貝那替秦對(duì)最大電休克發(fā)作模型和戊四氮驚厥發(fā)作閾模型小鼠的抗驚厥作用

陳小飛，李建雄，王永安

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850;2.解放軍總參謀部總醫(yī)院藥劑科，北京 100091;3.解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853)

膽堿能拮抗劑貝那替秦(benactyzine)是軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所研發(fā)的“解磷注射液”的主要成分，其對(duì)有機(jī)磷毒物中毒所具有的良好治療效果已獲大量臨床驗(yàn)證。既往研究結(jié)果表明，貝那替秦與膽堿酯酶重活化劑氯解磷定伍用時(shí)，可顯著提升有機(jī)磷農(nóng)藥中毒患者治愈率、縮短住院時(shí)間、降低治療費(fèi)用，其作用明顯優(yōu)于阿托品與氯解磷定伍用的臨床常規(guī)治療方案［1］;而 McDonough 等［2］則發(fā)現(xiàn)貝那替秦在對(duì)抗另外一種有機(jī)磷毒物梭曼中毒所致驚厥的過(guò)程中，表現(xiàn)出獨(dú)特的作用機(jī)制:在梭曼所致驚厥發(fā)作后期，在阿托品及東莨菪堿等抗膽堿藥失去抗驚厥療效時(shí)，貝那替秦常規(guī)劑量下仍具顯著抗驚厥作用［2］。由于非膽堿能系統(tǒng)特別是N－甲基－D－天冬氨酸(N－methyl－D－aspartate，NMDA)、γ－氨基丁酸(gamma－aminobutyric acid，GABA)受體功能異常目前被認(rèn)為可能是梭曼所致驚厥后期得以維持和延續(xù)的主要原因［3］，因此，貝那替秦在梭曼所致驚厥后期所表現(xiàn)出的明顯抗驚厥作用，提示其抗驚厥作用機(jī)制除在于其已知的抗膽堿作用外，還可能與其對(duì)非膽堿受體的直接拮抗作用相關(guān)。

為進(jìn)一步探討貝那替秦對(duì)有機(jī)磷毒劑中毒特別是梭曼所致驚厥的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與NMDA和GABA等非膽堿受體功能紊亂密切相關(guān)［4～5］的驚厥模型即最大電休克發(fā)作模型(maximal electroshock seizure，MES)和戊四氮驚厥發(fā)作閾模型〔penterazol(Metrazol seizure threshold test，MST)〕，評(píng)價(jià)比較了貝那替秦、鹽酸戊乙奎醚及阿托品等抗膽堿藥的抗驚厥療效;在此基礎(chǔ)上，制備致死劑量NMDA中毒小鼠模型及NMDA誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，同時(shí)在體內(nèi)體外水平進(jìn)一步觀察上述藥物對(duì)NMDA受體的對(duì)抗作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠

昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g;由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)小鼠中心提供，小鼠合格證號(hào):SCXK－(軍)－2002－001。新生 Wistar大鼠(＜12 h)。

1.2 藥品和試劑

鹽酸戊乙奎醚(批號(hào):030610，純度99.8%);阿托品(批號(hào):051025，純度99.1%)及貝那替秦(批號(hào):7108，純度98.6%)均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提供;東莨菪堿，批號(hào):K28714647購(gòu)自德國(guó)Merck公司;地西泮注射液，批號(hào):0907301，由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn);地佐環(huán)平(dizocilpine，MK－801)、NMDA及戊四氮為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT)為Merck產(chǎn)品;苯妥英鈉，批號(hào):030320及巴比妥鈉，批號(hào):000510購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、N－2添加劑、B－27添加劑、胰蛋白酶和L－多聚賴氨酸及阿糖胞苷均購(gòu)于美國(guó) Gibco公司;L－谷氨酰胺(批號(hào):0508255)購(gòu)自Amresco公司;青霉素，鏈霉素購(gòu)自華北制藥廠。

1.3 主要儀器

電驚厥儀(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器廠);超級(jí)潔凈工作臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)電子科技有限公司);MCC/340型多孔掃描分光光度計(jì)(美國(guó)Flow公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)。

1.4 最大電休克發(fā)作模型抗驚厥實(shí)驗(yàn)［6］675

選用抗膽堿藥阿托品及鹽酸戊乙奎醚作為陰性對(duì)照藥，選用臨床常用抗癲癇藥苯妥英鈉及巴比妥鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥，評(píng)價(jià)、比較貝那替秦及上述藥物的抗驚厥療效。按照分組設(shè)計(jì)分別ip給予貝那替秦(2，5，10，20和40 mg·kg－1)，苯妥英鈉(5，10，20和 40 mg·kg－1)，巴比妥鈉(5，10，20 和 40 mg·kg－1)，阿托品(10，20 和 40 mg·kg－1)和鹽酸戊乙奎醚(10，20和40 mg·kg－1)，模型對(duì)照組小鼠按0.01 ml·g－1給予相應(yīng)體積的生理鹽水，30 min后，參照文獻(xiàn)［6］將齒狀?yuàn)A電極浸生理鹽水，分別夾于小鼠兩耳，然后通以周期為0.2 s，頻率為60 Hz，強(qiáng)度為7.93 mA的電流，以給藥后未出現(xiàn)后肢伸展的強(qiáng)直性驚厥作為驚厥控制的指標(biāo)。

1.5 戊四氮所致驚厥模型的抗驚厥實(shí)驗(yàn)［6］676

按照分組設(shè)計(jì)分別ip給予貝那替秦(2，5，10，20和 40 mg·kg－1)苯妥英鈉(5，10，20 和 40 mg·kg－1)、巴比妥鈉(1，10，15，20 和30 mg·kg－1)、阿托品(10，20 和 40 mg·kg－1)和鹽酸戊乙奎醚(10，20 和40 mg·kg－1)，模型對(duì)照組小鼠按0.01 ml·g－1給予相應(yīng)體積的生理鹽水，30 min后sc給予致驚劑量戊四氮 92.1 mg·kg－1，以小鼠給藥后未出現(xiàn)軀體強(qiáng)直性痙攣?zhàn)鳛轶@厥控制的指標(biāo)，觀察藥物的抗戊四氮致驚療效。

1.6 測(cè)定對(duì)NMDA致死小鼠的對(duì)抗作用［7］

小鼠 ip給予地佐環(huán)平 2 mg·kg－1、地西泮 10，20，40 和80 mg·kg－1、阿托品10，20 和40 mg·kg－1、鹽酸戊乙奎醚10，20和40 mg·kg－1及貝那替秦10，20，30 和40 mg·kg－1，30 min 后，再 ip 給予致死劑量NMDA 190 mg·kg－1，記錄小鼠在NMDA 注射后4 h活存數(shù)量;對(duì)照組小鼠按 0.01 ml·g－1給予相應(yīng)體積的生理鹽水。

1.7MTT法測(cè)定NMDA誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率［8］

新生Wistar大鼠(＜12 h)斷頭并分離出海馬，參照既往方法分散、消化并培養(yǎng)海馬細(xì)胞。至培養(yǎng)后12 d，將培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板取出，吸去細(xì)胞液，分別加入由地佐環(huán)平 1 μmol·L－1、阿托品 100 μmol·L－1、鹽酸戊乙奎醚 100 μmol·L－1、貝那替秦 10 和 100 μmol·L－1及 NMDA 200 μmol·L－1組成的高糖無(wú)血清DMEM，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h(對(duì)照組不含任何藥品)。此后，吸去培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清及10%馬血清的DMEM液洗2遍，每孔加入含濃度為MTT 0.5 g·L－1的無(wú)血清DMEM，培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入10%SDS 100 μl。12～16 h后，待藍(lán)色顆粒完全溶解，用多孔掃描分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)本在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(absorbance，A)值，細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS軟件中的Fisher精確檢驗(yàn)及ANOVA方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;ED50值的計(jì)算采用概率單位(Probit)法。

2 結(jié)果

2.1 貝那替秦在最大電休克發(fā)作模型的抗驚厥作用

如表1所示，在MES模型上，貝那替秦10，20和40 mg·kg－1和臨床常用抗癲癇藥苯妥英鈉20和40 mg·kg－1及巴比妥鈉 20 和 40 mg·kg－1均具明顯抗驚厥作用(P ＜0.05，P ＜0.01);其中，貝那替秦抗MES 的 ED50值12.2(4.7 ～53.6)mg·kg－1低于巴比妥鈉15.2(5.5 ～ 24.1)mg·kg－1及苯妥英鈉 16.6(7.1 ～26.3)mg·kg－1;而阿托品及鹽酸戊乙奎醚10 ～40 mg·kg－1無(wú)明顯抗驚厥作用。

2.2 貝那替秦在戊四氮驚厥發(fā)作閾模型上的抗驚厥作用

如表2所示，在 MST上，貝那替秦20和40 mg·kg－1及巴比妥鈉 20 和 30 mg·kg－1均具明顯抗驚厥作用(P ＜0.05，P ＜0.01)，且貝那替秦抗 MST的 ED50值12.5(7.0 ～25.9)mg·kg－1同樣低于臨床常用抗癲癇藥巴比妥鈉 17.2(12.8 ～22.6)mg·kg－1;同時(shí)可見(jiàn)另外一種臨床常用抗癲癇藥苯妥英鈉5，10，20和40 mg·kg－1在所選用劑量范圍內(nèi)無(wú)抗驚厥作用，不能測(cè)定 ED50值。此外，與在MES模型上的抗驚厥效果類似，阿托品及鹽酸戊乙奎醚在所選劑量10，20和40 mg·kg－1范圍內(nèi)無(wú)明顯抗驚厥作用。

表1 貝那替秦等藥物在最大電休克發(fā)作模型(MES)上小鼠的抗驚厥作用Tab.1 Anticonvulsant effects of benactyzine and other chemicals on maximal electroshock seizure(MES)mice

2.3 貝那替秦等對(duì)NMDA致死劑量中毒小鼠的對(duì)抗作用

如表3所示，小鼠ip給予致死劑量NMDA 190 mg·kg－1后不久，模型對(duì)照組9只小鼠均出現(xiàn)過(guò)度激惹、前抓樣運(yùn)動(dòng)、翹尾，最后驚厥發(fā)作導(dǎo)致全身抽搐，因呼吸抑制而全部死亡。與模型組相比，ip給予NMDA受體特異性拮抗劑 MK－801 2 mg·kg－1可完全對(duì)抗NMDA的致死效應(yīng)(P＜0.01)，9只小鼠全部存活;貝那替秦20，30和40 mg·kg－1同樣可顯著提升中毒小鼠活存數(shù)量(P ＜0.05，P ＜0.01)，9 只小鼠有5～6只存活;但GABA受體激動(dòng)劑地西泮10，20，40 和 80 mg·kg－1、抗膽堿藥阿托品 10，20和 40 mg·kg－1及鹽酸戊乙奎醚 10，20 和 40 mg·kg－1等給藥組小鼠全部死亡，與模型組相比無(wú)顯著差異。

表2 貝那替秦等藥物在戊四氮驚厥發(fā)作閾模型(MST)小鼠上的抗驚厥作用Tab.2 Anticonvulsant effects of benactyzine and other chemicals on penterazol(Metrazol)seizure threshold test(MST)mice

2.4 貝那替秦等藥物對(duì)NMDA誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如表 4 所示，NMDA 200 μmol·L－1可明顯誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷;而貝那替秦1，10和100 μmol·L－1可顯著對(duì)抗 NMDA 的致死效應(yīng)(P ＜0.01)，其作用類似于特異性的NMDA受體拮抗劑地佐環(huán)平;而阿托品及鹽酸戊乙奎醚100 μmol·L－1條件下，對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率無(wú)影響與模型對(duì)照組存活情況相當(dāng)。

表3 貝那替秦等藥物對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)致死小鼠的對(duì)抗作用Tab.3 Antagonism of N-methyl-D-aspartic acid(NMDA)-induced lethality by benactyzine and other chemicals in mice

表4 貝那替秦對(duì)NMDA誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用Tab.4 Effect of benactyzine on NMDA-induced hippocampal neuron damage

3 討論

貝那替秦是作用明確的抗膽堿藥，其在梭曼所致驚厥模型的良好抗驚厥作用已經(jīng)大量研究證實(shí)。為更好解釋貝那替秦的良好抗毒作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立多個(gè)經(jīng)典小鼠模型，觀察了貝那替秦對(duì)NMDA及GABA等非膽堿能受體的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，貝那替秦在MES及MST驚厥模型上均表現(xiàn)出明顯的抗驚厥作用，并且對(duì)致死劑量的NMDA中毒小鼠及NMDA誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)損傷具明顯保護(hù)作用;其作用與經(jīng)典毒蕈堿(muscarine，M)受體拮抗劑阿托品，以及同時(shí)作用于M及煙堿(nicotine，N)受體的藥物—鹽酸戊乙奎醚存在明顯不同。

目前一般認(rèn)為，GABA系統(tǒng)功能降低，連同NMDA受體敏感性增強(qiáng)是 MES主要的發(fā)生機(jī)制［4，9］;而戊四氮本身就是一種 GABA 受體拮抗劑，大劑量可通過(guò)拮抗腦內(nèi)相應(yīng)的GABA受體，引起相關(guān)腦區(qū)抑制性功能下降，誘發(fā)驚厥發(fā)生［5，10］。大量研究表明，許多增強(qiáng) GABA 受體功能［9，11］及抑制谷氨酸(glutamate，Glu)系統(tǒng)功能［5，10］的藥物，在 MES及MST模型上均具良好抗驚厥療效;而一些膽堿能受體特異性拮抗劑如阿托品(M受體拮抗劑)［12～13］及鹽酸戊乙奎醚(M及N受體拮抗劑)［6］均不能對(duì)抗MES或MST。因此，MES及MST無(wú)論從驚厥發(fā)生機(jī)制，還是從治療藥物而言，確與膽堿能系統(tǒng)無(wú)直接關(guān)系。貝那替秦在上述兩種驚厥模型上所表現(xiàn)出的明顯抗驚厥作用，初步提示貝那替秦抗驚厥作用機(jī)制可能與其對(duì)NMDA及GABA受體的直接作用相關(guān)。

為進(jìn)一步明確貝那替秦對(duì)NMDA及GABA受體作用的選擇性，又在NMDA致死模型上，觀察了上述藥物對(duì)致死劑量NMDA中毒小鼠的保護(hù)作用。

NMDA受體是Glu受體的主要亞型，致死劑量的NMDA可過(guò)度激動(dòng)NMDA受體，使小鼠產(chǎn)生系列中毒癥狀，最終導(dǎo)致小鼠死亡。目前，NMDA致死模型被認(rèn)為是“評(píng)價(jià)藥物是否具有NMDA拮抗作用的藥物作用終點(diǎn)”［14］。在NMDA致死模型上，GABA受體激動(dòng)劑地西泮、M受體拮抗劑阿托品、M及N受體拮抗劑鹽酸戊乙奎醚均不能對(duì)抗NMDA致死效應(yīng);而既往研究結(jié)果也已證實(shí)，Glu受體拮抗劑的其他亞型即非NMDA受體拮抗劑，對(duì)NMDA致死效應(yīng)亦無(wú)對(duì)抗作用［15］。而貝那替秦在NMDA致死模型上所表現(xiàn)的對(duì)抗作用，則初步提示貝那替秦可能存在對(duì)NMDA受體直接拮抗作用。上述研究結(jié)果，在NMDA誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中得到進(jìn)一步證實(shí)。在體外實(shí)驗(yàn)中，貝那替秦對(duì)NMDA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷仍具明顯保護(hù)作用。因此，以上結(jié)果綜合提示貝那替秦可能存在對(duì)NMDA受體的直接拮抗作用。

以梭曼為代表的有機(jī)磷毒劑中毒所致驚厥特別是驚厥后期的救治目前仍是國(guó)內(nèi)外防化醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)。既往已經(jīng)證實(shí)對(duì)驚厥具明確拮抗作用的藥物，如抗膽堿藥、GABA受體激動(dòng)劑地西泮及NMDA受體拮抗劑等，在發(fā)揮良好抗驚厥作用的同時(shí)，均存在一定缺陷。如阿托品等抗膽堿藥的抗驚厥作用僅限于驚厥發(fā)作早期，在后期完全失去抗驚厥療效;地西泮類藥物盡管在驚厥后期仍具顯著抗驚厥作用，但亦同時(shí)存在驚厥控制后易復(fù)發(fā)、神經(jīng)保護(hù)作用差等缺點(diǎn);以MK－801為代表的NMDA受體拮抗劑雖然可以發(fā)揮良好抗驚厥及神經(jīng)保護(hù)作用，但其本身所具有的神經(jīng)精神樣副作用又限制了藥物的應(yīng)用，因此并無(wú)實(shí)用價(jià)值。我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)初步證實(shí)，對(duì)NMDA受體具明確拮抗作用的抗膽堿藥鹽酸苯環(huán)壬酯［3，12］，其對(duì)梭曼中毒所致驚厥治療效果明顯優(yōu)于國(guó)外目前推薦應(yīng)用的抗膽堿藥阿托品;而在本實(shí)驗(yàn)及既往研究中，貝那替秦在梭曼所致驚厥后期所表現(xiàn)的良好抗毒急救效果，以及其可能存在的對(duì)NMDA受體直接拮抗作用，則進(jìn)一步驗(yàn)證了同時(shí)作用于NMDA受體的抗膽堿藥，可能成為抗梭曼所致驚厥乃至有機(jī)磷毒劑中毒治療藥物的新的選擇。因此，本實(shí)驗(yàn)為新作用特點(diǎn)抗膽堿藥研究提供了新的研究方向。

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