骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚

[摘要]目的：體外培養(yǎng)擴(kuò)增sD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，復(fù)合組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚，為進(jìn)一步-臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：將SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，以生長(zhǎng)狀態(tài)良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于制備好的組織工程化脫細(xì)胞真皮支架上，進(jìn)行體外聯(lián)合培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程皮膚。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及組織工程皮膚結(jié)構(gòu)。結(jié)果：體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，傳代擴(kuò)增容易，組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)去細(xì)胞完全，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中生長(zhǎng)良好，可體外構(gòu)建組織工程皮膚。結(jié)論：利用體外擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及制備的組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)可以體外聯(lián)合構(gòu)建組織工程皮膚。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脫細(xì)胞真皮；組織工程皮膚

[中圖分類號(hào)]0813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1 008－6455(2007)04－0443－04

對(duì)于大面積皮膚缺損患者，盡早在功能和外觀上修復(fù)創(chuàng)面對(duì)降低病人的死亡率、提高病人的生存質(zhì)量極為重要。但由于自體皮源不足和取皮本身又造成新的皮膚缺損等原因，限制了自體皮移植的應(yīng)用。組織工程皮膚的研制和應(yīng)用為大面積皮膚缺損患者帶來(lái)了福音，但也存在著種子細(xì)胞來(lái)源不足和理想的支架材料沒(méi)找到等問(wèn)題。骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞是具有多項(xiàng)分化能力的成體干細(xì)胞，在皮膚創(chuàng)面微環(huán)境下，它可以分化為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，另外，它還可分泌多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，有望成為皮膚組織工程理想的種子細(xì)胞。組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是一種新開(kāi)發(fā)的組織工程支架材料，具有組織相容性好，適于組織再生等優(yōu)點(diǎn)。本研究以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以組織工程化脫細(xì)胞真皮為支架載體，體外聯(lián)合培養(yǎng)，以期構(gòu)建組織工程皮膚。

1 材料和方法

1．1 材料：SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，Percoll淋巴細(xì)胞分離液(1.073g/ml，購(gòu)自美國(guó)Pharmacia公司)，DMEM－F12培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，胰酶(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青犢牛應(yīng)用研究所)，超凈工作臺(tái)(Nuair)，CO₂孵箱(Nuair)，倒置顯微鏡(Olympus)

1．2 方法與步驟

1．2．1 組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備：在無(wú)菌條件下，將BAM用醋酸溶液溶解后，加入1/10體積的胎牛血清和10X的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.2，加入培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，使終濃度為10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，再將BAM—細(xì)胞懸液加至培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO²條件下固化30min，再加入器官培養(yǎng)液；每天換液，37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)10天。取出培養(yǎng)好的組織工程化細(xì)胞外基質(zhì)，PBS清洗后置于-80℃條件下反復(fù)凍融3次，每次30min，使細(xì)胞完全破裂崩解；最后將其置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干。⁶⁰Co消毒，無(wú)菌封裝。取部分材料做組織學(xué)和掃描電鏡觀察，觀察組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的顏色、結(jié)構(gòu)、空隙分布、細(xì)胞殘留情況。

1．2．2 骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增：取120-150g雄性SD大鼠(4周)，將大鼠斷頸處死，70％乙醇消毒，無(wú)菌條件下取股骨、脛骨，剔出周圍肌肉組織，剪去兩端骨骺，抽取5ml無(wú)血清DMEM—F12培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素各100U/ml)沖洗骨髓腔，吹打制成單細(xì)胞懸液，注入含有5mlPercoll的分離液于離心管中，離心半徑8cm，2000r/min離心20min，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細(xì)胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10％胎牛血清的DMEM—F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)5×10⁶個(gè)/ml后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO₂、95％濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)全過(guò)程。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以1×10⁴個(gè)/ml傳代。

1．2．3 復(fù)合骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程皮膚的構(gòu)建：取凍干、滅菌過(guò)的組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，用DMEM—F12培養(yǎng)基浸潤(rùn)12h，后把培養(yǎng)基吸干，置37℃孵箱中4h。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用胰酶消化成細(xì)胞懸液，800r/min離心5min，DMEM-F12重懸，以10⁵/cm₂的密度接種在自制的組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上，培養(yǎng)體系為DMEM—F12培養(yǎng)基，補(bǔ)充10ml/L的胎牛血清，置37℃、5％CO₂、95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12天左右，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察有無(wú)污染及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1．2．4 組織工程皮膚的檢測(cè)方法：構(gòu)建的組織工程皮膚在體外培養(yǎng)12天后，取材，并行大體觀察，組織學(xué)觀察和掃描電鏡觀察，主要觀察組織工程皮膚的顏色、柔韌性、組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與組織工程化脫細(xì)胞真皮的結(jié)合以及骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中的生長(zhǎng)、伸展?fàn)顩r。

2 結(jié)果

2．1 組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)：大體觀察組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)呈乳白色，微泛紅色，柔韌，厚度為2500μm左右。HE染色顯示膠原呈無(wú)規(guī)則排列，存在大小不等的不規(guī)則腔隙，未見(jiàn)任何細(xì)胞碎片。掃描電鏡觀察在其表面和內(nèi)部均有大量的宏觀孔隙，形態(tài)不一，分布較均勻，且孔與孔之間成三維連通結(jié)構(gòu)，孔隙率較高。

2．2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的BMSCs于1天開(kāi)始貼壁，細(xì)胞伸展成梭形、橢圓形或多角形；2天有細(xì)胞集落形成，貼壁細(xì)胞增多；4天呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)；10天細(xì)胞集落逐漸擴(kuò)大融合成單層。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)較原代快，6天即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征，隨著代數(shù)增加細(xì)胞得到純化，梭形細(xì)胞占95％以上。

2．3 組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)：骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞與組織工程化脫細(xì)胞基質(zhì)共培養(yǎng)12天后，大體觀察組織工程皮膚柔軟，乳白色，隨形性好。在倒置顯微鏡下選擇透光性好的部位進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在支架上呈梭形排列，生長(zhǎng)良好。HE染色可見(jiàn)骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞在表面形成了有3-5層細(xì)胞的類表皮結(jié)構(gòu)，在下層，骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞較均勻的生長(zhǎng)在組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中，形成類真皮結(jié)構(gòu)。掃描電鏡觀察可見(jiàn)在表面的孔隙中有大量的細(xì)胞附著生長(zhǎng)，細(xì)胞突起伸入四周孔隙。

3 討論

近年來(lái)，皮膚組織工程發(fā)展日新月異，國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，并取得了一定療效，組織工程皮膚研制的根本問(wèn)題就是三維支架材料和種子細(xì)胞問(wèn)題，尋找合適的支架材料和理想的種子細(xì)胞是研制組織工程皮膚的關(guān)鍵。

自1995年，Livesey等首先報(bào)道制成脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(A1lograft dermal matrix，ADM)，Wain-wright行異體移植用于燒傷患者Ⅲ度創(chuàng)面的覆蓋取得成功以來(lái)，作為皮膚替代物的脫細(xì)胞真皮以其合理的結(jié)構(gòu)，相對(duì)堅(jiān)韌的機(jī)械性及良好的組織相容性受到越來(lái)越多學(xué)者的重視。1995年美國(guó)Life-cell公司生產(chǎn)的異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(Alloderm)在臨床已廣泛應(yīng)用，成為較理想的真皮替代物。Takami等將大鼠的ADM異體移植，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1-2周完全血管化并伴隨成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)。脫細(xì)胞真皮依其材料和加工途徑可分為天然皮膚中獲取的脫細(xì)胞真皮和組織工程化的脫細(xì)胞真皮。脫細(xì)胞真皮去除了細(xì)胞成分，而保留了膠原成分，具有抗原性弱，生物相容性好，血管化速度快，可誘導(dǎo)自體組織細(xì)胞再生及減少瘢痕形成等優(yōu)點(diǎn)。而組織工程化脫細(xì)胞真皮較天然的脫細(xì)胞真皮的最大優(yōu)勢(shì)就是其ECM結(jié)構(gòu)與天然結(jié)構(gòu)接近，而組織相容性較天然的脫細(xì)胞真皮好，由于我們?cè)谥苽浣M織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)過(guò)程中，使用了人的成纖維細(xì)胞，在此過(guò)程中，牛皮來(lái)源的基質(zhì)蛋白逐漸得到降解，而同時(shí)成纖維細(xì)胞自身又分泌了膠原基質(zhì)，如果應(yīng)用于臨床，這就在很大程度上降低了原來(lái)因不同種屬所引起的免疫排斥反應(yīng)，且人的成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易，利用本方法可以得到大量的組織工程化脫細(xì)胞真皮，將解決臨床上大量需要的問(wèn)題。因此，它可作為一種良好的構(gòu)建永久性皮膚替代物的真皮支架。種子細(xì)胞的研究是皮膚組織工程的基礎(chǔ)和前提。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞亞群，屬成體干細(xì)胞，它們可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)后最終分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌管、神經(jīng)細(xì)胞。最近研究表明，骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞可定向分化為皮膚的表皮細(xì)胞、皮脂腺、濾泡上皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞；付小兵等研究證實(shí)自體移植的骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞可提高皮膚創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量。Yongbo Liu等用RT—PCR和ELISA等方法檢測(cè)了在創(chuàng)傷微環(huán)境作用下生長(zhǎng)因子在BMSCs中的表達(dá)，顯示在創(chuàng)傷微環(huán)境作用下BMSCs可分泌TGF-β1、EGF、VEGF、PDGF、KGF、FGF、HGF等，而這些生長(zhǎng)因子在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用。另外，由于間充質(zhì)干細(xì)胞取材相對(duì)簡(jiǎn)單，體外培養(yǎng)擴(kuò)增較容易，不存在倫理學(xué)的問(wèn)題，如果采用自體移植的方法，還可以避免異種異體細(xì)胞的免疫排斥問(wèn)題，因此，骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞可作為良好的皮膚組織工程的潛能種子細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)利用在組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上接種骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞，探討構(gòu)建組織工程皮膚的可能性。結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脫細(xì)胞真皮中生長(zhǎng)良好，組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對(duì)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。構(gòu)建的組織工程皮膚HE染色可見(jiàn)表面形成了有3～5層細(xì)胞類表皮結(jié)構(gòu)，下層細(xì)胞較均勻的分布在組織工程化脫細(xì)胞基質(zhì)的孔隙中，形成類真皮結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步，我們可以嘗試?yán)萌俗泽w的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和組織工程化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)復(fù)合構(gòu)建組織工程皮膚，用于臨床皮膚大面積缺損的治療，期望提高創(chuàng)面愈合的速度和質(zhì)量。但有報(bào)道表明，脫細(xì)胞真皮在應(yīng)用中還是存在著不同程度的免疫排斥等問(wèn)題，雖然我們用的組織工程化脫細(xì)胞真皮的抗原性比天然的脫細(xì)胞真皮小，但還是應(yīng)該盡量降低它的抗原性，以更好地應(yīng)用于臨床。另外，它的機(jī)械性能略差。因此，在脫細(xì)胞真皮研究中，要解決的主要問(wèn)題是盡量降低其抗原性，并增加其機(jī)械性能。另一方面，骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞尚無(wú)或未找到其完全的特異性標(biāo)志，所以目前對(duì)骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的分離及特征性描述都是以一個(gè)細(xì)胞群體的形式進(jìn)行，因此，進(jìn)一步確定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異的表面標(biāo)志和研究更有效地分離純化骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞的方法是十分必要的。