前移大鼠下頜后髁突軟骨血管內皮細胞生長因子受體Ⅱ的表達

[摘要]目的：探討引導大鼠下頜前伸后，髁突軟骨中血管內皮細胞生長因子受體Ⅱ(KDR/F1K-1)表達水平的變化。方法：50只35天齡雄性SD大鼠隨機分為5組，每組隨機分為實驗組(5只)和對照組(5只)；實驗組大鼠24h佩戴自制功能性矯治器引導下頜前伸；實驗后3、7、14、21和30天分別處死各組大鼠；免疫組化方法檢測髁突軟骨中FIK-1的表達情況。結果：對照組髁突軟骨F1K-1表達隨時間延長而減弱，后部區(qū)域F1K-1表達強于前部和中部；實驗后第14天，21天和30天實驗組F1k-1表達強于相應對照組(P＜0.05)，21天時其增強幅度最大。結論：下頜前伸后大鼠髁突軟骨細胞F1k-1表達增強，說明其介導了VEGF引發(fā)的軟骨內骨化過程。

[關鍵詞]功能性矯治；血管內皮細胞生長因子受體Ⅱ(KDR/F1k-1)；下頜前伸

[中圖分類號]Q813.1 R782.13 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2007)04-0440-03

臨床上利用功能性矯治器引導下頜骨前伸可促進髁突軟骨的生長代謝，增加下頜骨長度，從而達到矯治Ⅱ類錯牙合的目的。研究發(fā)現(xiàn)下頜前伸可以誘導髁突組織中新骨形成增加；軟骨細胞表達VEGF，從而誘導新生血管形成，被認為是骨取代軟骨的標志。

VEGF的生物學功能是通過其特異性受體發(fā)揮的。VEGF的受體主要有三種：VEGFR-1(fms-like-tyrosine kinase，F(xiàn)1t-i)，VEGFR-2(kinase insertdomain-containing receptor/fetal liver kinase，KDR/F1k-1)和VEGFR-3(F1t-4)。F1t-1合KDR/F1k-1兩者都是VEGF高特異性的受體，F(xiàn)1t-4在淋巴管的生成中發(fā)揮主要作用；其中F1k-l是VEGF最重要的受體，具有強烈的酪氨酸激酶活性，是VEGF誘導內皮細胞增殖的主要調節(jié)劑，在下頜髁突軟骨內骨化過程中血管和破骨細胞侵入軟骨過程中發(fā)揮了重要的作用。所以了解下頜前伸后髁突軟骨F1k-i表達變化的規(guī)律，對于評價VEGF在功能矯形前伸下頜后髁突組織改建過程中的作用具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1．1 實驗動物的選擇與分組：35天齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)50只，根據(jù)實驗周期(3、7、14、21和30天)分為5組，每組內隨機分為實驗組和對照組。

1．2 實驗方法

1．2．1 咬合前導裝置：參照Rabie等方法，上頜斜面導板由甲基丙烯酸甲酯材料制成，包括斜面導板和固位裝置組成；其中固位裝置包括板內固位鉤、口外鏈狀橡皮圈、防護頸圈。

1．2．2 操作方法：速眠新Ⅱ(0.3-0.8ml/kg)(長春農牧大學獸醫(yī)研究所)腹腔注射麻醉。利用粘結材料將斜面導板粘固于上切牙，通過固位鉤將鏈狀橡皮圈經鼻上頜復合體與防護頸圈連接，使得斜面導板獲得穩(wěn)定的固位，防護頸圈能夠有效地防止大鼠前爪對裝置的破壞及對面部組織的傷害。

實驗組動物佩戴上頜斜面導板式功能矯治器，每天持續(xù)佩戴24h，對照組動物不戴。所有動物都以軟食飼養(yǎng)，自由飲水，同環(huán)境下飼養(yǎng)至實驗結束。

1．2．3 組織處理：五組動物分別在實驗后3、7、14、2l和30天處死，深度麻醉下經主動脈插管灌注0.1mol/L的PBS緩沖液(200ml/只)，40g/L多聚甲醛(400ml/只)；充分暴露顴弓，整塊取出雙側顳下頜關節(jié)；40g/L多聚甲醛中固定24h：Kristense液中脫鈣1周，常規(guī)脫水；石蠟包埋時注意調整暴露的顴弓表面直至其與蠟塊的上表面平行，髁突縱向切片厚5μm。

1．2．4 免疫組織化學染色：按免疫組化ABC法常規(guī)實驗步驟，對組織切片進行F1k-1免疫組織化學染色。兔抗F1k-1多克隆抗體(1:50)購自博士德生物試劑公司，SABC免疫組化試劑盒為博士德生物試劑公司產品?？瞻讓φ眨河肞BS代替一抗。

1．2．5 圖像分析：Olympus CX31型光學顯微鏡下應用Pixera PVC100C系統(tǒng)采圖，各組切片采集100倍圖像，Photoshop8.0軟件選取TMJ髁突軟骨前、中、后部進行觀測，每部分選擇連續(xù)3個64px×64px大小的區(qū)域，計數(shù)各區(qū)域棕色深染的陽性細胞數(shù)。

1．3 統(tǒng)計分析：SPSS11.5統(tǒng)計軟件，實驗組與對照組組間比較用t檢驗，對照組各時間點的組內比較用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

F1k-1陽性細胞胞漿著色為棕黃色，著色水平明顯高于背景水平。空白對照(PBS代替一抗)組未見陽性著色顆粒。

2．1 F1k-1在大鼠髁突軟骨中的分布：F1k-1在髁突軟骨中主要在成熟層和肥大層表達，增殖層未見表達，表現(xiàn)為軟骨細胞胞漿和胞膜著色，DAB顯色為棕黃色；纖維層中未見表達。

2．2 F1k-1在髁突軟骨前部的表達：對照組中F1k-1的表達呈現(xiàn)出增齡性變化，隨著觀測時間點向后推移，表達F1k-1的陽性細胞數(shù)減少(P＜0.01)，到達21天以后趨于平穩(wěn)；實驗組中F1k-1的表達在21天組和30天組要強于對照組(P＜0.05)。

2．3 F1k-1在髁突軟骨中部的表達：下頜前伸導致了實驗組髁突軟骨中部F1k-1的表達增強；實驗后第3天和第7天F1k-l表達與對照組相比未見明顯差異(P＞0.05)；實驗后第14天，21天和30天F1k-1表達較相應的對照組明顯增強(P＜0.01)。

2．4 F1k-1在髁突軟骨后部的表達：同一觀測時間點內髁突軟骨的后部F1k-1的表達比中部和前部要強烈(P＜0.05)；下頜前伸后髁突軟骨后部在第3天和第7天F1k一1表達與對照組相比未見明顯差異(P＞0.05)；實驗后第14天，21天和30天F1k-1表達較相應的對照組明顯增強(P＜0.01)，其中21天時實驗組F1k—1的表達較對照組增強的幅度最大。

3 討論

在骨骼生長和更新的過程中血管生成對于骨取代軟骨過程是必不可少的。通常認為軟骨是一種無血管組織，并且合成血管發(fā)生抑制劑，然而近來有研究表明軟骨下的血管內皮細胞與軟骨細胞的生長和分化密切相關。這些結果證明了軟骨細胞分化和內皮細胞侵襲二者之間存在著共存并相互制衡的關系，其共同導致了軟骨內骨化過程的發(fā)生。VEGF由肥大軟骨細胞合成分泌并釋放到其周圍的介質中，對內皮細胞具有強趨化性。

F1k-1是VEGF的主要功能受體，其主要分布于內皮細胞表面，VEGF對內皮細胞的促進生長、增殖、分化等作用主要是由F1k-1介導的。F1k-1和VEGF結合后發(fā)生二聚體化，胞內的酪氨酸殘基自身磷酸化。VEGF的單克隆抗體可以阻斷VEGF誘導的血管通透性增加和VEGF與F1k-l的相互作用，卻不能阻斷VEGF與F1t-1的相互作用，表明F1k-1在調節(jié)VEGF誘導的血管通透性增加中起主要作用。VEGF受體的活化導致了蛋白酶的產生，而這正是血管發(fā)生的第一階段中血管組織基底膜分解、血管發(fā)生所需的特殊整合素的表達以及細胞增殖和遷移所必需的。

本實驗觀測了大鼠下頜前伸過程中F1k-l的表達變化并將其與自然生長狀況下的表達情況進行了比較。結果顯示F1k-1主要表達于髁突軟骨的成熟層和肥大層，對照組中F1k-1在髁突后部區(qū)域的表達要強于中部和前部，這表明VEGF在軟骨后部區(qū)域作用更加廣泛，而這種作用是通過其特異性受體F1k-1來發(fā)揮的。

本實驗中，通過對5個時間點對照組F1k-1表達情況的比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1k-1表達量逐漸減少，這可能是由于大鼠由生長期過渡到成年期這一過程中大鼠髁突組織生長、改建速度減緩而分泌活動減弱所造成的。下頜前伸后關節(jié)盤受到牽拉，軟骨細胞周圍機械力發(fā)生變化引起細胞反應增強，進而導致軟骨細胞增加F1k-l的表達，VEGF則通過F1k-1發(fā)揮作用，促進軟骨內骨化進程。F1k-1的表達在髁突軟骨后部區(qū)域增強的更為明顯，這可能是由于下頜前伸后髁突軟骨主要承力區(qū)由中部轉移為后部，后部軟骨細胞受到的機械力刺激增加，導致其細胞功能增加更為明顯，進而表達F1k-1的量增加的幅度更大，其在21天時實驗組后部區(qū)域F1k-1表達量增強最大，可能是下頜前伸過程中表達增強的VEGF誘導其特異性受體F1k-1表達增強造成的。F1k-1表達的增強意味著其所介導的軟骨下骨形成增加，這也表明后部區(qū)域比中部及前部生長更為明顯。