一測多評法測定甘肅地區(qū)淫羊藿黃酮類成分的含量

張敏 劉惠娟 王永福 石巖

摘要 摘要[目的]建立一測多評法同時測定淫羊藿中6種黃酮類成分的方法，并對甘肅地區(qū)的21批藥材進行定量分析。[方法]Agilent Zorbax色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為水（A）、乙腈（B），梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長270 nm，進樣量10 μL。分別考察不同條件對相對校正因子的影響。評價一測多評法和標準曲線法在含量測定結(jié)果上的差異。[結(jié)果]建立了以淫羊藿苷為內(nèi)標參照物，同時測定6種黃酮類成分的一測多評法。不同條件下相對校正因子的RSD小于2.63%。多點矯正-一測多評法、斜率矯正-一測多評法和標準曲線法測定21批甘肅地區(qū)淫羊藿樣品含量，其RSD小于3%，無明顯差異。[結(jié)論]一測多評法結(jié)果準確、操作簡單易行，可用于淫羊藿中黃酮類成分的含量測定。

關(guān)鍵詞 一測多評;淫羊藿;黃酮類成分;含量測定;甘肅地區(qū)

中圖分類號 R-284.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）11-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.049

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Determination of Flavonoids of Epimedium in Gansu by Quantitative Analysis of Multi-components with a Single Marker（QAMS）

ZHANG Min1， LIU Hui-juan1， WANG Yong-fu2 et al

（1.Gansu Medical College， Pingliang，Gansu 744000;2.Gansu Digital Herbal Testing Center Co.， Ltd.， Dingxi，Gansu 743000）

Abstract [Objective]To establish a method for simultaneous determination of 6 flavonoids in Epimedium by QAMS， and to determine the content of 21 batches of medicinal materials in Gansu Province. [Method]Agilent Zorbax column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， mobile phase were water （A） and acetonitrile （B）， gradient elution， flow rate was 0.8 mL/min， the detection wavelength was set at 270 nm， injection volume 10 μL.The effects of different conditions on relative correction factors were investigated.The difference between the standard curve method and QAMS was evaluated in content determination. [Result] A method was established to determine 6 flavonoids by using icariin as internal reference based on QAMS.The RSD under different conditions was less than 2.63%. The content of 21 batches of Epimedium in Gansu Province was determined by QAMS and standard curve method， the RSD of two sets was less than 3% and there was no significant difference. [Conclusion] QAMS is accurate， easy to operate， and can be used to determine the content of flavonoids in Epimedium.

Key words QAMS;Epimedium;Flavonoids;Content determination;Gansu area

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉[1]，其基源復(fù)雜、分布廣泛、質(zhì)量差別大[2]。而甘肅地區(qū)的淫羊藿質(zhì)量一直為市場所認可[3]。

淫羊藿的主要藥效成分為黃酮類，國內(nèi)外大量研究都集中在此類成分研究上[4-5]。2015版《中國藥典》以淫羊藿苷≥0.5%作為含量合格的指標，造成市面上多數(shù)藥材質(zhì)量不合格[6]?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿中具有生理活性的成分不局限在淫羊藿苷。朝藿定C抗骨質(zhì)疏松效果明顯，寶霍苷I對鼻咽癌、口腔上皮癌有作用[7-8]。因此，全面考察淫羊藿中黃酮類成分，才能科學地反映藥材質(zhì)量。

一測多評法（QAMS）近年來被廣泛應(yīng)用于中藥多種成分的定量分析中[9-11]。該法基于各成分之間的函數(shù)關(guān)系，選擇一種價廉易得的內(nèi)標參照物，同時測定其他多種成分，操作成本低，應(yīng)用廣泛[12]。筆者以淫羊藿苷為內(nèi)標參照物，分別測定朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷I的相對校正因子，考察不同條件下的耐用性，建立一測多評法;在此基礎(chǔ)上，采用一測多評法和標準曲線法定量分析甘肅地區(qū)21批淫羊藿樣品，比較測定結(jié)果的差異，評價黃酮類成分的含量，為甘肅地區(qū)淫羊藿質(zhì)量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。該試驗所使用的淫羊藿藥材來自甘肅數(shù)字本草檢驗中心有限公司。經(jīng)甘肅醫(yī)學院生藥學教研室鑒定均為淫羊藿種屬淫羊藿。

1.1.2 主要儀器。高效液相色譜儀為Agilent 1260（配置DAD檢測器，美國Agilent公司），Agilent Zorbax色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）;KQ-50DE超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）;CAP225D電子天平（十萬分之一，德國Sartorial公司）;超純水系統(tǒng)（Merck Millipore公司）。

1.1.3

主要試劑。乙腈、甲醇為色譜純，德國Merck公司;乙醇為分析純，南京奧佳化工有限公司;朝藿定A1（批號P02J9S64790）、朝藿定A（批號P02J9F64787）、朝藿定B（批號P02J9A64781）、朝藿定C（批號P02J9D65890）、淫羊藿苷（批號T05D9B76755）、寶霍苷Ⅰ（批號T05S65007）為對照品，上海葉源生物科技有限公司，純度均在98%以上。

1.2 方法

1.2.1

對照品溶液的制備。分別精密稱取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ適量，加甲醇制成混合對照品溶液，相應(yīng)的濃度為51.50、107.03、250.10、257.54、309.04和10.82 μg/mL。

1.2.2

供試品溶液的制備。取淫羊藿粉末（過3號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，精密稱取重量，超聲處理30 min，放冷至室溫。再次稱定重量，用70%乙醇補足失重，搖勻。用0.45 μm微孔有機濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.2.3

色譜分析條件。Agilent Zorbax色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為水（A）、乙腈（B），梯度洗脫（0～25 min，21%～30%B;25～35 min，30%～70%B;35～45 min，70%～90%B;45～50 min，90%B），流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長270 nm，進樣量10 μL。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1

線性關(guān)系的考察。取“1.2.1”對照品溶液制備項下的混合對照品溶液，對半稀釋法稀釋6次，得到不同濃度的對照品溶液。按照“1.2.3”色譜條件進行測試，每個點平行3次。以平均峰面積（Y）為縱坐標、對照品濃度（X，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗。精密稱取1號樣品，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理。分別在0、2、4、8、12、24、48 h進樣分析，記錄朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的峰面積，并計算RSD。

1.2.4.3

精密度試驗。取1號樣品，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理，“1.2.3”色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，記錄朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的峰面積，并計算RSD。

1.2.4.4

重復(fù)性試驗。取1號樣品6份，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理，“1.2.3”色譜條件分析，計算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的含量，并計算RSD。

1.2.4.5

加樣回收試驗。精密稱取已知含量淫羊藿樣品6份（1號樣品），分別加入混合對照液適量，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法處理，“1.2.3”色譜條件分析，測定朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的含量，計算加樣回收率。

1.2.5 相對校正因子和相對保留時間的計算。

1.2.5.1

多點矯正法計算相對校正因子。取“1.2.4.1”項下的系列混合對照品溶液，進樣分析。以淫羊藿苷為內(nèi)標參照物，利用公式fsk=fsfk=As/CsAk/Ck計算相對校正因子fsk。其中，As為內(nèi)標參照物的峰面積，Cs為內(nèi)標參照物的濃度，Ak為被測物的峰面積，Ck為被測物的濃度。

1.2.5.2

斜率矯正法計算相對校正因子。通過標準曲線方程計算斜率之比，即fsk=αs/αk，其中，αs為內(nèi)標參照物的斜率，αk為待測成分的斜率。

1.2.5.3

相對保留時間的計算。利用公式Rks=tRk/tRs計算相對保留時間Rks，其中tRk為其他組分保留時間，tRs為參照物保留時間。

1.2.6

耐用性考察?？疾?種不同儀器（Agilent1260、島津LC2010A、Waters 2695）、色譜柱（Agilent Zorbax C18色譜柱、島津Wondasil C18色譜柱、Waters SunFire C18色譜柱）、流速（0.8、0.9、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）和進樣體積（5、10、20 μL）對相對校正因子的影響，并計算不同條件下相對校正因子RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 對照品和供試品溶液色譜圖。圖1表明，在“1.2.3”色譜條件下，樣品中各成分的保留時間與對照品色譜圖中的一致，分離度大于1.5，滿足要求。說明此色譜條件適合測定淫羊藿中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的含量。

2.1.2 線性關(guān)系的考察。以朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的濃度對峰面積進行線性回歸，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。表1表明各成分對照品濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.4.2”方法操作，計算得出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶霍苷Ⅰ的峰面積RSD分別為0.77%、1.21%、0.98%、1.06%、0.86%和1.34%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 精密度試驗。按照“1.2.4.3”方法操作，計算得出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ的峰面積RSD為0.36%、0.21%、0.31%、0.45%、0.28%和0.75%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗。按照“1.2.4.4”方法操作，測得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ的含量RSD分別為1.27%、0.95%、1.28%、1.07%、1.34%和1.52%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗。按照“1.2.4.5”方法操作，計算加樣回收率在98.45%～102.33%，RSD均小于3%，說明回收率良好，方法可行。

2.2 相對較正因子和保留時間的計算

2.2.1 多點矯正法計算校正因子。按照“1.2.5.1”方法操作，以淫羊藿苷為參照物，計算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的相對校正因子fsk值分別為1.416 7、1.327 8、1.257 1、1.226 9、0.687 2，RSD分別為2.86%、2.51%、2.99%、2.66%、1.87%。

2.2.2 斜率矯正法計算相對校正因子。按照“1.2.5.2”方法操作，計算出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的相對校正因子fsk值分別為1.419 7、1.325 2、1.253 3、1.227 6、0.686 7。

2.2.3 相對保留時間的計算。按照“1.2.5.3”方法操作，以淫羊藿苷為內(nèi)標參照物，計算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的相對保留時間分別為0.81、0.86、0.90、0.94、1.59。

2.3 耐用性考察

按照“1.2.6”方法操作，不同儀器、色譜柱、流速、柱溫、進樣體積條件下測得的相對校正因子如表2所示。結(jié)果顯示，朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ的RSD分別為0.53%、1.27%、0.60%、0.55%、2.63%，表明方法的耐用性良好。

2.4 含量測定

取21批甘肅產(chǎn)淫羊藿樣品，按照“1.2.2”方法處理，按“1.2.3”色譜條件進行HPLC分析。采用標準曲線法、多點矯正-一測多評法（MPC-QAMS）和斜率矯正-一側(cè)多評法（SC-QAMS）分別計算6個黃酮類成分含量，具體數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果顯示三者RSD均小于3%，說明3種方法不存在明顯差異。一測多評法相比來說操作簡單、成本低廉，具有優(yōu)勢。

按照多點矯正-一測多評法的含量測定結(jié)果，計算21批樣品6個黃酮類成分總量，具體數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果顯示（表3），甘肅地區(qū)淫羊藿中總黃酮除8號樣品外，其余均大于1.5%。其中，含量排在前5的淫羊藿依次為11號、3號、7號、12號、10號，分別來自甘肅迭部、甘肅西和縣、甘肅岷縣、甘肅武山縣和甘肅成縣。

3 討論與結(jié)論

該研究以淫羊藿苷為內(nèi)標參照物，建立了一測多評法同時測定淫羊藿中6種黃酮類成分的方法。淫羊藿苷在淫羊藿藥材中含量高且穩(wěn)定，對照品價廉易得，選為內(nèi)標參照物。朝藿定類對奧沙利鉑損傷的周圍神經(jīng)具有明顯的保護作用[13]。寶霍苷I是淫羊藿苷在體內(nèi)的水解產(chǎn)物[14]，故選取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶霍苷I作為測試目標。

多點矯正-一測多評法和斜率矯正-一測多評法二者測定的相對校正因子基本一致。前者方法的使用率更高[12]。故該研究采用多點矯正-一測多評法進行耐用性考察及6個黃酮類成分的總量計算。色譜峰定位的常見方法有時間差法和相對保留時間法。時間差法在不同的儀器和色譜柱上會有較大的波動[15]。相對保留時間法適用于定位與參照物性質(zhì)類似的成分。淫羊藿的黃酮類成分是以2-苯基色原酮為母核的衍生物[16]，所以采用其定位色譜峰，效果良好。

甘肅為淫羊藿的重要產(chǎn)區(qū)之一。不同產(chǎn)地的藥材品質(zhì)相差較大。該研究結(jié)果表明，甘肅迭部、甘肅西和縣、甘肅岷縣、甘肅武山縣和甘肅成縣出產(chǎn)的淫羊藿，所測6個黃酮類成分的含量總量較高。

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