CSF2作為肺鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后因子及相關(guān)腫瘤微環(huán)境指標(biāo)的可能性研究

中圖分類號(hào)：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.14.001

文章編號(hào)：1006-1959（2025）14-0001-12

Abstract：OjetiTofndthicatoselatedtorogresiondpgosisofUCdtoepeolotulaicto （CSF2）isaproosticfactorandtoricroenviontindexofLUSCMetodsThegeneexpresionprofiledatarelatedtoLUSCnCGA databasewereodroporfselpotsllfaticellU calculatedbyestimatiometodandCiberSortmetodGeneseteichentaalysis（SEA）aspefodoCSF2toevaluateteproportioof TCs，andsoatalssfodtofuteeeelatoseCFndelaedcalusfUCialsn vivoexpermentsthexpresfFaokedutnelloutingit8CK8）eveseorealyisodealingd formationwereusedtoproetheproiferationmigrationndinvasionofLUSCcel.ResultsTheexpressonofCSF2intmoisssas significantlyaaiasdeileU KEGnalysisodatFstetalafootas）o ledtosignfcanteeeicellpolferaoigatodaso（O）.CocsioFaotetialaptic prognostic indicator for TME in LUSC patients.

KeyWords：Lungsquamouscellcarcinoma;Tumormicroenvironment;Colonystimulatingfactor2;Clinicalpathologyandprogosis

肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）占所有非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的 30%^[1] ，在老年男性中更為普遍，并與吸煙密切相關(guān)。LUSC常見于中央性肺癌，并傾向于在胸腔內(nèi)生長(zhǎng)，早期時(shí)常導(dǎo)致支氣管狹窄，生長(zhǎng)緩慢，手術(shù)切除的機(jī)會(huì)更多，5年生存率較高，晚期轉(zhuǎn)移，對(duì)放療和化療的敏感性不如小細(xì)胞未分化癌[.4]。雖然免疫療法在治療LUSC方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但仍存在許多問題。由于LUSC患者腫瘤的高度異質(zhì)性，患者之間免疫治療的臨床效果差異很大5。因此，詳細(xì)地闡明免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，尋找更多的免疫治療靶點(diǎn)和方法具有重要意義。腫瘤微環(huán)境（TME）由細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞、多種細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞組成，在如局部耐藥性、免疫逃逸和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等許多腫瘤的進(jìn)展中至關(guān)重要，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也依賴于TME中多種因素和細(xì)胞的相互作用。因此基于TME的特殊作用，尋找相關(guān)的治療靶點(diǎn)對(duì)腫瘤患者的隨訪治療有很大的幫助。有越來越多的證據(jù)表明了TME在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性，其改變也可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)衰竭[7.8]。有證據(jù)表明[9，10]，TME的成分可以確定癌癥的免疫表型，從而影響患者的預(yù)后。免疫檢查點(diǎn)是免疫逃逸的關(guān)鍵調(diào)控因子，基于免疫檢查點(diǎn)的免疫治療已成為晚期NSCLC[1-13]患者的一種有前景的治療方法。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）與NSCLC的5年生存率顯著相關(guān)，淋巴細(xì)胞豐度低[14，i5]集落刺激因子2（CSF2）是一種單體糖蛋白，通過肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子[。此外，CSF2還是一種廣譜肽因子，可刺激早期造血祖細(xì)胞的增殖[17-19]，主要作用于骨髓祖細(xì)胞并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，通過綁定到高親和力受體，讓它們迅速進(jìn)入細(xì)胞周期分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，最終成為成熟細(xì)胞，可以延長(zhǎng)成熟細(xì)胞的壽命，提高成熟細(xì)胞的功能[16，17]。目前的研究表明，CSF2在肝癌[20]、肺癌[21，22]、食管癌[23，24]、腦膜瘤[25]、血液系統(tǒng)腫瘤[2]等腫瘤中發(fā)揮重要作用。然而，關(guān)于LUSC 患者CSF2表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境、臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系系統(tǒng)研究仍然有限。本研究利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中的估計(jì)和cibers排序兩種計(jì)算方法，獲得LUSC樣本中的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（TICs）比值以及基質(zhì)和免疫成分的比值，并確定CSF2，系統(tǒng)探討CSF2的表達(dá)與LUSC預(yù)后、臨床病理特征及TME的相關(guān)性，比較從LUSC的機(jī)械成分和免疫成分中產(chǎn)生的差異表達(dá)基因，旨在判斷CSF2在LUSCTME中的靶點(diǎn)作用。

1材料與方法

1.1基本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人LUSC細(xì)胞系（A549和H520）購自美國(guó)型培養(yǎng)館藏（ATCC）。在獲得后將這些細(xì)胞系進(jìn)行支原體檢測(cè)，以確保它們未受支原體污染。此外，本研究還獲得了這些細(xì)胞系的STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）分析報(bào)告，確認(rèn)了它們的身份和一致性。細(xì)胞在含 10% 胎牛血清（FBS，Gibco）和 1% 青霉素-鏈霉素溶液的RPMI1-1640培養(yǎng)基（Gibco）中培養(yǎng)，在含有 5% 二氧化碳的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2CSF2敲除為了敲除CSF2在LUSC細(xì)胞系中的表達(dá)，使用靶向CSF2（siCSF2）的小干擾RNA（siR-NA），序列如下： 5^′ -GCAGAGCCTGCTGCTCTTG -3^′ O采用非靶向siRNA（siNC）作為陰性對(duì)照si-NC：5^′-3^′ 。按照制造商的說明，使用脂質(zhì)體3000（Invit-rogen）轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 ^48h 后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot分析驗(yàn)證了基因敲除效率。

1.1.3聚合酶鏈反應(yīng)總RNA提?。菏褂肦NA提取試劑盒（RNA快速提取溶液，賽默飛世爾科學(xué)波羅的海UAB）溶液從LUSC細(xì)胞系（A549和H520）中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqManMicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，賽默費(fèi)舍爾科學(xué)波羅的海大學(xué)UAB），隨機(jī)引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶。采用針對(duì)目標(biāo)基因的特異性引物（CSF2：正向引物 5^′. -GAAT-GCCATCCAGGAGGCCC -3^′ ；反向引物 5^′ -CTTG-TACAGCTCCAGGCGGG-3和GAPDH（正向引物 AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3^′ ；反向引物 5^′- AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3^′ ）進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)建立使用特定的引物針對(duì)感興趣的基因（CSF2）和GAPDHPCR擴(kuò)增是在熱循環(huán)（GenepHlowTM凝膠/PCR試劑盒，基因援助）以下循環(huán)條件：初始變性 ，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括 95^°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72^°C 延伸 30s. 最后在 72^°C 進(jìn)行 5min 延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察。對(duì)于CSF2和GAPDH的表達(dá)數(shù)據(jù)，將靶基因CSF2的Ct值與內(nèi)參基因GAPDH的Ct值歸一化。比較CSF2的平均Ct值和GAPDH的平均Ct值。該計(jì)算基于 值進(jìn)行。

1.1.4細(xì)胞增殖試驗(yàn)根據(jù)說明書使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試驗(yàn)（Dojindo）測(cè)定細(xì)胞增殖率。將細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)24、48和 ^72h 。然后，每孔加入 10μlCCK-8 溶液，在 37^°C 下再孵育 2h 用酶標(biāo)儀測(cè)定 450nm 處的吸光度，以測(cè)定細(xì)胞活力。1.1.5遷移和入侵分析分別使用傷口愈合法和Transwell試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲情況。在傷口愈合試驗(yàn)中，細(xì)胞被接種到6孔板中，培養(yǎng)直至達(dá)到90% 的融合度。使用無菌移液管尖端創(chuàng)建劃痕傷口，然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在受傷后 0h 和24h 采集傷口圖像，以確定遷移率。在Transwell侵襲試驗(yàn)中，將細(xì)胞接種到無血清培養(yǎng)基中涂有基質(zhì)的Matrigel（BD生物科學(xué)）的上腔室。將含有 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基加入下腔室作為化學(xué)引誘劑。孵育24h 后，將通過基質(zhì)膠包膜的細(xì)胞固定，染色，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.1.6菌落形成試驗(yàn)共計(jì)2000個(gè)細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)以形成集落。培養(yǎng)1周后，用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色。將培養(yǎng)血拍照并記錄。

1.2生存分析 本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdcgdc.cancer.gov/，level3）中下載551例LUSC患者（正常組49例和腫瘤組502例）的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。使用R語言（ver-sion4.1.1）的ESTIMATE算法，加載ESTIMATE軟件包（version1.0.13），用于估計(jì)所有樣本腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫成分和基質(zhì)成分的百分比，這些結(jié)果以3個(gè)評(píng)分的形式分別表示：ESTIMATEScore、Stro-malScore 和ImmuneScore。ESTIMATEScoreStroma-IScore和ImmuneScore由ESTIMATE（基于表達(dá)數(shù)據(jù)評(píng)估腫瘤組織中基質(zhì)的免疫細(xì)胞）算法計(jì)算得出。采用R語言進(jìn)行生存分析。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，采用Log-rank進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義檢驗(yàn)， Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3KEGG和GO富集分析根據(jù)間質(zhì)和中位數(shù)的比較，502個(gè)腫瘤樣本被標(biāo)記為低或高評(píng)分，對(duì)差異基因表達(dá)進(jìn)行分析，通過比較低評(píng)分和高評(píng)分樣本生成差異表達(dá)譜（DEGs）。使用聚類分析器（ver-sion4.4.4 ）、RichPlot（version1.18.3）和ggplot2（ver-sion3.3.6）對(duì)1616個(gè)DEGs在R中進(jìn)行KEGG和

GO富集分析。從TCGA網(wǎng)站下載LUSC標(biāo)本的臨床病理特征對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)。采用R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)作為顯著性檢驗(yàn)方法，并比較不同的臨床分期。然后利用Cytoscape（version3.8.2）進(jìn)行重建。用R語言加載軟件包的單變量Cox回歸分析的生存率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分類變量采用皮爾遜卡方檢驗(yàn)。夏皮羅-威爾克檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)連續(xù)變量的正態(tài)性。當(dāng)連續(xù)變量符合正態(tài)分布時(shí)，采用t檢驗(yàn)和單向方差分析來評(píng)價(jià)兩組或多組之間的差異。如果連續(xù)變量不符合正態(tài)分布，采用威爾coxon秩檢驗(yàn)和克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存分析的Log-rank檢驗(yàn)來估計(jì)各組間的具體差異。所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用R軟件及其相應(yīng)的軟件包進(jìn)行， Plt; 0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基質(zhì)與免疫與LUSC患者生存的關(guān)系及預(yù)后通過Kaplan-Meier生存分析研究評(píng)估評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分之間的相關(guān)性，以及它們對(duì)生存率和基質(zhì)比的影響。若基質(zhì)評(píng)分較高或免疫評(píng)分較高，表明TME中存在較大的基質(zhì)或免疫成分。圖1A為免疫評(píng)分，通過Log-rank檢驗(yàn)， P=0.250 ，表明兩組間生存差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖1B為基質(zhì)蛋白評(píng)分（ P= 0.129），未能觀察到顯著的生存差異，圖1C為ES-TIMATE評(píng)分，為基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分的總和，表示TME中基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分的綜合比率（ P= 0.061），未能觀察到顯著的生存差異。

2.2LUSC患者的臨床病理分期和免疫評(píng)分的相關(guān)性研究由2.1可知基質(zhì)蛋白評(píng)分和免疫評(píng)分與患者的生存率沒有相關(guān)性。因此進(jìn)一步分析了臨床病理分期與評(píng)分之間的關(guān)系，如圖2所示，免疫評(píng)分和估計(jì)評(píng)分存在性別差異。觀察到免疫評(píng)分（圖2A）、基質(zhì)蛋白評(píng)分（圖2B）和ESTIMATES評(píng)分（圖2C）與患者診斷時(shí)的年齡之間存在顯著的相關(guān)性。與男性相比，女性的免疫評(píng)分（ P=0.00049 ）和ESTI-MATES評(píng)分 P=0.0094 ）較高（圖2D、圖2F），男女基質(zhì)評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2E）。不僅如此，免疫評(píng)分（圖2G）基質(zhì)評(píng)分（圖2H）和ESTIMATE評(píng)分（圖2I）與腫瘤的臨床T分期存在相關(guān)性。同樣，免疫評(píng)分（圖2J）基質(zhì)評(píng)分（圖2K）和ESTIMATE評(píng)分（圖2L）與腫瘤的臨床N分期之間存在顯著相關(guān)性。進(jìn)一步采用Kaplan-Meier方法來評(píng)估分類的LUSC患者的生存結(jié)果，雖然結(jié)果顯示出顯著性趨勢(shì)（Log-rank檢驗(yàn) P=0.061 ），但仍需要對(duì)更大的患者隊(duì)列進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)查以明確關(guān)聯(lián)，其余有顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)表明免疫評(píng)分與性別可能有關(guān)。

圖2免疫評(píng)分與基質(zhì)評(píng)分及ESTIMATE評(píng)分與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：A～C：免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分與 ESTIMATE評(píng)分與腫瘤病理年齡的相關(guān)性;D-F：免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分與 ESTIMATE評(píng)分與患者性別的相關(guān)性;G～I(xiàn)：免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分與 ESTIMATE評(píng)分與腫瘤臨床T分期的相關(guān)性;J-L：免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分與 ESTIMATE評(píng)分與腫瘤臨床N分期的相關(guān)性分析。

2.3免疫相關(guān)基因富集進(jìn)一步對(duì)低評(píng)分樣本和高評(píng)分樣本進(jìn)行比較分析，以確定TME中基質(zhì)和免疫成分基因譜的確切變化。與中間基因相比，免疫評(píng)分（低評(píng)分和高評(píng)分樣本）獲得2266個(gè)DEGs，其中1924個(gè)基因升高，342個(gè)基因減少（圖3A）。在基質(zhì)評(píng)分中共獲得2177個(gè)DEGs，其中1853個(gè)提高基因和324個(gè)下降基因（圖3B）。Venn圖所示的交叉點(diǎn)分析顯示，在免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分中，總共有1458個(gè)升高基因和157個(gè)減少基因共享高得分和低得分（圖3C、圖3D），這些DEGs（1615個(gè)基因）可能是TME狀態(tài)的決定因素。GO富集分析和KEGG（圖3E、圖3F）顯示，差異表達(dá)基因幾乎與免疫相關(guān)的GO術(shù)語以及與免疫反應(yīng)激活信號(hào)通路和免疫反應(yīng)激活細(xì)胞表面受體信號(hào)通路相關(guān)的KEGG術(shù)語相匹配。

2.4PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析和COX回歸分析為了進(jìn)一步研究其潛在機(jī)制，繼續(xù)使用Cytoscape軟件（Na-tionalInstituteofGeneralMedicalSciences，NIGMS）構(gòu)建了一個(gè)基于字符串?dāng)?shù)據(jù)庫的PPI網(wǎng)絡(luò)。圖4A顯示了534個(gè)基因之間的相互作用，按節(jié)點(diǎn)數(shù)排序的前30個(gè)基因。對(duì)551例LUSC患者進(jìn)行Cox回歸分析，以了解哪些因素是LUSC患者生存的主要原因。隨后對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果與Cox回歸中前16個(gè)因子的交集進(jìn)行分析，只有CSF2重疊。

圖3熱圖、KEGG和GO的富集分析

注：A：熱圖展示了通過低免疫評(píng)分與高免疫評(píng)分比較聚類得到的DEGs。行名和列名分別代表基因名稱和樣本編號(hào)。B：對(duì)數(shù)變換后 fold-change大于1，并通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（ q=0.05 作為DEGs顯著性的閾值標(biāo)準(zhǔn)。C、D：使用Venn 圖展示在基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分中共有的上調(diào)和下調(diào)DEGs，其中 log₂ 變換后的fold-change大于1且 q 值小于0.05被設(shè)定為適宜的篩選閾值。E、F：對(duì)551個(gè)DEGs進(jìn)行了KEGG和GO富集分析， q 值小于0.05的富集被認(rèn)為具有顯著差異。

2.5CSF2表達(dá)與LUSC患者生存率、年齡、性別和TNM分期的相關(guān)性進(jìn)一步將LUSC樣本分為CSF2低表達(dá)組和高表達(dá)組進(jìn)行比較，并與CSF2的中位表達(dá)量進(jìn)行比較。生存分析顯示，正常組織中CSF2表達(dá)低于LUSC患者腫瘤組織中CSF2的表達(dá)（圖5A）。同一患者腫瘤和正常樣本配對(duì)驗(yàn)證分析提示，正常組織中CSF2的表達(dá)高于相配對(duì)的腫瘤組織，結(jié)果見圖5B，CSF2高表達(dá)的LUSC患者的生存率較低（圖5C）。分析不同階段CSF2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示I期與Ⅲ期（ P=0.035 ）存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且Ⅲ期CSF2的表達(dá)量低于I期（圖5D）。這些結(jié)果也提示了TME中CSF2的表達(dá)與LUSC患者的預(yù)后呈顯著正相關(guān)（圖5D～圖5G）。在N分期中， N₀ 與 N₁ （ P=0.011 和 N₂（ΔP=0.028） 之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著N分期的進(jìn)展，CSF2的表達(dá)下降（圖5G），其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6CSF2的基因集合富集分析根據(jù)表達(dá)水平將樣本分為CSF2低表達(dá)和高表達(dá)組。使用GSEA（ver-sion4.1.0）進(jìn)行分析。在CSF2高表達(dá)的組中，該基因主要富集于自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的趨化因子信號(hào)通路和細(xì)胞毒性中（圖6A）。然而，在CSF2低表達(dá)的組中，該基因主要在剪接體和細(xì)胞周期中富集（圖6B）。研究結(jié)果表明，CSF2可能是TME狀態(tài)的一個(gè)潛在指標(biāo)。

2.7TICs比值與CSF2的關(guān)系進(jìn)一步評(píng)估LUSC樣品中22個(gè)TICs的比值。隨后進(jìn)行相關(guān)性和差異分析，以進(jìn)一步證實(shí)TME和CSF2之間的關(guān)聯(lián)。方差分析顯示，有10個(gè)TICs與CSF2的表達(dá)相關(guān)（圖7A）。相關(guān)分析顯示，相同的10個(gè)TICs與CSF2的表達(dá)水平相關(guān)（圖7B），通過相關(guān)性和差異性測(cè)試識(shí)別出的8種TICs與CSF2表達(dá)的關(guān)聯(lián)（圖7C）。

2.8敲除CSF2基因可抑制LUSC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲為了研究CSF2在LUSC中的作用，本研究進(jìn)一步評(píng)估了CSF2對(duì)LUSC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。首先，在4種LUSC細(xì)胞系（即SK-MES-1、

BEAS-2B、H226和H1703）中檢測(cè)到CSF2，其中H226和H1703細(xì)胞中CSF2高表達(dá)（ Plt;0.001 （圖8A）。接下來使用3種特異性siRNAs沉默H1703和H226細(xì)胞中CSF2的表達(dá)。轉(zhuǎn)染并孵育 ^48h 后，RT-qPCR 檢測(cè)到 siRNAs 對(duì) H226、H1703和SKMES-1細(xì)胞的干擾效率，結(jié)果顯示siRNAC1S-3的沉默效率最高 Plt;0.05 （圖8B～圖8D）。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與NC組相比，敲除CSF2基因可顯著降低H1703和H226細(xì)胞的存活率 Plt;0.05 （圖8E）。為進(jìn)一步探討CSF2在LUSC細(xì)胞侵襲及遷移過程中的作用完善了創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)。即在H226和H1703細(xì)胞中敲除CSF2，抑制了LUSC細(xì)胞在培養(yǎng) 24h 后的遷移能力（圖8F）。除此之外，Transwell分析顯示，敲除CSF2基因降低了H1703和H226的侵襲和遷移能力（圖8G），并且克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示了H226和H1703細(xì)胞的增殖能力（圖8H）。

注：A：腫瘤與正常樣本中CSF2基因的差異表達(dá);B：來自同一患者的腫瘤和正常樣本中CSF2表達(dá)的配對(duì)差異分析（通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)， P=1.501e-11 ）;C：根據(jù)CSF2不同表達(dá)水平對(duì)LUSC患者的生存分析;D～G：CSF2表達(dá)與臨床病理分期特征之間的關(guān)聯(lián)。

圖5CSF2基因在樣本中的差異表達(dá)及其與LUSC患者臨床病理分期及生存特征的關(guān)系

注：A：CSF2高表達(dá)樣本中的富集通路；B：CSF2低表達(dá)樣本中的富集通路。

圖6CSF2基因的基因集富集分析

圖7TICs比例與CSF2表達(dá)量的關(guān)系

注：A：相對(duì)于CSF2表達(dá)中位數(shù)，高低CSF2表達(dá)的LUSC腫瘤樣本中21種免疫細(xì)胞的比例差異;B：12種TICs比例與CSF2表達(dá)之間的關(guān)聯(lián) （Plt;0.05） ；每圖中的直線代表聯(lián)合線性模型，指示免疫細(xì)胞比例與CSF2表達(dá)量的增比趨勢(shì)；C： Venn 圖8種TICs與CSF2表達(dá)的關(guān)聯(lián)的Venn圖。

注：A：相對(duì)于CSF2表達(dá)中位數(shù)，高低CSF2表達(dá)的LUSC腫瘤樣本中21種免疫細(xì)胞的比例差異;B：12種TICs比例與CSF2表達(dá)之間的關(guān)聯(lián) （Plt;0.05） ；每圖中的直線代表聯(lián)合線性模型，指示免疫細(xì)胞比例與CSF2表達(dá)量的增比趨勢(shì)；C： Venn 圖8種TICs與CSF2表達(dá)的關(guān)聯(lián)的Venn 圖。

圖8CSF2基因敲低抑制LUSC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力

注：A：細(xì)胞系中CSF2的mRNA表達(dá)水平;B、D：三種特異性siRNA在SK-MES-1、H1703和H226細(xì)胞中沉默 CSF2的表達(dá);E：CSF2基因敲除對(duì)H1703和H226細(xì)胞存活率的影響;F：CSF2基因敲除對(duì)H1703和H226 細(xì)胞遷移能力的影響；比例尺： 10μm;G 利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估CSF2基因敲除對(duì)H1703和H226細(xì)胞遷移能力的影響；比例尺： 100μm ;H： _H226 和 H1703 細(xì)胞的增殖能力;培養(yǎng)皿尺寸：直徑 100mm 樣本數(shù)量： n=3 ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ^***Plt;0.0001 （204號(hào)

注：A：細(xì)胞系中CSF2的 mRNA 表達(dá)水平； ^B，D ：三種特異性siRNA在SK-MES-1、H1703和H226細(xì)胞中沉默CSF2的表達(dá)；E：CSF2基因敲除對(duì)H1703和H226細(xì)胞存活率的影響;F：CSF2基因敲除對(duì) H1703和H226 細(xì)胞遷移能力的影響；比例尺： 10μm;G; 利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估CSF2基因敲除對(duì)H1703和H226細(xì)胞遷移能力的影響;比例尺： 100μm ；H：H226和 H1703 細(xì)胞的增殖能力；培養(yǎng)皿尺寸：直徑 100mm 樣本數(shù)量： n=3 ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ^***Plt;0.0001 。

圖8CSF2基因敲低抑制LUSC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力（續(xù)）

3討論

本研究嘗試從TCGA數(shù)據(jù)庫中定義幾個(gè)可能與LUSC患者的TNM分期和生存相關(guān)的TME相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因在不同TNM階段的表達(dá)存在顯著差異（ Plt;0.05 ）。CSF2已被證明與免疫活性有關(guān)。通過更多的生物信息演示不難發(fā)現(xiàn)，CSF2可能是LUSC患者TME狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。TME在腫瘤的進(jìn)展中為關(guān)鍵的環(huán)境因素，探索潛在的治療靶點(diǎn)將有助于重塑TME，從促進(jìn)腫瘤發(fā)展到抑制腫瘤。本研究分析了在TCGA數(shù)據(jù)庫中挖掘到的LUSC數(shù)據(jù)，以及TME的免疫學(xué)成分對(duì)患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示TME中間充質(zhì)/免疫成分的比例與LUSC進(jìn)展顯著相關(guān)（ Plt;0.05） ，這些發(fā)現(xiàn)突出了免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的含義，并為開發(fā)更有效的治療方案的潛力提供了新的見解。近年來，免疫治療也已應(yīng)用于臨床，ICIs作為晚期NSCLC患者的首選藥物也已被認(rèn)可[27.28]。然而，程序性死亡配體1（PD-L1）可能不是確定其使用的有效指標(biāo)[29.30]NSCLC作為一種異質(zhì)性腫瘤，長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是一種非免疫原性腫瘤3]。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)[2-34]，NSCLC中腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性和位點(diǎn)特異性的克隆TIL擴(kuò)增，這與上述研究矛盾。此外，術(shù)前淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較小提示早期NSCLC患者預(yù)后較差。雖然ICIs對(duì)治療NSCLC有顯著的療效，但其與免疫相關(guān)的各種副作用仍不容忽視。因此，ICIs的選擇將為NSCLC的免疫治療方案提供新的參考。本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中LUSC的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LUSC的低表達(dá)與晚期臨床病理特征（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期）和不良預(yù)后密切相關(guān)（ Plt;0.05） ，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CSF2表達(dá)的減少與不良預(yù)后和與前者相同的臨床特征密切相關(guān)（ Plt;0.01 ；進(jìn)一步通過相關(guān)性和差異性測(cè)試分析，識(shí)別出多種TICs與CSF2表達(dá)的關(guān)聯(lián)（ _{（Plt;0.05）} ，最后通過體外實(shí)驗(yàn)得出，在H226和H1703細(xì)胞中敲低CSF2的表達(dá)，降低了LUSC細(xì)胞在培養(yǎng) 24h 后的侵襲和遷移能力（ Plt;0.05 ；反之，克隆形成實(shí)驗(yàn)卻顯現(xiàn)出對(duì)H226和H1703細(xì)胞的增殖能力的促進(jìn)作用（ Plt;0.05） ，明確了CSF2對(duì)LUSC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。因此，本研究推斷CSF2可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，并可能成為L(zhǎng)USC患者TME的預(yù)后指標(biāo)。

CSF2是一種單體糖蛋白，由肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子[。CSF2在早期造血中刺激祖細(xì)胞增殖[17-19]，主要作用于骨髓祖細(xì)胞，并且發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)；通過綁定高親和力受體，使其快速進(jìn)入細(xì)胞周期分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，最終成為成熟細(xì)胞，可以延長(zhǎng)成熟細(xì)胞的壽命，提高成熟細(xì)胞[16，17的功能。與特異性促進(jìn)中性粒細(xì)胞增殖和成熟的粒細(xì)胞集落刺激因子不同，CSF2可以對(duì)更廣泛的細(xì)胞類型產(chǎn)生影響，特別是嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[36.37]。

CSF2也稱白細(xì)胞生長(zhǎng)因子[，促進(jìn)干細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞和粒細(xì)胞（嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）的細(xì)胞。單核細(xì)胞離開血液循環(huán)，然后遷移到組織中，成熟為樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[16.38.39]。因此，它是炎癥/免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)組成部分，通過激活少量的巨噬細(xì)胞，可以迅速導(dǎo)致其數(shù)量的增加，成為對(duì)抗感染的一個(gè)關(guān)鍵過程。CSF2對(duì)免疫系統(tǒng)的成熟細(xì)胞也有一些影響。這些作用包括抑制中性粒細(xì)胞的遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體[4表達(dá)的改變等。本研究利用ESTEST算法對(duì)LUSC樣本進(jìn)行功能富集分析和LUSC中TME相關(guān)基因的測(cè)定。

綜上所述，CSF2是LUSC患者潛在的重要預(yù)后因素。此外，CSF2可能是TME狀態(tài)從免疫優(yōu)勢(shì)向代謝優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變的一個(gè)指標(biāo)。因此，在LUSC患者使用CSF2抑制劑治療前，應(yīng)進(jìn)一步綜合分析CSF2的表達(dá)、腫瘤侵襲性免疫細(xì)胞亞型的數(shù)量以及突變驅(qū)動(dòng)型的準(zhǔn)確性。

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編輯/肖婷婷