耐受性酵母的篩選及其在弼猴桃果酒中的應(yīng)用研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.013

中圖分類號：TS262.7 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）07-0090-06

Screening of Tolerant Yeasts and Their Application in Kiwifruit Wine

CHEN Jing12，HUANG Yi-fen3， ZUO Yong3，TANG Yuan-mou1， ZHANG Jing1，2* （1.College of Food and Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu 61OlO6，China; 2.Key Laboratory of Solid-state Fermentation Resource Utilization in Sichuan Province， Yibin University，Yibin 644OoO，China；3.College ofLife Science， Sichuan Normal University，Chengdu 6lolol，China）

Abstract： Sugar-tolerant and acid-tolerant yeast strains are screened and applied in the fermentation process of kiwifruit wine. The effects of diferent strains on the physicochemical indexes，organic acid content and flavor substances during kiwifruit wine fermentation are explored. The results show that six strains of non-Saccharomyces cereuisiae are screened， namely Pichia kudriauzevii， Pichia guilliermondi ， Meyerozyma caribca， Zygosaccharomyces rouxii ， Hanseniaspora uuarum and Saccharomycopsis fibuligera. The physicochemical properties and aroma characteristics of the products fermented by diffrent yeast strains are compared and analyzed. The results show that the fruit wine fermented by the screened yeast strains could not only reduce the total acid content，but also improve the antioxidant activity，which is beneficial to the improvement of fruit wine quality. Single strain fermentation of Pichia kudriauzeui ， Zygosaccharomyces rourii and Hanseniaspora uuarum could significantly increase the level and complexity of aroma substances in kiwifruit wine.

Keywords：strain screening；kiwifruit wine；flavor substances

獼猴桃果實富含膳食纖維、氨基酸、多酚、維生素和礦物質(zhì)元素等，被譽為“維生素C之王\"[1-2]，但不耐貯藏[3-4]。為充分利用獼猴桃資源，將其進行精深加工，可有效保持水果的營養(yǎng)功能成分以及提升其附加值。弼猴桃常見的精深加工產(chǎn)品主要有弼猴桃果酒、果醋、果脯和果醬等，弼猴桃果酒和果醋經(jīng)微生物發(fā)酵而成，其口感獨特、香氣濃郁，在市場上的認可度較高，深受消費者喜愛[5]。在獼猴桃果酒釀造過程中，主要依靠釀酒酵母和非釀酒酵母進行發(fā)酵。酵母發(fā)酵的主要碳源是糖類，糖濃度高則滲透壓高，會導(dǎo)致酵母出現(xiàn)失水甚至死亡的現(xiàn)象[6]。不能在高糖條件下良好發(fā)酵的酵母菌株，其產(chǎn)酒率必然大受影響[。酵母的耐酸性是影響發(fā)酵能力的重要因素，酸的累積會使酵母菌的生長代謝受到抑制，生產(chǎn)性能下降[8]。篩選出耐受性較好的酵母菌株能在一定程度上解決這些問題，提高發(fā)酵效率，對果酒發(fā)酵有益，同時，酒精發(fā)酵作為果醋生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，耐受性酵母菌的篩選也可為弼猴桃果醋釀造提供優(yōu)良菌株，提升果醋品質(zhì)，豐富產(chǎn)品風(fēng)味[9]?；诖?，本試驗篩選出耐糖、耐酸酵母菌株，并將其引入弼猴桃果酒釀造來研究其在果酒釀造中的發(fā)酵特性。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

弼猴桃：市售；瓊脂糖：北京博美富鑫科技有限公司；瓊脂、葡萄糖、氯霉素、蛋白肺、酵母浸粉、酒石酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；濃硫酸：北京康普匯維科技有限公司；偏重亞硫酸鉀：合肥禾興生物科技有限公司；水果大曲：永州市雅大科技實業(yè)有限公司；果膠酶 （500U/mg） ：上海源葉生物科技有限公司。

培養(yǎng)基配方：葡萄糖 20g ，蛋白陳 20g ，酵母浸粉10g ，瓊脂 20g ，蒸餾水 1000mL ，氯霉素 0.1g/L 。

1.2 儀器與設(shè)備

WYT-J型手持糖度計成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；ST2100型實驗室 ΔpH 計奧豪斯儀器（常州）有限公司；JB-CJ-1A凈化工作臺天根生化科技（北京）有限公司；SHP-5O生化培養(yǎng)箱北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司;HH-W60O 數(shù)顯三用恒溫水箱上海左樂儀器有限公司；X-90型料理機深圳市德瑞仕工業(yè)技術(shù)有限公司；T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GCMS-QP2020NX氣質(zhì)聯(lián)用儀日本島津公司；HNY-2102CD智能恒溫振蕩培養(yǎng)箱天津歐諾儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1耐酸、耐糖菌株的篩選及鑒定

將弼猴桃破碎后，稱取弼猴桃、土壤、水果大曲各5g ，分別加入含有 50mL 無菌水的錐形瓶中， 、180r/min 恒溫振蕩 24h 制備菌懸液。將得到的菌懸液從恒溫振蕩器中取出后靜置 10min ，在超凈工作臺上取上清液 1mL 進行梯度稀釋 （10^-1～10^-7 ），取 100μL 分別涂布于含有 1% 乳酸的 6%10%1.15%.20% 葡萄糖YPD固體培養(yǎng)基上和含有 1% 酒石酸的 6%.10% 、15%.20% 葡萄糖YPD固體培養(yǎng)基上，置于 30^°C 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 2～3d ，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單個菌落進行3次分離純化。

將篩選得到的菌株活化后，取適量的菌液提取DNA，用真菌通用引物（ITS1： 5^′. TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3^′ ITS4 ： 5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- ?3^′ ）擴增基因組DNA，將得到的PCR產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。將測序得到的基因序列輸入NCBI（National CenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性在線比對，并用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[10]。

1.3.2獼猴桃果酒發(fā)酵

選擇八九分成熟度、均勻一致的新鮮弼猴桃，以奶昔模式將果肉和清水以 1：1 榨汁 30s ，加入 0.45g/L 果膠酶，在 25°C 下酶解 24h 。加人偏重亞硫酸鉀 56mg/L 將糖度調(diào)整為 21^°Brix，144.35g/L，pH 值調(diào)整為3.5。接種量為 1×10⁷CFU/mL ，在 28°C 恒溫發(fā)酵7d，每隔24h 記錄質(zhì)量和產(chǎn)氣情況。發(fā)酵完成后以 9000r/min 離心 10min ，取上清液進行指標(biāo)檢測。

將庫德畢赤酵母（A）、季也蒙畢赤酵母（B）、卡利比克邁耶氏酵母（C）、魯氏接合酵母（D）、有孢漢遜酵母（E）、扣囊復(fù)膜孢酵母（F）單菌引入獼猴桃果酒釀造中后，再分別與安琪酵母進行等比例混合發(fā)酵，各組依次命名為HA、HB、HC、HD、HE、HF，以純安琪酵母發(fā)酵、弼猴桃原汁為對照組，記為AQ、Y。

1.3.3 弼猴桃果酒指標(biāo)測定

1.3.3.1理化指標(biāo)測定

根據(jù)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定總酸含量；乙醇體積分數(shù)采用分光光度計法測定[11]；殘?zhí)呛坎捎肈NS 法測定[2]； pH 值采用pH 計測定；參考章慧等[13]的福林酚法測定總多酚含量；參考陳紹依等[14]的方法測定總黃酮含量。

1.3.3.2有機酸含量測定

色譜柱：AgilentZORBAX SB-Aq（4.6mm×250mm 5μm） ；流動相： 40mmol/L 磷酸二氫鉀：甲醇為 99：1 并使用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至2.7。等度洗脫，柱溫 30°C ;檢測波長 210nm ;進樣量 20μL ；流速 0.8mL/min 。

1.3.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

使用GC-MS對獼猴桃果酒進行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定，在裝有磁力攪拌棒的頂空瓶中加入 2gNaCl 、4mL 超純水、 .1mL 酒樣，最后加入 10μL 標(biāo)準(zhǔn)品。將頂空瓶置于 60°C 水浴鍋中，插入固相微萃取針，并將微萃取頭（DVB/CAR/PDMS， 50/30μm） 伸出置于頂空瓶上空，于 60^°C 吸附萃取 45min 。

色譜柱： HP-INNOWax（60m×0.25μm，0.25mm） ：氮氣流速 1mL/min ;不分流進樣，初始溫度 40°C ，保持5min ，以 4^°C/min 升溫至 100^°C ，再以 6^°C/min 升溫至230°C ，保持 10min ；進樣口溫度 250^°C 。電子電離（electronicionization，EI源，接口溫度 250^°C ，離子源溫度 230°C ，電子能量 70eV ，質(zhì)譜掃描范圍 （m/z ” ，溶劑延遲時間 1min 。

1.3.4數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析

采用MicrosoftExcel2019整理試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS25.0進行方差分析和鄧肯檢驗，采用Origin2021繪圖。采用Rversion4.1.2對弼猴桃果酒風(fēng)味物質(zhì)的動態(tài)變化進行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1耐酸、耐糖菌株的篩選結(jié)果及鑒定

本試驗采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法在不同糖濃度（ 6% 、10% 、15%、 20% 葡萄糖）和不同有機酸（ 1% 乳酸、 1% 酒石酸）的雙脅迫下分離、篩選獲得6株酵母菌株。在15% 葡萄糖、 1% 乳酸培養(yǎng)基上分離得到NO1菌株，在20% 葡萄糖、 1% 乳酸培養(yǎng)基上分離得到NO2、N03菌株，在 10% 葡萄糖、 1% 酒石酸培養(yǎng)基上分離得到NO4、NO5、N06菌株，對這6株菌進行鑒定。

以ITS1、ITS4為引物進行基因組DNA擴增，擴增后得到的電泳圖見圖1。

Fig.1Electrophoresisresultsof PCR amplification products由圖1可知，6個條帶均清晰明亮，大小約為 800bp 0將得到的PCR產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果進行鑒定，結(jié)果見表1。

由表1可知，菌株N01、N02、N03、N04、N05、N06分別鑒定為庫德畢赤酵母（Pichiakudriauzeuii）季也蒙畢赤酵母（Pichiaguilliermondii）、卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozymacaribbica）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）有孢漢遜酵母（Hanseniasporauuarum）、扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsisfibuligera）。

2.2弼猴桃果酒發(fā)酵質(zhì)量變化

酵母菌發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)物有 CO₂ ，因此檢測發(fā)酵過程中的失重變化能夠很好地反映其發(fā)酵效率[15-16]。由圖2可知，對照組AQ的弼猴桃果酒質(zhì)量總體呈先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢，失重為 （6，07±0.17） ！ Φ_g 。D、E、F組的質(zhì)量變化趨勢與對照組類似，失重分別為 （6.07±0.03） ，1 3，60±0.10） ，（3.80士0.10）g，說明D組的發(fā)酵效率高于E、F組。隨著發(fā)酵的進行，A、B、C組的質(zhì)量略微下降或基本保持不變，說明這類酵母不能單獨完成發(fā)酵?？傮w來看，大部分非釀酒酵母的發(fā)酵效率低于釀酒酵母。

Fig.2 Change of fermentation weight of fruit wine

注：A為庫德畢赤酵母；B為季也蒙畢赤酵母；C為卡利比克邁耶氏酵母；D為魯氏接合酵母；E為有孢漢遜酵母；F為扣囊復(fù)膜孢酵母；AQ為安琪釀酒酵母；Y為弼猴桃原汁；下同。

2.3不同酵母發(fā)酵獼猴桃果酒的理化指標(biāo)

表2不同單菌發(fā)酵產(chǎn)品的理化指標(biāo) Table2 Physicochemicalindexes ofproducts fermented bydifferent single strain

注：同列相同小寫字母表示差異不顯著 （Pgt;0，05） ，同列不同小寫字母表示差異顯著 （Plt;0.05 ，Y為獼猴桃原汁，“一”表示未檢出，下表同。

由表2可知，發(fā)酵結(jié)束后，D、E、F組的酒精度高于A、B、C組，殘?zhí)橇匡@著低于A、B、C組（ ?Plt;0.05） ，這與前面發(fā)酵效率的結(jié)果一致。各組的總酸含量均低于獼猴桃原汁，說明將弼猴桃引入果酒釀造中可以降低總酸含量。各酒樣整體 pH 值保持在 3. 04～3. 69 之間。其中，A、B、E組的 pH 值分別為 3.04±0.08，3.41±0.03 3.48±0.02 ，而果酒發(fā)酵最佳 pH 值在 3.5～4.2 之間，較低的pH值可能會抑制其生長，不利于發(fā)酵[17]。

多酚是存在于果酒中的次生代謝物，有助于提高果酒口感、穩(wěn)定果酒顏色、保留香氣成分等[18]。各組的總多酚含量均高于AQ組，說明將非釀酒酵母單菌引入弼猴桃果酒釀造中有利于提高多酚類物質(zhì)的保留率，對果酒品質(zhì)的提升有益。黃酮類物質(zhì)包括黃酮、異黃酮、二氫黃酮、查爾酮、黃酮醇、二氫黃酮醇等化合物，具有抗癌、抗氧化、抗衰老等功效[19]。各酒樣的總黃酮含量與弼猴桃原汁相比均有所降低，可能是由于黃酮的穩(wěn)定性較差，且發(fā)酵液中的酶促反應(yīng)、非酶促褐變和氧化反應(yīng)都會降低總黃酮的含量[20]。

2.4不同酵母發(fā)酵獼猴桃果酒的有機酸含量

6種有機酸的HPLC色譜圖見圖3，由于保留時間不同，從左至右的峰依次為草酸、奎寧酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸。

由圖3可知，6種有機酸出峰較好，可以滿足多種有機酸的同時分離。

表3有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)

由表3可知，有機酸各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與峰面積呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在 0.9999～1.0000 之間。

果酒中有機酸的濃度是影響感官特性的重要因素[21]，有機酸還能維持果酒的品質(zhì)和營養(yǎng)價值[22]。根據(jù)有機酸對果酒品質(zhì)的作用不同，可分為對風(fēng)味構(gòu)成有利的有機酸（如檸檬酸、蘋果酸、乳酸等）以及對果酒品質(zhì)不利、在生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免的有機酸（如富馬酸）[23]

表4不同單菌發(fā)酵產(chǎn)品的有機酸含量

由表4可知，6種單菌發(fā)酵產(chǎn)品中均檢測出草酸、奎寧酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸，其中奎寧酸和乳酸是弼猴桃果酒中的主要有機酸。

A組的奎寧酸含量顯著高于其他組 （Plt;0.05） ，而過高的奎寧酸會使酒體苦澀，對弼猴桃果酒的風(fēng)味不利[24]果酒中的乳酸與檸檬酸具有相似的作用，是一種有益于果酒的不揮發(fā)性酸，有助于提升酒體的口感[25]。A、D、E組中的乳酸含量較高，分別為 6.04±0.23 ， （5.06± 0.13）， （5.91±0.30 ）mg/mL;A組的檸檬酸含量最高，為 1.84±0.19 ）mg/mL。因為蘋果酸含有較高的酸度，所以它會對果酒的口感和風(fēng)味產(chǎn)生比較顯著的影響[26]。D、E、F組中的蘋果酸含量高于其他組，分別為中 2.13±0.04 ，（2.23±0.40），（3.03±0.08）mg/mL，在發(fā)酵過程中，蘋果酸還可作為一種碳源被酵母菌分解利用并轉(zhuǎn)化為其他有機酸[27]，而草酸、富馬酸在獼猴桃果酒中的含量極低。

2.5獼猴桃果酒的風(fēng)味物質(zhì)含量

本研究采用SPME-GC-MS法檢測了不同酵母單菌發(fā)酵產(chǎn)品中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，共檢測到7類風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類、酯類、酸類、酚類、醛類、酮類及其他類物質(zhì)。

酯類是果酒中的主要呈香物質(zhì)，主要在發(fā)酵和老化期間通過醇類與脂肪酸的酯化作用形成[28-30]。A、D、E組的酯類物質(zhì)含量較高，說明庫德畢赤酵母（Pichiakudriauzeuii）魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）、有孢漢遜酵母（Hanseniasporauuarum）可以有效地豐富香氣物質(zhì)的復(fù)雜度。

乙醇、異戊醇、苯乙醇、異丁醇、正己醇是弼猴桃果酒產(chǎn)生的主要醇類物質(zhì)，能賦予其玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香以及各類水果香[31]，對風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生積極的影響。D組的醇類物質(zhì)含量最高，為 （2782.70±148.28） ） μg/L 其他組的醇類物質(zhì)含量均低于對照組AQ，說明不同酵母單菌發(fā)酵在調(diào)節(jié)弼猴桃果酒香氣方面發(fā)揮作用，菌株代謝不同可能導(dǎo)致其香氣物質(zhì)含量產(chǎn)生差異。

揮發(fā)性脂肪酸是生成酯類物質(zhì)的必要中間體，適量添加可賦予果酒豐腴清新的口感，但添加過多可能導(dǎo)致果酒呈現(xiàn)刺鼻的氣味[32]。各組酸類物質(zhì)的含量均低于對照組AQ，說明6種非釀酒酵母單菌發(fā)酵能改善弼猴桃果酒的口感，減少果酒刺激性風(fēng)味的產(chǎn)生。

醛類、酮類化合物是果酒香氣的重要協(xié)調(diào)成分，其閾值較低，對果酒香氣具有不可忽視的作用[33]。獼猴桃原汁中醛類、酮類物質(zhì)含量較高，弼猴桃果酒中醛類、酮類物質(zhì)含量較低。此外，C組的酚類物質(zhì)含量高于對照組，為（ 1434.03±164.82 ） μg/L ，對弼猴桃果酒的香氣起到重要的補充和修飾作用。

結(jié)合2.4的結(jié)果來看，在不同單菌發(fā)酵果酒產(chǎn)品中各有機酸的組成和含量之間有一定的差異，各果酒之間的風(fēng)味也不同。所以，不同種類的酵母在代謝方面存在一定的差異。

3結(jié)論

本研究通過篩選得到6株非釀酒酵母：庫德畢赤酵母（Pichiakudriauzevii）Nol、季也蒙畢赤酵母（Pichiaguilliermondii）No2、卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozymacaribbica）NO3、魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）N04、有孢漢遜酵母（Hanseniasporauuarum）No5、扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）N06。

將篩選得到的6株非釀酒酵母的性能進行了綜合表征，解析了所有弼猴桃果酒的理化特性、香氣特征。結(jié)果表明，大多數(shù)非釀酒酵母的發(fā)酵能力弱，不能單獨完成發(fā)酵。將弼猴桃引入果酒釀造中不僅可以降低總酸含量，而且能提高抗氧化活性，對果酒品質(zhì)的提升有益。對有機酸含量進行測定，發(fā)現(xiàn)奎寧酸和乳酸是弼猴桃果酒中的主要有機酸。檢測了不同單菌發(fā)酵樣品中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，發(fā)現(xiàn)庫德畢赤酵母、魯氏接合酵母、有孢漢遜酵母單菌發(fā)酵弼猴桃果酒可以有效地豐富香氣物質(zhì)的復(fù)雜度?？ɡ瓤诉~耶氏酵母單菌發(fā)酵產(chǎn)生的酚類物質(zhì)含量較高，對弼猴桃果酒的香氣起著重要的補充和修飾作用。所有單菌發(fā)酵產(chǎn)品的酸類物質(zhì)含量都低于對照組，可以減少果酒刺激性風(fēng)味的產(chǎn)生。綜合分析，在不同單菌發(fā)酵果酒產(chǎn)品中各有機酸的組成和含量之間有一定的差異，各果酒之間的風(fēng)味也不同。因此，不同酵母的代謝能力有一定的差異，本研究結(jié)果豐富了弼猴桃果酒發(fā)酵的菌種來源，同時為果醋的釀造提供了參考。

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