一株耐低溫抗鹽堿異養(yǎng)硝化菌株CS-6的除氮特性研究

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004—6755（2025）07-0017-04

Denitrogenate characterization studies by a strain of heterotrophic nitrifying bacteria CS-6 resistant to low temperature resistant and salt alkali resistant *

JIANG Wenwen1， TIAN Xiangli2，WANG Guodong1，GUO Enmian1 ， XIN Zhaozhe1，TAN Jiabo1 （1.School of Marine Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266lo9，China; 2.Fisheriescollege，OceanUniversityof China，Qingdao 266oo3，China）

Abstract：Low temperature，high salinityand other environments conditions willaffect the nitrification activity of microorganisms and reduce the removal of ammonia nitrogenand nitrite nitrogen inwater.A heterotrophic nitrifying bacterium CS^-6 was isolated from the biofilters of coldwater fish recirculating aquaculture system and identified as Bacillus by 16S rRNA. The nitrogen removal characteristics of the later were studied. The results show that Strain CS ?-6 can achieve removal rates of 100% and 91.67% for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen，respectively，within 72 hours.The removal rates for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen can reach up to 100% and 99% ， respectively，at low temperatures of 15^°C ，salinity ranging from 0‰ to 50‰ ， and pHlevels between 6 and 9. This indicates excelent cold resistance and salt一tolerance properties，demonstrating that Strain CS -6 has high water purification efficiency and broad application potential.

Key words：low temperature;halo一alkali tolerance;heterotrophic nitrifying bacteria;aquaculture water treatment

水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)產(chǎn)生的殘餌以及養(yǎng)殖動(dòng)物的排泄物會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸氮升高[1]，高濃度的氨氮和亞硝酸氮會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生毒害[2]，因此，有效降低養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸氮，維持良好的養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境，是保證養(yǎng)殖安全的基本要求。

生物除氮因具有無二次污染、無殘留等特點(diǎn)，成為目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用的除氮方法之二[3]。異養(yǎng)硝化細(xì)菌因可以有效去除水體的氨氮和亞硝酸氮，近年來被廣泛研究[3]。通常硝化過程的最適溫度為 ，溫度降低會(huì)導(dǎo)致硝化效率隨之下降。但對(duì)于許多冷水魚類如大西洋鮭魚（Salmosalar）、大菱鲆（Scophthalmusmaximus）等，養(yǎng)殖溫度在 16^°C 左右[5]，常導(dǎo)致許多異養(yǎng)硝化細(xì)菌無法充分發(fā)揮硝化活性，影響對(duì)水體氨氮和亞硝酸氮的控制。另外，許多異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)鹽度、pH值等變化敏感，也會(huì)影響硝化性能[6。因此，篩選耐低溫、適應(yīng)鹽堿變化的異養(yǎng)硝化菌株顯得尤為迫切。

本研究從冷水魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池中分離篩選出一株異養(yǎng)硝化菌株，通過對(duì)其進(jìn)行除氮特性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菌株具有較高的硝化特性，并且對(duì)低溫和高鹽堿條件均具有良好適應(yīng)性。研究結(jié)果對(duì)于豐富異養(yǎng)硝化菌種資源庫，并為未來該菌株在實(shí)際養(yǎng)殖過程中的開發(fā)和應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 菌株來源

用于進(jìn)行菌株篩選的樣品取自山東省日照市冷水魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池的生物濾料。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：1g KNO₂ ， MgSO₄ 0.1g， .2H₂O0.26g，K₂HPO40.5g，CaCO₃ 1g FeSO₄ ： 7H₂O 0.183g ，葡萄糖 0.3g ，酵母膏0.03g ，蒸餾水 1000mL 。

分離培養(yǎng)基：1g KNO₂ ， MgS₄ 0.1g， ： 2H₂OO.26g，K₂HPO₄O.5g，CaCO₃ 1g ，F(xiàn)eSO4. 7H₂O 0. 183g ，葡萄糖 0.3g ，酵母膏0.03g ，瓊脂粉 15g ，蒸餾水 1000mL 。

氮基礎(chǔ)降解溶液： 1.575g 葡萄糖， 0. 053 5g ΔNH₄Cl 0.069gNaNO₂，0.085gNaNO₃，1000mL 蒸餾水。

1.3 菌株分離與鑒定

取生物填料 2g ，以震蕩方式洗脫填料上的生物膜制得菌懸液。按照 10% 的體積比將菌懸液接種到富集培養(yǎng)基中，于 15°C，160r/min 的條件下培養(yǎng)富集。富集結(jié)束后涂布于分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單菌落在分離培養(yǎng)基上劃線純化。純化后的菌株接種至氮基礎(chǔ)降解溶液中，篩選出具有較高無機(jī)氮去除能力的菌株 CS^-6 。

菌株 CS^-6 采用水煮法提取DNA，使用27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至青島擎科天成生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4菌株 cos-6 對(duì)不同形態(tài)氮的去除能力測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長期的菌株 CS-6 調(diào)整菌液濃度為 10⁶ 后，按照 10% 的接種比例接種至氮基礎(chǔ)降解溶液中，在 15^°C ，轉(zhuǎn)速為 160r/min 條件下，間隔 24h 取樣，連續(xù)測(cè)定 ^120h 內(nèi)氨氮（NH₄⁺-N） 、亞硝酸氮、硝酸氮和總氮的濃度，計(jì)算去除率。總無機(jī)氮的濃度為氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮濃度之和。

1.5不同環(huán)境條件對(duì)菌株CS-6氨氮和亞硝酸氮去除能力及生長的影響

分別研究不同溫度、鹽度和 ΔpH 值條件下對(duì)菌株 CS^-6 的生長性能及其氨氮和亞硝酸氮去除能力，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。溫度分別為10%15%.20%.25%.30%.35% ;鹽度分別為 0‰ 、 10‰ 、 20‰ 、 30‰ 、 40‰ 、 50‰ pH 值分別為6、7、8、9。

試驗(yàn)前，先將菌株 CS^-6 預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，調(diào)整菌液濃度為 10⁶ ，然后按照 10% 的接種比例接種至降解液中。在試驗(yàn)的第0天和第3天測(cè)定不同處理?xiàng)l件下降解溶液中的氨氮和亞硝酸氮濃度以及細(xì)菌的生長情況 （OD₆₀₀ ），并計(jì)算去除率。

1.6 測(cè)定方法

氨氮采用靛酚藍(lán)法測(cè)定，亞硝酸氮采用重氮一偶氮光度法測(cè)定，硝氮依據(jù)Schnetger等[7]的方法進(jìn)行測(cè)定，總氮采用消解法測(cè)定，細(xì)菌的OD₆₀₀ 值使用酶標(biāo)儀SYnergy2測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

將所測(cè)得的PCR產(chǎn)物序列與NCBI中已登錄的 序列進(jìn)行核昔酸同源性比較，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

去除率的計(jì)算公式如下：

n=（C₀-C_n）/C₀×100%

式中： n 為去除率， %;C₀ 為初始的氮濃度，mg/L;C_n 為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的氮濃度， mg/L 。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS23.0.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），再使用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行均值的多重比較，以 Plt;0.05 為差異顯著水平。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin9.1軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1菌株CS-6的鑒定結(jié)果

篩選得到的菌株CS一6的菌落為乳白色，圓形，表面光滑凸起，邊緣整齊，易挑起。經(jīng)16SrRNA序列比對(duì)后鑒定為芽孢桿菌（Bacillussp.），見圖1。

2.2菌株CS-6對(duì)不同形式氮的去除效果

將菌株 CS^-6 接種到基礎(chǔ)氮降解溶液后，在試驗(yàn)期間，對(duì)氨氮和亞硝酸氮均有顯著去除效果，最高去除率分別為 100% 和 91.67% ，見圖2。在試驗(yàn)的 ^48h ，氨氮的去除率達(dá)到 100% ，亞硝酸氮的去除率達(dá)到 91.67% ，并一直持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束。菌株 CS^-6 對(duì)總無機(jī)氮的去除率在第 48～96h 達(dá)到最高，為 28.46% 。

注：不同字母表示不同時(shí)間差異顯著（ Plt;0.05） 。

異養(yǎng)硝化的途徑可分為兩種，一種是氨氮經(jīng)氨單加氧酶（AMO）氧化為羥胺 ΔNH₂OH ，再經(jīng)羥胺氧化酶（HAO）將羥胺氧化為亞硝酸氮、硝酸氮，這期間有亞硝酸氮或硝酸氮生成；另一種途徑是羥胺直接轉(zhuǎn)化為 N₂O，N₂^Λ，Γ9] ，這期間沒有亞硝酸氮和硝酸氮生成。本研究篩選獲得的異養(yǎng)硝化菌株 CS^-6 在 120h 的試驗(yàn)中，對(duì)氨氮和亞硝酸氮有顯著的去除效果，最高去除率分別可達(dá)100% 和 91.67% 。但對(duì)硝酸氮去除不顯著，說明得到的異養(yǎng)硝化菌株 CS-6 的異養(yǎng)硝化途徑可能為第一種。

2.3溫度對(duì)菌株CS-6去除氨氮和亞硝酸氮能力及生長的影響

菌株 CS-6 對(duì)氨氮和亞硝酸氮的去除表現(xiàn)出較廣的溫度適應(yīng)范圍，從 對(duì)氨氮或亞硝酸氮均有去除，并且對(duì)低溫有良好的耐受性，在15°C 條件下，氨氮和亞硝酸氮去除率分別為100% 和 91.91% ，見圖3。目前已報(bào)道的大多數(shù)關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境異養(yǎng)硝化細(xì)菌的研究，菌株硝化活性的最適溫度通常在 。菌株CS^-6 在 15°C 條件下仍具有較高硝化性能，表明該菌株具有良好的溫度生長耐受性。

圖3溫度對(duì)菌株CS-6氨氮和亞硝酸氮降解的影響2.4鹽度菌株CS-6去除氨氮和亞硝酸氮能力及生長的影響

在不同鹽度范圍內(nèi)也都表現(xiàn)較好的耐受性。在鹽度 0‰ 的范圍內(nèi)，對(duì)氨氮和亞硝酸氮的去除率均達(dá)到最高，去除率分別達(dá)到 100% 和93.15% 。在鹽度為 50‰ 時(shí)，菌株 CS-6 對(duì)氨氮和亞硝酸氮仍具有去除性能，見圖4。

鹽度過高時(shí)會(huì)造成細(xì)胞外部滲透壓過大，導(dǎo)致細(xì)胞失水，從而影響微生物的生長代謝甚至導(dǎo)致死亡[11]。菌株CS一6的硝化特性卻表現(xiàn)出較寬的鹽度適應(yīng)范圍 （0%0～50%） ，說明菌體中與硝化作用相關(guān)的酶的對(duì)鹽度具有較好的適應(yīng)性和耐受性。

圖4鹽度對(duì)菌株CS-6的氨氮和亞硝酸氮降解的影響2.5 pH值對(duì)菌株CS-6去除氨氮和亞硝酸氮能力及生長的影響

pH值是影響微生物生長和性能發(fā)揮的重要環(huán)境因素之一，可以引起微生物細(xì)胞膜電荷的變化，還會(huì)影響微生物的營養(yǎng)物質(zhì)吸收及代謝過程酶的活性[12]。通常硝化細(xì)菌的生長條件偏堿性，酸性的環(huán)境會(huì)嚴(yán)重抑制反應(yīng)的發(fā)生[11]。菌株CS^-6 則表現(xiàn)出良好的酸堿耐受性，在所有 ΔpH 值范圍內(nèi)，對(duì)氨氮去除率均高于 96.33% ，對(duì)亞硝酸氮的去除率也都高于 92% ，見圖5。這說明菌株對(duì)酸性和堿性環(huán)境都具有良好的適應(yīng)性。

3結(jié)論

菌株CS一6具有高效的氮去除特性，對(duì)氨氮和亞硝酸氮的去除率分別可達(dá) 100% 和91. 67% 。CS^-6 也具有良好的耐低溫特性，在 15^°C 條件下，對(duì)氨氮和亞硝酸氮的去除率分別可達(dá) 100% 和91.91% 。在鹽度 0%0～50%0.pH 值為 6～9 的范圍內(nèi)，CS一6對(duì)氨氮和亞硝酸氮也具有較好去除能力，表現(xiàn)良好的鹽堿耐受性。綜上顯示， CS-6 對(duì)低溫和高鹽堿均具有良好的耐受性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控過程中，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHAN P，LIU W. Use of fluidized bed biofilter and immobilized Rhodopseudomonas palustris for ammonia removal and fishhealth maintenance in a recirculation aquaculture system [J].Aquaculture Research，2013，44（13）： 327-334 ：

[2]RANDALL D J，TSUI T K N. Ammonia toxicity in fish [J].MarinePollutionBulletin，2002，45（1—12）： 17-23

[3] DENG M， ZHAO X L， SENBATI Y，et al. Nitrogen removal by heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas sp. DM O2：Removal performance， mechanism and immobilized application for real aquaculture wastewater treatment [J]. Bioresource Technology，2020 （322）：124555.

[4]MAURETM，PAULE，PUECH-COSTESE，et al. Application of experimental research methodology to the study of nitrification in mixed culture[J].Water Science and Technology，1996，34（1—2）：245—252.

[5]侯明華，張黎黎，韓厚偉，等．大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中 大菱鲆放養(yǎng)密度對(duì)混養(yǎng)效果的影響［J]．水產(chǎn)學(xué)雜志，2020， 33（3）：13-18.

[6]LI S S，HE Z M，LI C，et al. Nitrogen removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria：Areview[J].DesalinWater Treat，2024（317）：100227.

[7]SCHNETGER B，LEHNERS C. Determination of nitrate plus nitrite in small volume marine water samples using vanadium（II）chloride as a reduction agent[J]. Marine Chemistry，2014，160（3）： 91-98 ：

[8]RICHARDSONDJ，WEHRFRITZJM，KEECHA，et al. Thediversity of redox proteins involved in bacterial heterotrophic nitrificationand aerobicdenitrification[J].Biochemical Society transactions，1998，26（3）： 401-408 ：

[9] ZHAO B，AN Q， HE Y L，et al. N2O and N2 production during heterotrophic nitrificationbyAlcaligenes faecalis strain NR [J]. Bioresource technology，20l2（116）： 379-385

[10]VINOTHKUMAR R，DARJY，BHARTI V S，et al. Heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacteria： Characterization and comparison of shrimp pond and effluent discharge channel in aspects of composition and function [J].Aquaculture，2021（539）：736659.

[11]李焱生，魏民，張艾曉，等．一株異養(yǎng)型亞硝酸鹽氧化細(xì)菌 的分離及其降解特性的研究［J]．生物技術(shù)通報(bào)，2010 （5）：196-202.

[12]蘇俊峰.異養(yǎng)型同步硝化反硝化脫氮技術(shù)及微生物特性研 究［D]．哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2007.

（收稿日期：2025-04—25）