珍珠菜抗腫瘤有效部位ZE4對肝癌Bel-7402細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用

王 麗，虞 瑩，龍林梅，張慶青，唐麗華，梁中琴

(蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，江蘇 蘇州 215123)

珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)為報(bào)春花科植物虎尾珍珠菜的根或全草，性平味辛澀，主要作用是活血調(diào)經(jīng)，利水消腫［1］。研究表明，從珍珠菜全草中提取得到的抗腫瘤有效部位ZE4的主要成分為總黃酮苷，對小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤［2］、小鼠白血病 L1210［3］、小鼠肝癌H22［4］、人白血病HL-60［5-6］和K562 細(xì)胞［5，7］等均有抑制作用，但未見有關(guān)其對肝癌Bel-7402細(xì)胞裸鼠移植瘤抑制作用的報(bào)道。本研究觀察珍珠菜抗腫瘤有效部位ZE4對肝癌Bel-7402細(xì)胞裸鼠移植瘤抑制作用及移植瘤組織中細(xì)胞凋亡和血管生成的影響，為其用于肝癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞、試劑和儀器

5周齡雄性裸鼠BALB/c nu，體質(zhì)量18～22 g，購自愛爾麥特科技有限公司，動物許可證號:SYXK(蘇)2007-0035。肝癌Bel-7402細(xì)胞由蘇州大學(xué)腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。2.5%5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)注射液購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司;兔抗人Bax抗體和鼠抗人Bcl-2抗體購自Millipore公司;鼠抗人β肌動蛋白抗體和兔抗鼠CD34抗體購自Abcam公司;熒光標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗購自美國Gaithersburg公司;DAB顯色試劑盒(SK-4105)購自Vector Laboratories公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。HeraeusBB16UV型 CO2培養(yǎng)箱，德國 Heraeus公司;Eclipse TE2000-U型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司;JY96-1Ⅰ型超聲細(xì)胞破碎儀，寧波科生儀器廠;垂直電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽，Bio-Rad公司;BCM-1000A型生物潔凈工作臺，蘇凈安泰有限公司;Odyssey型雙色紅外激光成像系統(tǒng)，美國基因有限公司。

1.2 珍珠菜抗腫瘤有效部位ZE4的制備

珍珠菜藥材由蘇州雷允上藥材采購站提供，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院劉春宇教授鑒定為虎尾珍珠菜全草。珍珠菜抗腫瘤有效部位ZE4為采用藥物活性跟蹤法進(jìn)行體外篩選得到的抗腫瘤有效部位［8］，主要成分為總黃酮苷，由蘇州大學(xué)植物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供(批號:2005071201);以蘆丁作為對照品，采用紫外分光光度法測定ZE4中總黃酮含量，總黃酮含量為33.3%［9］。每天ig給藥時用滅菌蒸餾水溶解成適當(dāng)濃度給藥。具體制備工藝如下:取經(jīng)粉碎的珍珠菜藥材適量，依次加入12，10和8倍量的80%乙醇，加熱回流提取，每次1.5 h，合并提取液，過濾。濾液減壓回收溶劑，并濃縮至含生藥500 g·L-1。濃縮液加2倍體積水稀釋，靜置，抽濾除去不溶性物質(zhì)，濾液再次濃縮，即得珍珠菜上樣液，提取液回收乙醇，濃縮成浸膏(1 g浸膏相當(dāng)于3 g生藥)，真空干燥即得。

1.3 動物分組、給藥及瘤質(zhì)量和瘤體積的測定

65只5周齡裸鼠于右側(cè)腋下皮下接種Bel-7402細(xì)胞，每只1.0×107細(xì)胞。測量腫瘤體積V(mm3)=0.5 × a×b2〔a:腫瘤的長徑(mm)，b:腫瘤的短徑(mm)〕。接種 15 d后測得腫瘤平均體積約120 mm3，選取腫瘤體積在80～140 mm3的裸鼠40只，根據(jù)裸鼠體質(zhì)量和腫瘤體積隨機(jī)分為模型(ig給予滅菌蒸餾水)、ZE4100、200 和400 mg·kg-1及5-FU 20 mg·kg-1組，每組8只。分組當(dāng)天即開始給藥，ZE4組裸鼠每天ig給藥1次，5-FU組裸鼠隔日ip給予5-FU 1次;給藥體積均為10 ml·kg-1，連續(xù)21 d。每3 d稱體質(zhì)量并測量腫瘤體積。給藥21 d后處死裸鼠，剝離腫瘤組織稱瘤質(zhì)量并儲存?zhèn)溆谩Ｒ至雎?%)=(1-ZE4組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量)×100%，根據(jù)體積繪制腫瘤生長曲線。

1.4 Western印跡法測定移植瘤組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

移植瘤組織剪碎后加入裂解液超聲制備50%的組織勻漿，離心得上清，用BCA試劑盒測蛋白質(zhì)濃度后稀釋至等蛋白質(zhì)濃度，加入5×上樣緩沖液變性5 min，上樣量為每孔160 μg，重復(fù)上樣3次(n=3)，用10%SDS-PAGE膠分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入抗Bax(1∶2000)，Bcl-2(1∶1000)和 β 肌動蛋白(1∶600)抗體，4℃過夜后，含Bax的PVDF膜加入熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶10000)，含 Bcl-2和 β 肌動蛋白的PVDF膜加入熒光標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶10000)孵育1 h，測定各蛋白條帶的熒光強(qiáng)度并轉(zhuǎn)換為黑白照片，利用SigmaScan Pro 5軟件分析各蛋白條帶的積分吸光度(integrated absorbance，IA)值。

1.5 免疫組織化學(xué)法測定移植瘤組織中血管生成

制備移植瘤組織冰凍切片(5 μm)，用3%H2O237℃孵育30 min，PBS沖洗2次，每次5 min;用2.5%正常馬血清工作液于37℃封閉20 min，傾去封閉工作液(勿洗)，分別加兔抗鼠CD34抗體(一抗)(1∶50)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，PBS沖洗2次，每次5 min;加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(二抗)(1∶500)孵育30 min，PBS沖洗2次，每次 5 min;加入 ABC工作液 37℃孵育30 min，PBS沖洗2次，每次5 min;DAB染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染1～2 min，鹽酸乙醇中脫色后自來水浸洗，常規(guī)脫水，干燥，封片，光鏡下觀察。在低倍視野下(×40)選取移植瘤組織內(nèi)CD34陽性血管分布最密集區(qū)域，在高倍鏡下(×100)分別選擇5個CD34陽性血管分布密集區(qū)域，計(jì)數(shù)CD34陽性血管即微血管數(shù)目，用1 mm2的微血管絕對數(shù)表示，求其平均值作為該組織的微血管密度(microvessel density，MVD)［10］。每個被染成棕黃色、可與周圍血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織分開的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，無論有無管腔形成和紅細(xì)胞出現(xiàn)，均被視為一個微血管［11］，分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ZE4對肝癌Bel-7402細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用

由表1看出，給藥21 d后，ZE4200 mg·kg-1和陽性對照5-FU組移植瘤質(zhì)量較移植瘤模型組明顯減小(P ＜0.05)，抑瘤率分別為 52.1% 和 47.9%;ZE4100和400 mg·kg-1對移植瘤質(zhì)量無明顯影響。移植瘤生長曲線見圖1，模型組腫瘤體積逐漸增大，給藥21 d后達(dá)(2.90±0.89)cm3，ZE4和5-FU 組裸鼠移植瘤體積增長較為緩慢，其中 ZE4200 mg·kg-1組從14 d后開始與模型組相比明顯減小(P＜0.05)，5-FU組在21 d與模型組相比減小(P ＜0.05);ZE4100 和400 mg·kg-1組無明顯變化。提示ZE4200 mg·kg-1可抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞移植瘤生長。

Tab.1 Effect of antitumor effective part ZE4 of Lysimachus clethroides Duby on tumor mass of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice

Fig.1 Effect of ZE4 on tumor volume of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice.See Tab.1 for mice treatments.，n=8.*P＜0.05，compared with model group.

2.2 ZE4對裸鼠移植瘤組織Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

由表 2和圖 2可見，與模型組比較，ZE4200 mg·kg-1和5-FU組 Bax蛋白條帶 IA值增加，Bcl-2蛋白條帶 IA值降低，Bax/Bcl-2增加(P＜0.01);ZE4100 和400 mg·kg-1組 Bax/Bcl-2 無明顯變化;提示Bcl-2家族介導(dǎo)的凋亡途徑可能參與了ZE4的抗腫瘤作用。

Fig.2 Effect of ZE4 on expression of Bax and Bcl-2 in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice by Western blotting.See Tab.1 for mice treatments.Lane 1:model;lane 2，3 and 4:ZE4100，200 and 400 mg·kg-1，respectively;lane 5:5-FU 20 mg·kg-1.

2.3 ZE4對裸鼠移植瘤血管生成的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖3，圖4)表明，ZE4100～400 mg·kg-1組 MVD 計(jì)數(shù)分別為 31.3 ±1.3，13.5 ±1.0 和(20.7 ±1.6)mm-2，5-FU 20 mg·kg-1組為(13.5 ±2.8)mm-2較模型組(42.3 ±2.5)mm-2明顯減少(P ＜0.01)，ZE4200 mg·kg-1組較ZE4100 和400 mg·kg-1組相比更加明顯(P ＜0.01)，提示ZE4 還可能通過抑制新生血管形成抑制移植瘤生長。

Tab.2 Effect of ZE4 on expression of Bax and Bcl-2 in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice

Fig.3 Effect of ZE4 on angiogenesis in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice(Immunostaining ×100).See Tab.1 for mice treatments.The black arrow means blood vessels with positive CD34 staining.A:model group;B-D:ZE4100，200 and 400 mg·kg-1groups，respectively;E:5-FU 20 mg·kg-1group.

Fig.4 Effect of ZE4 on microvessel density(MVD)in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice.See Tab.1 for mouse treatments.1:model group;2-4:ZE4100，200 and 400 mg·kg-1groups，respectively;5:5-FU 20 mg·kg-1 group.，n=5.＊＊P＜0.01，compared with model group;##P＜0.01，compared with ZE4200 mg·kg-1group.

3 討論

肝癌是一種高度惡性的腫瘤，手術(shù)是主要的治療手段，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，失去了最佳手術(shù)時機(jī)，而放化療等其他方法療效均不理想，所以，中醫(yī)藥治療成為多數(shù)患者不可缺少的輔助治療手段。本研究結(jié)果顯示，ZE4200 mg·kg-1對裸鼠Bel-7402肝癌移植瘤生長具有抑制作用，抑瘤率達(dá)52.1%。

細(xì)胞凋亡是在基因調(diào)控下的程序性死亡，凋亡途徑受阻在腫瘤發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是當(dāng)今腫瘤治療的熱點(diǎn)。Bcl家族是重要的凋亡調(diào)控基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切聯(lián)系。其中促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2經(jīng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)后的Bax/Bcl-2比值決定凋亡的敏感性［12］。有研究顯示，肝癌細(xì)胞和組織中均有Bax和Bcl-2的表達(dá)，且Bax水平和Bax/Bcl-2二聚體明顯低于正常肝組織，而Bcl-2水平明顯高于周圍正常肝組織，這些蛋白的表達(dá)可能與調(diào)控肝癌發(fā)生有關(guān)［13］。本研究通過測定參與腫瘤凋亡途徑的蛋白含量來檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn) ZE4200 mg·kg-1組Bax/Bcl-2值明顯升高，即凋亡敏感性增加，表明ZE4在體內(nèi)可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

血管生成在惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用，目前抑制血管生成可作為治療惡性腫瘤的手段之一。MVD被認(rèn)為是反映腫瘤血管生成及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)［14］。CD34作為血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物具有較高的抗原特異性和穩(wěn)定性，被認(rèn)為是最敏感的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物［15］。應(yīng)用CD34標(biāo)記形成血管的再生上皮細(xì)胞，檢測腫瘤內(nèi)微血管，是目前測定MVD的良好指標(biāo)［16］。肝癌是一類富血供的腫瘤，腫瘤血管生成現(xiàn)象尤為典型，CD34染色可將其清晰地顯示出來［17］。本研究結(jié)果顯示，ZE4200 mg·kg-1組MVD與模型組相比明顯降低，表明ZE4還可通過抑制血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究通過制備Bel-7402肝癌荷瘤裸鼠模型，以不同濃度ZE4干預(yù)治療21 d，給藥期間各組小鼠均未出現(xiàn)死亡、飲食減少和行動遲緩等現(xiàn)象。給藥期間監(jiān)測移植瘤體積，結(jié)果顯示，ZE4200 mg·kg-1在給藥14 d后即可明顯抑制裸鼠移植瘤生長，5-FU在給藥21 d后抑制移植瘤生長，ZE4100和400 mg·kg-1對移植瘤生長無明顯抑制作用。給藥結(jié)束后稱量各組移植瘤瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率，ZE4200 mg·kg-1組瘤質(zhì)量為(1.5 ±0.5)g ，與模型組(3.2 ±1.0)g相比明顯減小，抑瘤率達(dá)52.1%，且裸鼠體質(zhì)量并無明顯變化，ZE4100和400 mg·kg-1組移植瘤瘤質(zhì)量無明顯變化。對剝離的腫瘤組織進(jìn)行表型分析，結(jié)果顯示，ZE4100，200 和400 mg·kg-1均可明顯抑制腫瘤血管生成，以200 mg·kg-1組尤為明顯，且ZE4200 mg·kg-1在抑制腫瘤血管生成的同時還可提高細(xì)胞凋亡敏感性，促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡，ZE4100和400 mg·kg-1對移植瘤細(xì)胞凋亡則無明顯作用。ZE4對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響及對MVD的影響呈非劑量依賴性，與其對移植瘤體積生長的抑制作用和瘤質(zhì)量的影響一致，推測在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控和血管生成過程中，ZE4200 mg·kg-1均較100和400 mg·kg-1更能有效調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和血管生成，從而抑制移植瘤的生長，目前對造成這一現(xiàn)象的具體原因仍有待進(jìn)一步研究。

［1］Jiangsu New Medical College.Dictionary of Chinese Medicine(中藥大辭典)［M］.Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，1992:1498.

［2］Wang YQ，Tang LH，Liang ZQ，Gu ZL.Primary studies on the anti-uterine cervix cancer effects of the extract ZE4 from Lysmachia clethroides Duby［J］.Chin Pharmacol Bull(中國藥理學(xué)通報(bào))，2007，23(7):925-929.

［3］Zhang W，Tang LH，Liang ZQ，You BG，Wang YQ.Studies on the anti-leucemia effects of the extract from Lysmachia clethroides Duby［J］.Anti-Infect Pharm(抗感染藥學(xué))，2007，4(2):62-65.

［4］Tang LH，Wang YQ，Liang ZQ，You BG，Yang SL.Study on inhibition effect of the extract ZE4 from Lysimachia clethroides Duby on hepatoma［J］.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2009，40(1):108-111.

［5］Tang LH， Xu XY， You BG， Zhang W，Wang YQ.Anti-tumor effect and its mechanism of total flavones of Lysimachia clethroides Duby［J］.Shanghai J Tradit Chin Med(上海中醫(yī)藥雜志)，2007，41(5):74-76.

［6］Tang LH， You BG， Xu XY， Wang YQ，Zhang W.Study on apoptosis of HL-60 cell line induced by total flavones of Lysimachia clethroides Duby［J］.Acta Univ Trad Med Sin Pharmacol Shanghai(上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2007，21(1):54-57.

［7］Liu YL， Tang LH， Liang ZQ， You BG，Yang SL.Growth inhibitory and apoptosis inducing by effects of total flavonoids from Lysimachia clethroides Duby in human chronic myeloid leukemia K562 cells［J］.J Ethnopharmacol，2010，131(1):1-9.

［8］Xu XY， Tang LH， Liang ZQ， Gu ZL.The primary studies on the anti-tumor effect of the extracts of Lysmachia clethroides［J］.Chin Wild Plant Resources(中國野生植物資源)，2003，22(2):31-34.

［9］You BG，Tang LH，Xu XY，Zhou XX.Study on separation and purification of total flavones from Lysimachia clethroides Duby with macroporus absorption resin［J］.Chin Tradit Her Drugs(中草藥)，2007，38(9):1337-1340.

［10］Ding HM，Qin XH，Zhu F，Tan Y，Jin L.Relationship between tissue factor expression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma and its clinical significance［J］.J Hepatopancreatobil Surg(肝膽胰外科雜志)，2008，20(5):331-335.

［11］Lu YY，Wang CP，Qu JH，Zhou L，Chang XJ，Bai WL，et al.Liver microvessel density in evaluating therapeutic effect of sorafenib combined with argon-helium cryoablation in treatment of advanced hepatocellular carcinoma［J］.Acad J Second Mil Med Univ(第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào))，2010，31(11):1174-1178.

［12］Wang WD， Chen ZT. Bcl-2/Bax ratio and the life or death fate of cells［J］.Chin J Cancer Biother(中國腫瘤生物治療雜志)，2007，14(4):393-396.

［13］Beerheide W， Tan YJ， Teng E，Ting AE，Jedpiyawongse A，Srivatanakul P.Downregulation of proapoptotic proteins Bax and Bcl-X(S)in p53 overexpressing hepatocellular carcinomas［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，273(1):54-61.

［14］Xiao YQ，Deng X，Liang Q，Zhang P，Xu HY，Tu XL，et al.Clinicopathologic significance of CD34，b-FGF and heparanase expression in tissues of early heptocellular carcinoma and their relationships with microvascular density［J］.J Nanchang Univ(Med Sci)〔南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)〕，2010，50(4):4-9.

［15］Wu BQ，Liu YF.Immunohistochemisty for Diagnostic Pathology(免疫組織化學(xué)病理診斷)［M］.Beijing:Beijing Science and Technology Press，2007:274.

［16］Poon RT，Ng IO，Lau C，Yu WC，Yang ZF，F(xiàn)an ST，et al.Tumor microvessel density as a predictor of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma:a prospective study［J］.J Clin Oncol，2002，20(7):1775-1785.

［17］Cong WL，Yu H，Zhu ZZ，Lu XY.The diagnostic value of CD34 immunohistochemical staining in hepatocellular tumors［J］.J Diagn Concepts Pract(診斷學(xué)理論與實(shí)踐)，2010，9(4):343-346.