護(hù)骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響

鐘佳賢，林澤苗，賈歡歡,吳玉娥，陳珺，曹祺，曹克廣，李青南,,*

1.廣東安諾藥業(yè)股份有限公司，揭陽(yáng)515300 2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510663 3.廣東藥科大學(xué),生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006

去卵巢大鼠能模擬人的原發(fā)性骨質(zhì)疏松，其表現(xiàn)為骨高轉(zhuǎn)換，而骨轉(zhuǎn)換過程可以通過骨代謝指標(biāo)反映出來,間接顯示成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的活性[1]。隨著骨質(zhì)疏松癥的流行病學(xué)、病理生理研究的不斷深入,骨代謝指標(biāo)檢測(cè)也廣泛的應(yīng)用于臨床骨質(zhì)疏松的跟蹤治療及代謝性骨病的鑒別診斷中。

中藥復(fù)方護(hù)骨膠囊已上市11年，上市前做了動(dòng)物去卵巢實(shí)驗(yàn)和I、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)，均顯示有較好的防治骨質(zhì)疏松的作用。并于2004年獲得批文，開始臨床應(yīng)用。目前對(duì)其處方的配伍、數(shù)理藥效的分析，血清藥理學(xué)對(duì)成骨細(xì)胞的影響都做了一定的研究[25-27]，臨床研究顯示[28]，護(hù)骨膠囊治療后能明顯改善原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)辨證屬于腎精虧虛、筋骨失養(yǎng)患者的腰脊部疼痛、脛膝酸軟、步履艱難等主要臨床癥狀及提高患者的骨密度，且治療過程中未發(fā)現(xiàn)其對(duì)心、肝、腎功能及血液系統(tǒng)有明顯的損害，臨床應(yīng)用安全。

但由于當(dāng)年做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的條件有限，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做得相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)于此藥作用機(jī)理的研究不夠深入，廣東安諾藥業(yè)股份有限公司為完善動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面的了解藥物的藥效機(jī)制，借助現(xiàn)代先進(jìn)的儀器設(shè)備和方法，按照美國(guó)FDA骨質(zhì)疏松新藥臨床前研究的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。采用雙側(cè)去卵巢大鼠模型,在整體動(dòng)物水平研究中藥護(hù)骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響，完善護(hù)骨膠囊防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理，為臨床更好的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型與實(shí)驗(yàn)分組

3月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠60只，體重(210±3)g，隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組、去卵巢組、仙靈骨葆組(陽(yáng)性對(duì)照組)和護(hù)骨膠囊低、中、高劑量組(Sham、OVX、Pos、HG-L、HG-M、HG-H)，每組10只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2w后，進(jìn)行如下干預(yù)：1.去卵巢造模：假手術(shù)組在手術(shù)中不切除卵巢，僅摘除少量脂肪，其余各組均切除雙側(cè)卵巢。2.藥物干預(yù)(每日 )：去卵巢手術(shù)2 d后，Sham組與OVX組灌服生理鹽水[10mL/(kg·d)]，Pos組灌服等劑量的仙靈骨葆[0.270 g/(kg·10 mL·d)]，HG-L、M和H組分別灌服等劑量的HG[0.243、0.486、0.972 g/(kg·10 mL·d)]，HG-M為臨床成人的等效劑量。各組大鼠自由進(jìn)食和飲水，每周稱量并記錄體重一次，按體重調(diào)整給藥劑量，共計(jì)給藥3個(gè)月。藥物干預(yù)結(jié)束時(shí)，心臟抽血處死大鼠，收集各只大鼠血液，所獲血標(biāo)本置于室溫環(huán)境下放置4 h，3000 r/min，離心15 min，吸取血清后靜置放于冰盒中，每組混合成一管,采用0.22 μm濾器除菌后分裝, 用1.5 mLEP管分裝并置于-80℃冰箱保存。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

中藥護(hù)骨膠囊組[由淫羊藿、巴戟天、制何首烏、杜仲、骨碎補(bǔ)、熟地黃、龜甲等組成，由廣東安諾藥業(yè)股份有限公司(原東莞萬(wàn)成制藥有限公司)生產(chǎn)，批號(hào)：20150101，規(guī)格：0.45g]；仙靈骨葆陽(yáng)性藥物組(由淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參等組成，由貴州同濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)：20140701規(guī)格：0.50 g)

1.3血清骨代謝指標(biāo)的檢測(cè)

取每組血清標(biāo)本2 ml送至上海邦奕生物科技有限公司采用Elisa試劑盒檢測(cè)血骨代謝指標(biāo)12項(xiàng)：骨形成指標(biāo)：堿性磷酸酶(ALP)和骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OC)和羧化不全骨鈣素(UcOC)、Ⅰ型前膠原羧基末端前肽(PICP)和Ⅰ型前膠原氨基末端前肽(PINP)；骨吸收指標(biāo)：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP5a和TRAP5b)、Ⅰ型膠原N末端肽(NTX)和Ⅰ型膠原C末端肽(CTX)；另外還檢測(cè)了骨保護(hù)素(OPG)與核因子NF-kB配體的受體激活劑(RANKL)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1護(hù)骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠血清骨形成指標(biāo)的影響(見表1、圖1)

表1、圖1可見:與Sham組比較,OVX組的ALP、BALP、UcOC和PINP水平均顯著升高(P<0.01)，OC、PICP水平有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；HG組與OVX組相比，ALP水平在HG-L和HG-H組顯著升高(P<0.01),HG-M組略有降低,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)； BALP水平在HG-L、HG-M組顯著降低(P<0.01)，而HG-H組升高(P<0.01)；Pos組與OVX組比,ALP和BALP水平均降低(前者P<0.05,后者P<0.01)；而UcOC和PINP水平，HG組和Pos組與OVX組比均顯著降低(P<0.01),HG-H組PINP水平降低無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2護(hù)骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠血清骨吸收指標(biāo)的影響(見表2、圖2)

表2、圖2可見：與Sham組比較，OVX組的CTX水平升高(P<0.01)，NTX的水平有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與OVX組CTX水平比，HG和Pos組均顯著降低(P<0.01)；HG-L、HG-M組和HG-H組(54.13 nmol/L、56.30 nmol/L，后者61.84 nmol/L)，HG-H與Pos組結(jié)果相似。

組別Group數(shù)量n堿性磷酸酶ALP(U/L)骨堿性磷酸酶BALP(U/L)骨鈣素OC(ng/L)羧化不全骨鈣素UcOC(pg/mL)I型前膠原羧基端前肽PICP(ng/L)I型前膠原氨基端前肽PINP(μg/L)假手術(shù)組Sham1010.20±0.427.08±0.21961.29±21.58746.14±18.51208.84±6.5815.41±0.73去卵巢組OVX1012.31±0.4454??7.91±0.11??949.63±33.221088.60±20.17??199.47±7.9617.21±0.44??陽(yáng)性藥物組Pos1011.53±0.24??#7.05±0.09##881.48±5.63??##925.86±27.90??##267.71±15.05??##15.65±0.42##護(hù)骨低劑量組HG-L1013.62±0.44??##△△6.80±0.23##909.72±29.77?769.28±32.06##△△245.25±9.16??##△14.18±0.45?##△△護(hù)骨中劑量組HG-M1012.30±0.21??△□□6.08±0.13??##△△□□941.03±20.29△854.12±16.25??##△△□□224.76±9.28##△△□14.40±0.45?##△護(hù)骨高劑量組HG-H1013.21±0.14??##△△◇◇7.93±0.19??##△△□□◇◇847.10±22.20??##□□◇◇932.80±14.14??##□□◇◇210.80±8.90△△□□16.57±0.43?△□□◇◇

注：*,**P<0.05,0.01 VS Sham；#,##P<0.05 VS OVX；△,△△P<0.05,0.01 VS Pos；□,□□P<0.05,0.01VS HG-L；◇,◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

圖1 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠相對(duì)OVX組有意義的血清骨形成指標(biāo)變化柱形圖Fig.1 The chart of changes of serum bone formation indexes in groups that have statistical differences comparing to those in OVX group after the experiment.

與Sham組比較，OVX組TRAP5a和TRAP5b水平降低(P<0.01)。與OVX組相比，HG-L組的TRAP5a水平升高(P<0.01)，而HG-H組的TRAP5a水平明顯降低(P<0.05)，HG-M組介于中間，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與Pos組相似。TRAP5b水平,HG-L和HG-M組高于OVX組，有顯著性差異(P<0.01)，Pos和HG-H組都下降至接近OVX組(前者P<0.01,后者P>0.05)。

2.3護(hù)骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠血清骨代謝指標(biāo)OPG和OPG/RANKL比值的影響(見表2、圖2)

表2、圖2可見：與Sham組相比較，OVX組的RANKL水平有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與OVX組比，RANKL水平在HG低、中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的下降(P<0.01)，但HG-H組則增加(P<0.05)，Pos組與OVX組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化(P>0.05)。OPG為RANKL的拮抗劑，OVX組與Sham組比下降(P<0.01)，與OVX組比，只有HG-H組和Pos組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加(P<0.01)。OPG/RANKL比值，OVX組顯著降低(P<0.01)，HG和Pos組都增加(P<0.01)，HG-M組增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

組別Group數(shù)量n抗酒石酸酸性磷酸酶5a TRAP5a(U/L)抗酒石酸酸性磷酸酶5b TRAP5b(U/L)Ⅰ型膠原N末端肽 NTX(nmol/L)Ⅰ型膠原C端肽 CTX(nmol/L)骨保護(hù)素OPG(ng/L)核因子kb受體活化因子配體RANKL(pg/mL)骨保護(hù)素/核因子kb受體活化因子配體OPG/RANKL假手術(shù)組Sham1010.16±0.305.97±0.2317.55±0.5363.92±2.661343.28±33.3036.68±1.3836.67±2.07去卵巢組OVX109.23±0.24??4.43±0.12??16.77±0.4169.46±3.06??1129.24±44.71??34.67±1.2532.57±0.17??陽(yáng)性藥物組Pos109.00±0.36??5.35±0.07??##18.06±0.48#61.34±1.00##1339.45±30.65##36.43±0.6736.77±0.28##護(hù)骨低劑量組HG-L1011.11±0.19??##△△6.08±0.19##△△16.60±0.88△54.13±2.00??##△△1143.05±28.13??△△29.82±1.10??##△△38.37±1.91##護(hù)骨中劑量組HG-M109.60±0.20?△□□5.75±0.30##△19.75±0.53??##△△□□56.30±1.58??##△1126.94±11.59??△△32.11±1.58??#△△□35.16±1.96□護(hù)骨高劑量組HG-H108.70±0.15??#□□◇◇4.66±0.12??△△□□◇◇19.60±0.92??##△□□61.84±1.31##□□◇◇1350.96±18.61##□□◇◇37.10±0.78#□□◇◇36.44±1.20##

注：*,**P<0.05,0.01 VS Sham；#,##P<0.05 VS OVX；△,△△P<0.05,0.01 VS Pos；□,□□P<0.05,0.01VS HG-L；◇,◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M

圖2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠相對(duì)OVX組有意義的血清骨吸收指標(biāo)變化柱形圖Fig.2 The chart of changes of serum bone resorption indexes in groups that have statistical differences comparing to those in OVX group after the experiment.

3 討論

3.1切除雙側(cè)卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型已成為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松經(jīng)典模型[3]。此模型的病理變化與婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有許多相似之處,其中包括具備骨吸收與骨形成均異常增加的“高轉(zhuǎn)換型”骨質(zhì)疏松的特征[17]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠卵巢摘除3個(gè)月后，部分反映骨形成的指標(biāo)如ALP、BALP、UcOC和PINP及反映骨吸收的指標(biāo)如CTX的含量均顯著升高(P<0.01)，表明去卵巢后骨形成與骨吸收部分指標(biāo)增加，但TRAP5a和TRAP5b水平較假手術(shù)組降低，這與方玲娜、戴如春等[11]采用70只7月齡SD雌性大鼠OVX3w、15w后TRAP5b水平降低的結(jié)果文獻(xiàn)相似。

3.2骨形成指標(biāo)分析

ALP和BALP是最常用的評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)[18]，故成為反映成骨細(xì)胞活性的特異及敏感指標(biāo),成骨細(xì)胞活性增強(qiáng),則ALP和BALP分泌增加[1]。OC和UcOC也是評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換率的特異性指標(biāo)[16]。PICP、PINP是骨形成的特異和敏感指標(biāo)[1，2,8,18]。本實(shí)驗(yàn)中，ALP水平，HG組在去卵巢升高的基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步的升高，而仙靈骨葆組降低。HG的結(jié)果與中藥骨疏靈對(duì)OVX大鼠骨代謝的影響的結(jié)果一致[15]，以及與中藥增骨丸對(duì)OVX所致骨質(zhì)疏松大鼠血、尿生化的結(jié)果相似[19],也在OVX升高ALP的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步增加。而高劑量的HG的BALP水平在OVX基礎(chǔ)上顯著升高。究其原因,可能為這幾個(gè)中藥復(fù)方中都含有淫羊藿、骨碎補(bǔ)等成分，具有成骨刺激作用所致。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)淫羊藿、骨碎補(bǔ)等補(bǔ)腎中藥具有植物異黃酮抗骨質(zhì)疏松活性，具有骨細(xì)胞雙向調(diào)節(jié)作用及雌激素樣作用[4,12]，且已有大量研究表明黃酮類化合物對(duì)成骨有明顯促進(jìn)作用[7]；BALP水平在低、中劑量的HG組降低,仙靈骨葆組也降低，上述結(jié)果提示HG能降低OVX所致的BALP水平升高，但HG對(duì)BALP有劑量依賴。HG能降低OVX所致的UcOC和PINP水平的增加，與仙靈骨葆一致，本文結(jié)果與盧建華等[20]、劉菊等[21]、張瑤和劉菊等[22]的補(bǔ)腎方降低骨形成指標(biāo)如PINP水平的結(jié)果一致。

3.3骨吸收指標(biāo)分析

NTX和 CTX是目前國(guó)際公認(rèn)的代表骨吸收的生化指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠去卵巢后CTX水平顯著升高,HG和仙靈骨葆給藥組均能顯著降低CTX水平，提示護(hù)骨膠囊和仙靈骨葆均能降低OVX所致的CTX的增加，可能具有降低骨吸收的作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與倪天慶[14]關(guān)于仙珠膠囊對(duì)OVX大鼠血生化指標(biāo)的影響的研究結(jié)果一致。

TRACP是骨吸收的重要指標(biāo)[3]，主要由破骨細(xì)胞釋放,因而血清中的TRACP水平反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收的狀態(tài)，TRACP分成5a和5b兩個(gè)亞型[6，23]。本實(shí)驗(yàn)中,OVX組TRAP5a和TRAP5b水平較假手術(shù)組明顯降低，此結(jié)果與崔省珍等[10]和李寶芬等[5]將大鼠OVX14w后，TRAP5a和TRAP5b水平均升高的結(jié)果不一致。但與方玲娜、戴如春等[11]采用70只7月齡SD雌性大鼠OVX3w、15w后TRAP5b水平降低的結(jié)果相似。他們?cè)谖墨I(xiàn)中分析到,OVX大鼠的血清TRAP5b水平變化并不能真正代表破骨細(xì)胞骨吸收活性的變化，而在更大程度上代表破骨細(xì)胞數(shù)量的變化[21,22]，血清CTX可能更直接的反映破骨細(xì)胞骨吸收活性的變化[11]。

與OVX組比，TRAP5a水平只有HG低劑量組增加，而TRAP5b水平在HG低、中劑量和仙靈骨葆組都增加。這些結(jié)果提示HG和仙靈骨葆能增加OVX后的TRAP5b水平，而TRAP5b水平在更大程度上代表破骨細(xì)胞數(shù)量的變化，提示它們能促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨轉(zhuǎn)化，這可能有利于促進(jìn)骨骼的更新，具體的原因有待深入的研究。

3.4RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)分析

OPG/ RANKL/ RANK是近些年來發(fā)現(xiàn)的在破骨細(xì)胞分化過程中的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路[13], OPG是破骨細(xì)胞生成抑制因子,RANKL是誘使破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子,RANK是RANKL的唯一靶受體[17，24]。OPG與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,阻止RANK與RANKL結(jié)合,抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成[6]。OPG水平和OPG/RANKL比值升高時(shí),說明骨形成增加而骨破壞減少[9]。

去卵巢后OPG水平和OPG/RANKL比值降低；HG高劑量組和仙靈骨葆組與OVX組比較，OPG水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高，而HG和仙靈骨葆給藥組使OPG/RANKL比值升高。此結(jié)果與滋腎丸浸膏對(duì)OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的影響結(jié)果一致[13]。提示兩種藥物均可能通過對(duì)OPG/ RANKL/ RANK系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述,OVX使部分骨形成和骨吸收指標(biāo)增加，表現(xiàn)為骨高轉(zhuǎn)換。HG和仙靈骨葆用藥后降低了BALP、UcOC、PINP和CTX水平，降低骨高轉(zhuǎn)換；同時(shí)，也提高了OPG/RANKL比值。且HG在OVX增加的基礎(chǔ)上進(jìn)一步升高ALP，高劑量HG也升高BALP水平，提示HG降低骨高轉(zhuǎn)換的同時(shí)還刺激成骨，而仙靈骨葆只是降低了OVX所致的高ALP和BALP水平，這些指標(biāo)的變化提示護(hù)骨膠囊刺激成骨的作用較強(qiáng)。HG和仙靈骨葆能增加OVX后的TRAP5b水平，這可能有利于促進(jìn)骨骼的更新，具體的原因有待深入的研究。