèn)為是MSCs的一種主要來(lái)源。與骨髓相比，臍血有更充足的來(lái)源，其收集過(guò)程比從骨髓或胚胎獲取干細(xì)胞簡(jiǎn)單，臍血中含有MSCs更為原始，具有更強(qiáng)的分化能力：臍血的免疫原性較弱，能耐受更大程度上的HLA配型不符，故臍血中的MSCs可以作為一種新的替代干細(xì)胞的來(lái)源而用于多種系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療。

自Erices報(bào)道從臍血中分離出MSCs以來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者也相繼證實(shí)了人臍血問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的存在，并且在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了臍血MSCs的多向分化潛能，但是也有學(xué)者質(zhì)疑在臍血中不存在MSCs，或者在足月嬰兒的臍帶血中不存在。本實(shí)驗(yàn)利用密度梯度離心法與自然沉降法相結(jié)合的方法，成功從足月嬰兒臍帶血中分離出了MSCs。在原代培養(yǎng)中，貼壁細(xì)胞表現(xiàn)兩種細(xì)胞形態(tài)，即破骨細(xì)胞樣和成纖維樣細(xì)胞，這和Erices報(bào)道的結(jié)果相似。在傳代培養(yǎng)中，破骨樣細(xì)胞不能增殖逐漸被去除，所分離的細(xì)胞能夠得到純化，表現(xiàn)為形態(tài)均一的成纖維樣細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，部分樣本未分離出了MSCs，這可能和足月臍血中所含的MSCs頻度較低和其活性受到不同分離培養(yǎng)條件的影響有關(guān)，所以，臍血MSCs分離方法還有待于進(jìn)一步的探索和完善。

在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，臍血MSCs在傳代后增殖速度加快，在7天左右即可達(dá)到融合狀態(tài)，表明足月生產(chǎn)的臍帶血MSCs亦有很強(qiáng)的增殖能力。而且，通過(guò)生長(zhǎng)曲線的觀察，MSCs在凍存后，生長(zhǎng)潛伏期略有延長(zhǎng)，可能由于細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性有一定程度的影響，但可以迅速恢復(fù)原有的增殖能力。

臍血MSCs表達(dá)的主要分子包括：①粘附分子：CD13、CD44、CD51、CD54；②整合素家族：CD29、CD49b、CD49e；以及SH2(CD105)、SH3(CD106、VCAM-1)、SH4、ASMA、HLA-ABC等。陰性標(biāo)志：造血細(xì)胞的表面標(biāo)志，如：CD34、CD45、CD14、CD19(B細(xì)胞特異的抗原)、CD38以及共刺激分子B7—1、B7—2(HLA識(shí)別相關(guān))、HLA—DR抗原等。其中，CD34是主要的造血干/祖細(xì)胞標(biāo)志物；CD45是位于白細(xì)胞表面的白細(xì)胞共同抗原，表達(dá)在淋巴細(xì)胞以及除了紅細(xì)胞和血小板之外的其它所有的造血細(xì)胞上。臍血源性MSCs一般不表達(dá)白細(xì)胞共同抗原(CD45)和造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34，是作為MSCs有別于造血細(xì)胞的一個(gè)重要基本特征。本實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示所分離培養(yǎng)的成纖維樣細(xì)胞表達(dá)CD44、CDl05(SH2)，不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)抗原CD34、CD45，證明這些細(xì)胞是一群區(qū)別于造血細(xì)胞的具有高度增殖能力的處于分化狀態(tài)的一類非定向祖細(xì)胞，同時(shí)亦說(shuō)明在足月臍帶血中存在有MSCs。

甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，足月臍帶血MSCs在體外成軟骨誘導(dǎo)因子的作用下，能夠向間質(zhì)組織細(xì)胞分化。在以往臍血MSCs向成軟骨分化的研究中，多采用細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)法進(jìn)行誘導(dǎo)，可能是認(rèn)為在三維培養(yǎng)的條件下，可能更利于細(xì)胞之間信號(hào)的傳遞和細(xì)胞因子的相互作用。但僅靠這種微團(tuán)培養(yǎng)的方法并不能得到較多的組織量，如果進(jìn)行較大的微團(tuán)誘導(dǎo)則可能會(huì)因細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)等原因影響團(tuán)塊中央細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，甚至出現(xiàn)壞死。在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)中，細(xì)胞單層狀態(tài)下則不存在這個(gè)問(wèn)題，而且可以得到更多的細(xì)胞量目前，單層誘導(dǎo)MSCs向軟骨誘導(dǎo)分化的研究?jī)H限于骨髓Mscs，在臍血中尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人足月臍帶血MSCs向軟骨細(xì)胞分化的潛能。

在透明軟骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)中，Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞特征性標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化法證實(shí)了人臍帶血MSCs在單層誘導(dǎo)后分泌的軟骨細(xì)胞特征性的細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的表達(dá)，表明了HUCB MSCs的可塑性。在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中，我們觀察到，在無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)中，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，增殖緩慢；所以，我們?cè)诓捎昧说脱逭T導(dǎo)體系，應(yīng)用TGF—β1、TGF—Ⅰ聯(lián)合誘導(dǎo)臍血MSCs的分化。

有研究發(fā)現(xiàn)用TGF—β1和地塞米松對(duì)MSCs誘導(dǎo)后，可檢測(cè)到異染性物質(zhì)的存在，Ⅱ型膠原的mRNA表達(dá)，顯示TGF-β1在誘導(dǎo)MSC向軟骨方向分化的過(guò)程中起重要作用。TGF-β1在單獨(dú)作用下，可以誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，而在與其他生長(zhǎng)因子聯(lián)合作用下，則更利于細(xì)胞的定向分化。Worster體外培養(yǎng)BMSCs觀察到，用單純TGF—β1或單純IGF-1預(yù)先誘導(dǎo)的BMSCs軟骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)比較弱，用TGF—β1預(yù)處理并添加了IGF—1的培養(yǎng)液，BMSCs成軟骨的能力明顯增強(qiáng)。說(shuō)明TGF-β1與IGF-Ⅰ有協(xié)同作用，在TGF-β在其他生長(zhǎng)因子共同作用下，可增強(qiáng)其對(duì)MSCs的誘導(dǎo)作用。誘導(dǎo)液中加入地塞米松，可抑制MSCs向脂肪細(xì)胞分化，本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)液中加入IGF—Ⅰ、地塞米松和抗壞血酸，增大誘導(dǎo)成軟骨效應(yīng)，抵消成骨效應(yīng)，獲得較大的促增殖和成軟骨效應(yīng)。

本研究證實(shí)了人足月臍帶中存在MSCs，且可在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增傳代，其表型與骨髓源性MSCs一致，并能在單層狀態(tài)下誘導(dǎo)分化為成軟骨細(xì)胞，驗(yàn)證了其分化潛能，為進(jìn)一步在體外結(jié)合支架材料構(gòu)建組織工程軟骨提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。