血管緊張素對增生性瘢痕成纖維細胞纖維連接蛋白合成的影響

[摘要]目的：探討血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及其Ⅰ型、Ⅱ型受體阻斷劑和鈣調神經磷酸激酶(CaN)的阻滯劑環(huán)胞素A(CsA)對增生性瘢痕來源的成纖維細胞纖維連接蛋白mRNA和蛋白表達的作用。方法：體外分離培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細胞，分別將一定濃度的Ang Ⅱ(10^-9-10^-5l/L)，和Ang Ⅱ 10^-6mmol/L加上不同阻滯劑losartan、PD123319、環(huán)胞素A(濃度均為10^-5mmol/L)加入細胞培養(yǎng)液中刺激48h，分別采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及Westernblot印跡方法檢測增生性瘢痕成纖維細胞纖維連接蛋白(FN)的mRNA及蛋白表達。結果：體外成功地培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細胞。經Ang Ⅱ刺激48h后，F(xiàn)N mRNA和蛋白表達量明顯增高，增高程度與AngII濃度呈正比；加入losaartan和環(huán)胞素A后，F(xiàn)N原mRNA和蛋白表達量較單用AngⅡ組下降，而加入PD123319后，F(xiàn)NmRNA和蛋白表達量較單用AngⅡ組無明顯改變。結論：Ang Ⅱ可促增生性瘢痕成纖維細胞的FN合成，可能在增生性瘢痕的發(fā)展過程中起重要作用，該作用主要通過AngⅡ的Ⅰ型受體介導完成，該作用可能與CaN信號通路有關。

[關鍵詞]血管緊張素Ⅱ；逆轉錄聚合酶鏈反應；增生性瘢痕；成纖維細胞；纖維連接蛋白

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2007)04-0433-04

增生性瘢痕是以成纖維細胞過度增殖和細胞外基質過度沉積為主要特征的結締組織疾病。其發(fā)病機制至今尚未徹底闡明。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)作為腎素一血管緊張素系統(tǒng)中重要的因子，其經典作用是引起血管收縮和調節(jié)水鹽平衡。近來研究認為，Ang Ⅱ作為一種生長因子，是一種強烈的促有絲分裂原，在促進心肌間質、腎臟間質、肺間質以及血管壁纖維化的過程中發(fā)揮重要作用。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)為一種大分子非膠原糖蛋白，是細胞外基質的重要成分。本研究通過體外實驗，觀察Ang Ⅱ及其受體拮抗劑、CsA對成纖維細胞合成FN的影響。

1 材料和方法

1．1 主要試劑：Ang Ⅱ(美國Anaspec)；Losartan、PDl23319、csA(美國sigma)；大鼠抗人FN抗體(美國Neomarkers)；兔抗大鼠IgG(北京中杉)；DMFM培養(yǎng)基(美國Hyclone)；胎牛血清(美國Hyclone)；醫(yī)用凈化工作臺(蘇州凈化設備公司YJ-875型)；CO₂培養(yǎng)箱(美國SHEL—LABl815TC型)。

1．2 取材標準：①增生性瘢痕，瘢痕色澤紅，質硬，高出皮膚表面，均為燒傷創(chuàng)面愈合已超過3個月，但瘢痕仍持續(xù)增生，瘢痕局部無感染和潰瘍，均未曾使用抗瘢痕藥物、彈力加壓、放療等方法治療；②病人無高血壓、肝硬化、肺纖維化、慢性腎炎、心肌梗塞等疾??；③病人無全身感染、腫瘤；④無結締組織疾病或可能影響結締組織代謝的疾病，未進行過全身應用皮質類固醇等藥物治療。

1．3 成纖維細胞分離、培養(yǎng)：采用組織塊法進行原代培養(yǎng)，將手術中切下的符合條件的增生性瘢痕在無菌條件下切除其表皮，在少量胎牛血清中將標本切成1mm³左右的組織塊置于培養(yǎng)瓶中，在95％空氣、5％CO₂、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)6-8h，使組織塊牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基適量，繼續(xù)培養(yǎng)，3-4天換液1次，2-3周后，原代細胞生長成單層，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例傳代培養(yǎng)，此后每2-3天換液1次，每4～5天分種傳代1次，實驗用第3-5代細胞。

1．4 實驗分組：實驗分為四組：①對照組：10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；②Ang Ⅱ組：培養(yǎng)液中加入Ang Ⅱ，濃度范圍(10^-9 mol/L-10^-5mol/L)；③Ang Ⅱ+洛沙坦(losartan)組：培養(yǎng)液中同時加入Ang Ⅱ(10^-6mol/L)合losartan(10^-5mol/L)；④Ang Ⅱ+PDl23319組：培養(yǎng)液中同時加入Ang Ⅱ(10^-6mol/L)和PDl233 19(10^-5mol/L)；⑤Ang Ⅱ+CsA組培養(yǎng)液中同時加入Ang Ⅱ(10^-6mol/L)合CsA(10^-5mol/L)。

1．5 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測FN的mRNA的表達：選取生長較好的成纖維細胞，采用Trizol法提取細胞的總RNA，用紫外分光光度儀測量總RNA的濃度和純度，-80℃保存。按照試劑盒操作說明，根據FN的相應基因序列合成引物，逆轉錄為cDNA，PCR法擴增。FN的引物設計：上游引物序列：5’-GAT GTG ATG TCG ATT CCA T一3’下游引物序列：5’-GAT CT C TGG TCC ATG AAG AT-3’，擴增片段為1107bp。內參照β-actin引物上游序列5’-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG ACA-3’，下游序列為：5’-GCA CGA AGG CTC ATC ATT CAAAA-3’，產物446bp。引物由北京華大基因合成。RT-PCR反應條件：94℃預變性3min，然后進入30個循環(huán)：94℃ lmin，57℃退火lmin，72℃lmin。循環(huán)完畢，72℃延伸7min。1.5％瓊脂糖膠上電泳，紫外燈下觀察結果并攝像。用凝膠圖像分析系統(tǒng)對目的基因的PCR產物進行灰度測定，采用4.1版本Quantity One軟件(Bio-Rad)分析各條帶光密度值與內參片段的面積灰度比值，基因表達量以該比值來表示。

1．6 Western blot檢測FN蛋白表達：細胞用SDS溶液裂解后，離心取上清。蛋白濃度采用BCA法測定。取50μg蛋白，經SDS-PAGE(12％分離膠，4％積層膠)分離后，采用半干電轉方法將蛋白轉移到PVDF膜上。用含有5％BSA的TBST封閉后，加入1:500稀釋的抗AT1、AT2抗體和抗β-actin抗體于室溫下孵育2h，隨后加入1:300稀釋的二抗于室溫孵育1h，最后加入ECL試劑顯影。采用4.1版本Ouantity One軟件(Bio-Rad)分析各條帶光密度值，β-actin蛋白表達作為內參照。

1．7 統(tǒng)計學處理：SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件分析。數(shù)據以(x±s)表示，進行t檢驗、相關分析及多個實驗組與同一對照組的比較的方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 不同濃度Ang Ⅱ作用于成纖維細胞后FN的mRNA表達結果：總RNA在260和280nm波長下的吸光度比值大于1.8。甲醛變性提示mRNA表達完整，可用于半定量分析。AngII濃度為10^-8mol/L時，F(xiàn)N的mRNA表達量開始增加，隨著Ang Ⅱ加入濃度的提高，成纖維細胞FN的mRNA表達也隨之增加，與對照組差異顯著。

2．2 不同干擾因素與Ana Ⅱ共同作用于成纖維細胞后FN的mRNA表達結果：加用losartan后，成纖維細胞FN的mRNA表達較單用AngⅡ組表達下降，與對照組接近，加用CsA后，Ang Ⅱ mRNA表達也下降，但表達仍然高于對照組，加入PDl23319后對結果沒有影響。

2．3 不同濃度Ang Ⅱ作用于成纖維細胞后FN的蛋白表達結果：Ang Ⅱ濃度為10^-8mol/L時，F(xiàn)N蛋白的表達量開始增加，隨著Ang Ⅱ加入濃度的提高成纖維細胞FN的蛋白表達也隨之增加，與對照組差異顯著。

2．4 不同干擾因素與Ang Ⅱ共同作用于成纖維細胞后FN的蛋白表達結果：加用losartan后，成纖維細胞FN的表達較單用Ang Ⅱ組表達下降，與對照組接近，加用CsA后，Ang Ⅱ mRNA表達也下降，但表達仍然高于對照組，但加入PD123319對結果沒有影響。

3 討論

FN是炎癥條件下由成纖維細胞等分泌產生的細胞外基質成分，具有多種生物學功能，對介導細胞增殖和其他其他外基質成分的沉積以及在傷口愈合過程中起重要作用。有關文獻報道，皮膚損傷后，傷口處沉積大量FN，誘導成纖維細胞、上皮細胞向傷口移動，并促進其增殖。此時的成纖維細胞、肌成纖維細胞和真皮內都含有豐富的FN。一旦上皮細胞再生完成、新生血管形成，成纖維細胞、上皮細胞和血管內皮細胞的FN隨即消失。肉芽組織瘢痕化過程中，纖維化明顯形成前組織中FN開始增多，當膠原增多、沉積形成緊密的束壯排列時，F(xiàn)N減少或消失。

腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAN)是機體調節(jié)血管張力和水鈉代謝的內分泌系統(tǒng)的組成部分，隨血液循環(huán)發(fā)揮作用。血管緊張素Ⅱ是RAS系統(tǒng)的主要活性成分。循環(huán)中的Ang Ⅱ主要來自肝臟，但研究發(fā)現(xiàn)局部組織也可自身合成分泌Ang Ⅱ。Stecklings等利用RT-PCR技術檢測到血管緊張素原的mRNA在體外培養(yǎng)的原代角質形成細胞、黑素細胞、真皮成纖維細胞和真皮微血管內皮細胞上都有表達。Phillips等通過實驗也得到相似的結果。Ang Ⅱ受體主要分為AT1、AT2兩種亞型，AT1受體是一種膜受體，它具有激素受體的所有特征。它介導血管緊張素Ⅱ受體的大部分生理功能。Stecklings等通過RT-PCR檢測出皮膚角質細胞、黑素細胞、真皮成纖維細胞及微血管內皮細胞均能表達AT1和AT2的mRNA。

目前，以Ang Ⅱ為主要因子的RAS在一些組織器官的纖維化過程中的重要作用正逐漸引起越來越多學者的關注。在纖維化過程中，局部組織的RAS激活，包括Ang Ⅱ在內的一些因子表達水平升高，表明局部RAS可能參與了組織器官纖維化和/或結構重構過程。這樣的器官包括肝臟、腎臟、心臟、肺和皮膚。ACE抑制劑、Ang Ⅱ受體拮抗劑和阻斷劑等可通過不同方式延緩和/或抑制器官纖維化的發(fā)生，進一步說明Ang Ⅱ有促器官纖維化的作用。增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)面愈合后瘢痕持續(xù)增生的一種病理表現(xiàn)，其機制目前還不清楚。在皮膚組織中成纖維細胞占全部細胞數(shù)的40％-60％，是重要的修復細胞。成纖維細胞大量合成細胞外基質創(chuàng)傷修復中主要活動之一。已證明皮膚是Ang Ⅱ的靶器官之一，Ang Ⅱ能促進皮膚成纖維細胞的增殖和細胞外基質的沉積，提示Ang Ⅱ在人類瘢痕形成可能具有獨特的作用。

在本實驗中，來源于人增生性瘢痕的成纖維細胞受到濃度高于10^-8mol/L的Ang Ⅱ刺激時FN的mRNA和蛋白表達均增加，且與Ang Ⅱ的濃度呈正相關。Ang Ⅱ的Ⅰ型受體拮抗劑losartan能幾乎完全阻斷該作用，Ang Ⅱ的Ⅱ型受體拮抗劑PDl23319對該作用幾乎沒有影響，提示AngⅡ的促成纖維細胞合成FN的作用主要是通過AT1受體介導的。環(huán)胞素A是鈣調神經磷酸激酶(calcineurin，CaN)的阻滯劑，在Ang Ⅱ刺激時成纖維細胞時同時加入CsA后，F(xiàn)N的mRNA和蛋白表達均較單純用Ang Ⅱ組下降，但依然高于對照組，提示CaN信號通路可能部分參與了Ang Ⅱ促成纖維細胞合成FN的過程。

綜上所述，Ang Ⅱ參與創(chuàng)面愈合及促纖維化作用已經日益引起國內外學者的關注，我們的實驗結果提示Ang Ⅱ能促進成纖維細胞合成細胞外基質的重要成分之一FN的合成。深層次探討皮膚局部的RAS系統(tǒng)對創(chuàng)面修復及增生性瘢痕的作用，將有助于豐富創(chuàng)面修復的網絡調控機制，為探索皮膚創(chuàng)面及瘢痕治療方面探索新的途徑。