用高效液相色譜儀測(cè)定葡萄休眠芽的脫落酸含量

摘要：以6年生“赤霞珠”葡萄的休眠芽為材料，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定葡萄休眠芽中的脫落酸(ABA)含量。葡萄休眠芽中的脫落酸用80％冷甲醇抽提，抽提液在石油醚和水相之間分配，后經(jīng)過(guò)吡咯烷酮(PVP)凈化和乙酸乙酯萃取，最后用甲醇、水作為流動(dòng)相，在ODS－C₁₈柱上進(jìn)行分離，用紫外檢測(cè)器在260nm波長(zhǎng)下檢測(cè)、鑒定。結(jié)果表明，高效液相色譜法檢測(cè)赤霞珠葡萄休眠芽中內(nèi)脫落酸，含量為2.177pμg·g_1-。

關(guān)鍵詞：脫落酸(ABA)；高效液相色譜法(HPLC)；葡萄；休眠芽

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002－2910(2007)03－O004－03

檢測(cè)植物的內(nèi)源激素主要有生物鑒定法，氣相色譜法(GC)，酶聯(lián)免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLＣ)。相對(duì)而言，高效液相色譜法靈敏度高、專(zhuān)一性強(qiáng)和重復(fù)性好，是理想的分析方法，目前應(yīng)用較廣泛。

葡萄冬芽的休眠與生長(zhǎng)抑制物有關(guān)，堀居內(nèi)昭發(fā)現(xiàn)，這種抑制物質(zhì)是脫落酸(ABA)。于是筆者通過(guò)測(cè)定葡萄休眠芽?jī)?nèi)的脫落酸含量，研究休眠與內(nèi)源激素的關(guān)系。

1 材料與方法

2004年12月30日于南陽(yáng)市園林局植物園選取健壯成熟的“赤霞珠”葡萄(6年樹(shù)齡)的休眠芽為試材，用島津LC－10AT高效液相色譜儀檢測(cè)。色譜條件為色譜柱ODS－C₁₈柱；流動(dòng)相中甲醇與水(1％醋酸)的比例為35：65(V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)在260nm處；柱溫45℃；流速每分鐘0.9ml；進(jìn)樣20tμL。

準(zhǔn)確稱(chēng)取脫落酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品1.00mg于25ml容量瓶中，用甲醇(色譜純)定容至25ml，配成0.4g／L的脫落酸標(biāo)準(zhǔn)母液。使用時(shí)再用甲醇配成不同濃度的脫落酸標(biāo)準(zhǔn)液。

葡萄休眠芽?jī)?nèi)脫落酸的提取工藝流程為：準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄冬芽3.00g，研碎后加入80％甲醇40ml。抽濾時(shí)在漏斗中墊4層濾紙，以充分除去樣品中的懸浮顆粒；乙酸乙酯萃取為等體積萃取；吡咯烷酮(PVP)的用量為0.6g，攪拌10分鐘后抽濾。具體流程如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件選擇

吸收波長(zhǎng)的選擇。取脫落酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液在紫外分光光度計(jì)上光譜掃描，在波長(zhǎng)240－270nm處脫落酸有較高吸收峰。結(jié)合高效液相色譜分離條件下脫落酸與雜質(zhì)峰的分離情況，選擇在260nm處測(cè)定葡萄休眠芽脫落酸含量。

選擇反相液相色譜法通常使用的流動(dòng)相(甲醇：水)，并加入一定量的乙酸，使脫落酸以分子形態(tài)存在，這樣檢出的峰形好且不拖尾。經(jīng)大量試驗(yàn)證明：對(duì)葡萄休眠芽的提取液來(lái)說(shuō)，當(dāng)甲醇與水的比例為35：65(V/V)時(shí)，脫落酸與鄰近的雜質(zhì)峰分離效果較好。

流動(dòng)相的pH值為3.0時(shí)脫落酸處于分子狀態(tài)，此時(shí)檢出的峰形較好，不拖尾，同時(shí)考慮到ODS－C₁₈柱的耐酸性和使用壽命，在流動(dòng)相中加入1％的醋酸，使pH值為3.0。

分別在流速為每分鐘0.85ml、0.90ml和1.00ml下進(jìn)行分析。試驗(yàn)證明：流速為每分鐘0.9ml條件下，脫落酸的峰形較好，分離度較高。發(fā)現(xiàn)柱溫在45％時(shí)，檢出峰分離好，因此選取柱溫為45℃。

2.2 脫落酸的分離與測(cè)定

在上述液相色譜檢測(cè)條件下，對(duì)脫落酸的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定和分析，得出保留時(shí)間為3.479分鐘，如圖1所示。對(duì)葡萄休眠芽提取物中的脫落酸進(jìn)行測(cè)定，相應(yīng)的保留時(shí)間為3.432分鐘，如圖2所示。

分別以脫落酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液25μg/L、30μg/L、35μg/L、40μg/L、45μg/L、50μg/L、55μg/L和60μg/L進(jìn)樣，計(jì)算峰面積(Y)和濃度(x)的一元線(xiàn)性回歸方程。所得回歸方程式為Y=48.83X+32.94，相關(guān)系數(shù)R=0.995。

2.3 回收試驗(yàn)

于0.5ml的樣品提取液中，加入不同濃度的脫落酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用與樣品相同的色譜條件進(jìn)行回收試驗(yàn)，重復(fù)4次，結(jié)果平均回收率為92.48％，達(dá)到了內(nèi)源激素分析測(cè)定所要求的回收率。

2.4 葡萄休眠芽的脫落酸含量

根據(jù)色譜圖(圖2)所對(duì)應(yīng)的峰面積和回歸方程，計(jì)算得知葡萄休眠芽的脫落酸含量為2.177μg·g^-1(鮮重)。

3 小結(jié)與討論

以甲醇為提取劑提取葡萄休眠芽中的脫落酸，通過(guò)石油醚凈化，吡咯烷酮純化，乙酸乙酯富集，用高效液相色譜分析，在以甲醇：水(35：65，V/V)為流動(dòng)相，流速為每分鐘0.9ml，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm的條件下，測(cè)定葡萄休眠芽中的脫落酸，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，符合植物激素分析的要求。

本試驗(yàn)用80％甲醇提取脫落酸，用石油醚和乙酸乙酯做萃取溶劑。乙酸乙酯與甲醇互溶，而不溶于水，因此80％的甲醇提取液需要經(jīng)過(guò)減壓濃縮至接近水相后，再與乙酸乙酯進(jìn)行萃取。脫落酸易溶于堿性溶液和甲醇而難溶于水，因而在對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮時(shí)需要保留部分的甲醇溶液。當(dāng)將提取液減壓濃縮至原體積的1/3，并與乙酸乙酯萃取后，得到相對(duì)較好的分層效果。在萃取過(guò)程中若有輕微的乳化現(xiàn)象，可加入飽和的氯化鈉溶液來(lái)破除乳化。在試驗(yàn)中，分別利用石油醚和吡咯烷酮去除葡萄休眠芽提取液中的各種色素和酚類(lèi)物質(zhì)。在堿性條件下，利用乙酸乙酯去除酯溶性雜質(zhì)，再用乙酸乙酯富集，最后甲醇溶解并定容而得到樣品溶液。樣品前處理及用高效液相色譜儀分析測(cè)定時(shí)要特別注意提取劑和流動(dòng)相的pH值。脫落酸在pH值8.0的條件下，是以離子狀態(tài)存在；在pH值3.0的條件下是以分子狀態(tài)存在。因此在試驗(yàn)中，用吡咯烷酮時(shí)，調(diào)節(jié)pH值至堿性，以減少脫落酸被吡咯烷酮吸附的量。而在利用乙酸乙酯進(jìn)行萃取時(shí)，則調(diào)節(jié)pH值為8.0，使脫落酸易溶于堿水溶液中，取堿水相。再調(diào)節(jié)pH值為3，0使脫落酸處于分子狀態(tài)，以減少脫落酸在水相中的分配，最后取乙酸乙酯相，從而提高了回收率。用高效液相色譜儀分析樣品時(shí)，在流動(dòng)相中加入1％的醋酸，使脫落酸以分子狀態(tài)存在，此時(shí)檢出的峰形較好。