復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程皮膚修復(fù)燒傷創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：探討用復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的組織工程皮膚修復(fù)燒傷創(chuàng)面的可行性。方法：利用自行研制的燙傷儀制備燙傷創(chuàng)面，以MSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)燙傷創(chuàng)面，觀察愈合時(shí)間和收縮率等。結(jié)果：移植2周后實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面基本愈合，表皮角質(zhì)化，真皮層毛細(xì)血管增生，6周后創(chuàng)面收縮到原始面積的61％。結(jié)論：含有MSCs的組織工程皮膚移植后促進(jìn)了燒傷創(chuàng)面的愈合，獲得了較理想的愈合效果，為臨床治療提供了新的思路。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；創(chuàng)傷愈合；組織工程；動(dòng)物模型；燒傷

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-64 55(2007)04-0437-03

皮膚燒傷是臨床常見病癥之一，大面積燒傷時(shí)僅靠創(chuàng)面自身難以實(shí)現(xiàn)皮膚的再生，需要足夠的皮膚替代物進(jìn)行修復(fù)。隨著組織工程(tissueengineering，TE)技術(shù)研究的進(jìn)一步深入，TE皮膚在體外得以成功構(gòu)建并初步應(yīng)用于臨床，標(biāo)志著皮膚缺損治療的重大突破，具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來，骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cells，MSCs)因具有來源廣泛、取材方便、增殖快、分離培養(yǎng)容易等優(yōu)點(diǎn)，已成為組織工程研究中常用的種子細(xì)胞。本研究將MNCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增，以膠原凝膠為支架材料構(gòu)建組織工程皮膚，并用于皮膚燒傷缺損的治療。

1 材料和方法

1．1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：無菌條件下從豬髂骨處抽取骨髓，采用Percoll(SIGMA)分離法，經(jīng)密度梯度離心收集界面層的單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗兩次，離心收集細(xì)胞，重懸于體積分?jǐn)?shù)為100ml/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，棄去未貼壁的細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)達(dá)80％-90％融合時(shí)，用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1．2 構(gòu)建含有MSCs組織工程皮膚：取用3-5代狀態(tài)良好的骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞，以1.8×10⁶/ml的密度與提取自小牛皮的Ⅰ型膠原混合，37℃孵育30rain凝固后，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，隔天換液；在其表面以1×10⁷/ml密度接種角朊細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2天，將復(fù)合了細(xì)胞的膠原移至氣液面進(jìn)行器官培養(yǎng)，培養(yǎng)1周即獲得組織工程皮膚。

1．3 燙傷模型制備：自行研制燙傷儀，通過控制系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)金屬燙頭的溫度，計(jì)時(shí)器可以控制時(shí)間，根據(jù)調(diào)整燙頭和皮膚接觸的時(shí)間和溫度，可以制備出由淺至深的皮膚燙傷模型。術(shù)前12h禁飲食，豬麻醉后背部剃毛、清洗固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。根據(jù)以有經(jīng)驗(yàn)，模擬深Ⅱ度燒傷模型，調(diào)節(jié)燙傷儀至：溫度100℃，時(shí)間20s。選直徑50mm的燙頭，當(dāng)達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，放置在豬背部皮膚20s以獲得深達(dá)真皮深層的燒傷模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3只，共制備18個(gè)燒傷創(chuàng)面。

1．4 動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)：按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分為3組：MSCs復(fù)合膠原移植組、單純膠原移植組和空白對(duì)照組，每組6個(gè)創(chuàng)面。在創(chuàng)面分別植入復(fù)合MSCs的組織工程皮膚、單純膠原。油紗布覆蓋，打包縫合所有創(chuàng)面，空白對(duì)照組不移植任何細(xì)胞和膠原，其他處理與實(shí)驗(yàn)組相同。術(shù)后1周首次打開創(chuàng)面，常規(guī)換藥，連續(xù)觀察6周并進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1．5 術(shù)后觀察與分析：術(shù)后密切觀察創(chuàng)面情況，定期取創(chuàng)面皮膚標(biāo)本做病理學(xué)檢察，觀察愈合時(shí)間，測(cè)量各組創(chuàng)面面積計(jì)算創(chuàng)面收縮率。公式：創(chuàng)面收縮率=(A₀-A_x)/A₀×100％，A₀是原始創(chuàng)面面積，A_x是術(shù)后第X天的面積。

2 結(jié)果

2．1 骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞：原代細(xì)胞接種后為圓形，首次換液后顯微鏡下可見稀疏分布的單個(gè)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞為紡錘形、類圓形，7天后生長(zhǎng)速度加快，呈典型的成纖維細(xì)胞外觀，約10天匯合成片即可傳代。

2．2 組織工程皮膚：光鏡下可見體外培養(yǎng)的組織工程皮膚，與正常的皮膚相似，具有雙層結(jié)構(gòu)，其中表皮層較薄，真皮層較厚，表皮層和真皮層之間有基底膜，但組織工程皮膚中缺少毛囊和汗腺。

2．3 燙傷模型：在動(dòng)物皮膚表面形成直徑50mm的圓形燙傷面，呈灰白色，邊緣是紅色的充血帶。組織學(xué)檢查顯示：表皮層破壞缺失，真皮層大部分凝固性壞死。

2．4 術(shù)后大體與組織學(xué)觀察：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到實(shí)驗(yàn)結(jié)束均存活，飲食、排便正常，沒有術(shù)后感染、化膿、體液滲出等不良反應(yīng)。在移植后1周，MSCs復(fù)合的組織工程皮膚與自體皮膚較好的融合，移植物顏色與自體皮膚顏色接近，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，移植物中毛細(xì)血管的數(shù)量逐漸增多，上皮角化不明顯；移植后2周，創(chuàng)面基本愈合，移植物顏色與自體皮膚顏色非常接近，瘢痕很小，上皮增厚，角化明顯，真皮層細(xì)胞生長(zhǎng)良好，毛細(xì)血管大量增生。單純膠原組和空白對(duì)照組未完全愈合，移植區(qū)瘢痕形成，顏色較深。各組創(chuàng)面的愈合時(shí)間分別為(15.2±1.6)、(18.3±2.4)和(22.4±3.9)天，差異有顯著性意義。

2．5 創(chuàng)面收縮率：分別在移植后1周、2周、6周測(cè)量各組面積，計(jì)算創(chuàng)面收縮率。從第2周后，空白對(duì)照組收縮明顯大于其他兩組(P＜0.05)；在第6周，MSCs組和單純膠原組分別收縮到原始面積的61％和49％，而空白對(duì)照組收縮到原始面積的21％(P＜0.05)。

3 討論

組織工程皮膚是應(yīng)用組織工程學(xué)的方法，將種子細(xì)胞與適當(dāng)?shù)闹Ъ芟嘟Y(jié)合，在體外構(gòu)建成具有一定功能的皮膚替代物。將其移植于創(chuàng)面，在支架材料逐漸降解吸收的過程中，細(xì)胞能正常生長(zhǎng)、分化并形成有一定功能的皮膚組織。關(guān)于組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損的適應(yīng)證，文獻(xiàn)報(bào)道現(xiàn)有的各種組織工程皮膚產(chǎn)品幾乎適用于各種原因引起的急、慢性皮膚缺損，包括：燒傷、潰瘍、外科創(chuàng)面及皮膚疾病等。與傳統(tǒng)的治療方法相比，使用組織工程皮膚有以下優(yōu)點(diǎn)：在燒傷的治療中減少對(duì)供體組織的需求；減輕創(chuàng)面結(jié)痂和收縮現(xiàn)象；對(duì)大面積急性創(chuàng)面實(shí)現(xiàn)快速覆蓋；可作為傳遞外界生長(zhǎng)因子的載體等。

在皮膚再生的研究領(lǐng)域中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的皮膚是否相似是非常重要的。豬的皮膚在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上與人皮膚很相似。Sullivan等證明在研究皮膚創(chuàng)傷愈合中，豬是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。用本實(shí)驗(yàn)室自行研制的燙傷儀，通過控制金屬燙頭和皮膚接觸的時(shí)間和溫度，可以建立由淺至深的皮膚燒傷模型。溫度100℃，時(shí)間20s時(shí)可以重復(fù)制備達(dá)到真皮層深部的燒傷模型。

骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，可以分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等。Badivas等證明骨髓細(xì)胞可使經(jīng)久不愈的創(chuàng)面愈合和真皮重建。在皮膚缺損的模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以加速皮膚的愈合。在深度燒傷病人的傷口表面使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能促進(jìn)創(chuàng)面愈合和血管新生。在本研究中，含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程皮膚相比對(duì)照組愈合時(shí)間快，創(chuàng)面收縮小，表皮層角質(zhì)化和真皮層血管化的程度高。

骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞來源豐富，分離培養(yǎng)容易，增殖能力強(qiáng)，是組織工程領(lǐng)域中理想的種子細(xì)胞。本研究利用骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建的人工皮膚，成功修復(fù)了燒傷創(chuàng)面，收到了良好效果，為組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損提供了一種新的方法和思路。