磁性顆粒對復合生物脫氮體系啟動過程的影響

中圖分類號：TU992.3 文獻標志碼：A

Effect of Magnetic Particles on Initiation Process of Composite Bio-denitrification System

XUAN Siqi ^?1 ， ZHANG Shuai ¹ ， ZHANG Fengjun2， ZHANG Dong3， SUN Shaofang ¹ ，WANG Jiabin ¹

（1.School of Civil Engineering and Architecture，University of Jinan，Jinan 25O022，Shandong，China; 2.Shandong Fangyun Software Technology Co.，Ltd.， Jinan 25OooO，Shandong，China; 3.Shandong Qingdao Municipal Engineering Designand Research Institute Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong，266000）

Abstract：To investigate theroleof ading magnetic particles intheinitiation processof biological denitrificationsystem， two biological denitrification reactors， R₁ and R₂ ，were constructed. In reactor R₂ ，the amount of magnetic particles added was 30 g/L.In the first stage，influentcontainingammonia nitrogenandnitrite nitrogen was inoculated with denitrifying sludge，while in the second stage，influent containing only ammonia nitrogen was inoculatedwith nitrifying sludge.A comparativestudywasconductedtoinvestigatetheimpactof magneticparticlesontheinitiationprocessofthecomposite denitrification system，andthe mechanism of actionof the magnetic particles was exploredthroughtheanalysis of microbial community structure.The results show thatboth reactors can be successfully initiated.In the first stage，reactors R₁ and R₂ both undergo primarily anaerobic ammonia oxidation reactions，with reactor R₂ exhibiting a higher proportion of anaerobic ammoniaoxidation.In thesecond stage，under lowdissolved oxygen conditions，acomposite biological denitrification system is formed，combining anaerobicammonia oxidation with short-range nitrification-denitrification，with reactor R₂ （204號 achieving a higher total nitrogen removalrate.Compared to the inoculated sludge samples，theabundanceof anaerobic ammonia oxidation bacteria in the first stage of reactors R₁ and R₂ is increased，with a more significant increase in the abundance of anaerobic ammonia oxidation bacteria Candidatus_Kuenenia in reactor R₂ . In the second stage，reactor R₂ （204號 exhibits inhibitionofnitrite-oxidizing bacteriaandnitritebacteria Nitrosomonas，whiletheabundanceofThaueraand Thermomonas bacteria is significantly increased.

Keywords：biological denitrification process；magnetic particle；anaerobic ammonia oxidation;short-range nitrficationdenitrification

在我國節(jié)能減排大背景下，以厭氧-缺氧-好氧生物處理法（AAO）為代表的生物脫氮工藝曝氣量大、能耗高的問題急需解決。相比之下，厭氧氨氧化耦合短程硝化反硝化復合脫氮體系曝氣量小，污泥產(chǎn)量少，碳源需求量低，能源消耗少，是一種具有良好應用前景的生物脫氮新技術。

近年來的研究[表明，通過改變厭氧氨氧化和短程硝化反硝化的反應參數(shù)能夠成功啟動該反應體系，并且磁場會影響微生物對底物的降解能力，促進活性污泥系統(tǒng)中含氮化合物的轉化。Tao等[2]通過膜生物反應器（MBR）的方式運行178d成功啟動了厭氧氨氧化（ANAMMOX）工藝。Li等3在升流式厭氧污泥床反應器（UASB）中接種亞硝化污泥和厭氧氨氧化顆粒污泥的混合物，運行 120d 后獲得較好的脫氮效果。Chen等4采用分步進料策略將硝化、短程硝化、反硝化和厭氧氨氧化工藝整合，在水力停留時間（HRT）低至 5h 的條件下脫氮負荷為0.224kg/（m³?d） 。Chi等5通過對游離氨含量和溶解氧（DO）含量等關鍵參數(shù)的優(yōu)化實現(xiàn)了短程硝化-厭氧氨氧化-反硝化生物脫氮體系的快速啟動。Cui等[6]、Duan 等[7]研究了溫度、溶解氧含量、酸堿度 ΔpH 、碳氮質量比、游離亞硝酸、污泥齡期（SRT）等因素對亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的抑制效果。 Hu 等[8]、 Xu 等[9]、孫紹鈞等[10]、Wang等[1]研究發(fā)現(xiàn)，納米四氧化三鐵磁性粉末能夠提高污水處理中的微生物活性，刺激硝化細菌亞硝酸菌屬、硝化螺旋菌、反硝化細菌膠菌屬等功能菌的生物活性；但是，由于厭氧氨氧化菌具有世代周期長、難以富集、工藝啟動耗時長[12]的特點，短程硝化反硝化也存在亞硝酸鹽的積累調控困難的問題，因此如何保障該體系的快速啟動與穩(wěn)定高效運行，還有待深入研究。

本文中構建磁性生物脫氮體系，對比研究磁性顆粒對反應器復合脫氮效能的影響和作用規(guī)律，并分析其對微生物作用機制

材料與方法

1. 1 磁性顆粒

本文中研究所使用磁性顆粒為課題組自制，以納米四氧化三鐵磁粉為主要材料，配以鈦酸酯偶聯(lián)劑、聚乙烯醇-海藻酸鈉黏合劑、無水乙醇，經(jīng)烘干、成球、固化與充磁等工序制備獲得磁性顆粒。磁性顆粒磁感應強度可達到 0.85mT ，經(jīng)過 30d 的衰退，磁感應強度能穩(wěn)定在 0.75mT 。磁性顆粒表面的掃描電子顯微鏡圖像見圖1。由圖可以看出，磁性顆粒表面多孔，可為微生物的附著提供載體。

1. 2 反應器

本文中使用的反應器裝置示意圖見圖2。該反應器為有機玻璃制成，高度為 1 200mm ，半徑為50mm ，設有進水口、出水口、內(nèi)循環(huán)管及曝氣管接口。配備溫度控制儀、溶解氧測試儀實現(xiàn)運行參數(shù)的實時監(jiān)測與控制，外壁包裹黑色材料避光，使用內(nèi)循環(huán)泵攪拌。

本文中使用2組反應器 R₁ 、 R₂ 開展對比實驗，其中反應器 R₁ 不添加磁性顆粒，反應器 R₂ 中磁性顆粒添加量為 30g/L ，反應器中心的磁感應強度為0.75mT 。

1.3 分析方法

本文中涉及的氨氮（ NH₄⁺-N ）、亞硝態(tài)氮（ NO₂^- N）、硝態(tài)氮（ NO₃^--N? ）、總氮（TN）、DO水質參數(shù)采用國家標準分析方法[13]， pH 采用PB-10 型酸度計測定。

高通量測序基于IlluminaHiSeq 測序平臺。本文中根據(jù)所擴增的16SrRNA區(qū)域特點，構建小片段文庫對反應器 R₁ ！ R₂ 不同階段污泥樣品的第3、4個可變區(qū)（V3V4）區(qū)進行聚合酶鏈式（PCR）擴增和雙末端測序。PCR擴增引物為341F（CCTAYGGGRB-GCASCAG）和 806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）。使用 TruSeq@DNAPCR-FreeSamplePreparationKit 建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit熒光定量儀和定量PCR分子生物學技術檢測，文庫合格后，使用HiSeq2500PE250測序儀上機并完成雙末端測序，獲取分類注釋結果并分析生物群落結構。

1.4 模擬廢水

反應器進水采用人工模擬生活污水，氯化銨NH₄Cl 和亞硝酸鈉 NaNO₂ 分別提供氨氮和亞硝態(tài)氮，碳酸氫鈉 NaHCO₃ 提供碳源。

2 結果與分析

2.1 反應器第1階段處理效果

反應器 R₁ ！ R₂ 接種污泥為濟南某中水站反硝化污泥，反應器內(nèi)溫度控制為 30^°C ， pH 控制為 7.5～ 8.5，反應器換水率為 40% 。進水前在進水箱內(nèi)通入氮氣 15min ，吹脫進水中的溶解氧。2組反應器啟動運行 100d ，設置進水中氮元素含量：第0—35天氨氮、亞硝態(tài)氮的質量濃度分別為 41～86 、 38～ 64mg/L ，第36—65天氨氮、亞硝態(tài)氮的質量濃度分別為 86～80，64～91mg/L ，第67—100天氨氮、亞硝態(tài)氮的質量濃度分別為80＼～118、 90～133mg/L 。

反應器 R₁ ！ R₂ 中氮元素的轉化規(guī)律如圖3所示。由圖可知：在反應器運行 0～30d ，反應器 R₁ 、R₂ 均出現(xiàn)出水氨氮含量大于進水氨氮含量的情況，這可能是由于接種污泥適應新環(huán)境過程，部分細菌死亡，菌體裂解，導致出水氨氮含量升高[14]。反應器運行 30～35d 時，進水氨氮的含量增加幅度較大，出水硝態(tài)氮含量與進水氨氮含量差距逐漸增大，說明在厭氧環(huán)境下全程硝化反應的比例不斷下降，發(fā)生厭氧氨氧化反應概率較大，短程硝化反硝化反應比例不斷上升。反應器運行 35～100d 時，反應器R₁ 、 R₂ 出水氨氮、亞硝態(tài)氮含量不斷降低，出水硝態(tài)氮含量不斷升高，反應器厭氧氨氧化反應逐漸穩(wěn)定。運行 95d 時，反應器 R₁ 1 R₂ 中亞硝態(tài)氮消耗量與硝態(tài)氮生成質量比分別為1.11和1.17，參考相關研究數(shù)據(jù)[15]發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化反應在反應器中占主導地位。本文構建的反應器中厭氧氨氧化反應比例偏小，可能是因為進水中有 SO₄^2- 存在，發(fā)生了硫銨氧化反應，部分氨氮被氧化成硝態(tài)氮[16]

反應器 R₂ 中氨氮、亞硝態(tài)氮的去除率更高，出水硝態(tài)氮含量高于反應器 R₁ 中的。運行 35～100d 時，反應器 R₂ 中厭氧氨氧化反應的占比更高，可能是反應器 R₁ 1 R₂ 中的厭氧氨氧化菌均得到富集。反應器出水氨氮、亞硝態(tài)氮的含量繼續(xù)降低，總氮去除量逐漸增大，且反應器 R₂ 的總氮去除量大于反應器 R₁ 的，主要表現(xiàn)在反應器運行 65～100d 時反應器運行 95d 時，反應器 R₁ ！ R₂ 中亞硝態(tài)氮消耗量與硝態(tài)氮消耗量的質量比分別為1.11和1.17，推測反應器 R₁ 中的厭氧氨氧化反應比例小于反應器 R₂ 中的。

2.2 反應器第2階段處理效果

在第2階段中，反應器投加硝化污泥 500mL 污泥接種量為 4 300mg/L ，進水中停止添加亞硝態(tài)氮，停止進水氮氣吹脫，進水溶解氧質量濃度控制在 1mg/L 左右，游離氨（FA）的質量濃度為7.8mg/L^[17] [對NOB和氨氧化菌（AOB）的抑制質量濃度分別為 0. 1～60 ！ 10～150mg/L] ，溫度為32^°C 。適應運行 10d 后，調整進水氨氮質量濃度約為 180mg/L 。

反應器 R₁ ！ R₂ 中氨氮、硝態(tài)氮和總氮含量變化如圖4所示。由圖可知：反應器運行 10～26d 時，氨氮和總氮的去除率下降，原因主要是反應器中溶解氧環(huán)境、進水底物發(fā)生改變，AOB菌群尚不能為反硝化菌和厭氧氨氧化菌提供充足的亞硝態(tài)氮，溶解氧的存在也限制了反硝化菌和厭氧氨氧化菌的活性。反應器運行 26～42d 時，反應器出水氨氮、硝態(tài)氮、總氮含量不斷下降，可能是由AOB活性逐漸恢復，短程硝化比例逐漸升高，厭氧氨氧化反應與短程硝化反硝化反應的比例逐漸增大造成的。反應器運行 42～58 d時，反應器 R₁ 的氨氮去除率達到60% ，反應器 R₂ 的達到 74% ，穩(wěn)定運行過程中2個反應器的總氮去除率分別達到 50% 和 60% ，短程硝化反硝化和厭氧氨氧化復合脫氮反應比例逐漸增加，然后保持穩(wěn)定。

反應器 R₂ 中氨氮、總氮的去除率均高于反應器 R₁ 中的，原因是磁性顆粒有利于微生物富集和微生物膜增厚。隨著反應的進行，反應器 R₂ 中磁性顆粒表面生長的生物膜增厚，在生物膜外表面利用水中溶解氧及氨氮產(chǎn)生亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮，反硝化菌利用不適應新環(huán)境裂解的細菌作為碳源發(fā)生短程硝化反硝化反應，而生物膜內(nèi)表面處于缺氧階段，一部分存活下來的厭氧氨氧化菌利用亞硝態(tài)氮和氨氮發(fā)生厭氧氨氧化反應。反應器 R₂ 中的厭氧氨氧化反應與短程硝化反硝化反應的比例大于反應器 R₁ 中的，原因是磁性顆粒的存在提高了反硝化菌的相對豐度。反應器運行 42～58d 時，反應器 R₂ 的氨氮、總氮去除率均大于反應器 R₁ 的，NOB不斷被抑制，AOB不斷將氨氮氧化成亞硝態(tài)氮，為反硝化菌和厭氧氨氧化菌提供亞硝態(tài)氮，短程硝化反硝化和厭氧氨氧化反應比例逐漸增加，直到穩(wěn)定，原因是磁性顆粒的加入抑制了NOB的活性，對AOB有一定的促進作用。AOB、反硝化細菌和厭氧氨氧化菌能夠共存，反應器主要發(fā)生短程硝化反硝化反應和厭氧氨氧化反應，磁性顆粒的添加提高了厭氧氨氧化菌、硝化細菌和反硝化細菌的活性。

2.3 厭氧氨氧化菌的確定及微生物群落分析

結合高通量測序，進一步分析磁性顆粒對微生物群落的影響。濟南某中水站反硝化污泥為樣本A₀ ，第1階段運行 100d 的反應器 R₁ 、 R₂ 的污泥為樣本 A₁ 、 A₂ ，第2階段運行 60d 的反應器 R₁ 1 R₂ 的污泥為樣本 A₃ 、 A₄ 。不同污泥樣品的有效序列數(shù)見圖5。由圖可知，接種污泥樣本 A₀ 的微生物的有效序列數(shù)遠大于其余4個樣本的。反應器 R₁ ！R₂ 的反硝化污泥在第1階段啟動過程中淘汰掉不適應新環(huán)境的微生物，微生物多樣性下降。第2階段反應器 R₁ ！ R₂ 中由于溶解氧的加入和溫度的升高改變了反應器的微生物環(huán)境，因此序列數(shù)較第1階段的有所增加，且較接種污泥樣本 A₀ 的序列數(shù)少。

不同污泥樣品基于操作分類單元（OTU）的韋恩（Venn）圖如圖6所示。由圖可以看出，5個樣品共有的OUT數(shù)為359，說明樣品之間存在一定的相似性。樣本 A₁ ！ A₂ 共有的OUT數(shù)為443，樣本 A₁ 獨有的OUT數(shù)為502，樣本 A₂ 獨有的OUT數(shù)為259，樣本 A₃ ！ A₄ 共有的OUT數(shù)為826，樣本 A₃ 獨有的OUT數(shù)為219，樣本 A₄ 獨有的OUT數(shù)為327，可見磁性顆粒的加入對OUT數(shù)影響較大。樣本 A₁，A₃ 共有的OUT數(shù)為681，樣本 A₁ 獨有的OUT數(shù)為419，樣本 A₃ 獨有的OUT數(shù)為350，說明在不同運行條件下有一定的差異性。接種污泥樣本 A₀ 中大量的微生物在培養(yǎng)的過程中被淘汰，能夠適應環(huán)境的變形菌門和浮霉菌門等生存下來。

不同污泥樣品門水平柱狀圖如圖7所示。由圖可以看出，變形菌門是樣本中的優(yōu)勢菌門，在生物群落中具有極強的優(yōu)勢，樣本 A₀ 、 A₁ 、 A₂ 、 A₃ 、 A₄ 中變形菌門的相對豐度分別為 52.40% ！ 29.52% ！32.03% 、 61.68% 、 67.36% ，加人磁性顆粒之后的樣本 A₂ 中變形菌門的相對豐度較樣本 A₁ 中的增加到 32.03% ，加入磁粉之后的樣本 A₄ 中變形菌門的相對豐度較樣本 A₃ 中的增加到 67.36% ，說明磁場作用能夠提高變形菌門的豐度和穩(wěn)定性。厭氧氨氧化菌屬于浮霉菌門，是微生物群落的重要組成部分。Rikmann等[18]發(fā)現(xiàn)疣微菌門Verrucomicrobia參與了硫酸鹽型厭氧氨氧化脫氮過程。4個反應器中均發(fā)現(xiàn)了疣微菌門，在樣本 A₀ 7 A₁ 1 A₂ ！ A₃ 、 A₄ 中的相對豐度分別為 0.57% 、 0.29% 、 0.15% 、 0.02% ！0.18% ，在反應器運行第1階段，該菌的相對豐度較高，但在第2階段該菌的相對豐度較小，原因可能是溶解氧的存在影響了疣微菌門的活性。

選取不同污泥樣品在屬水平相對豐度排名前35的屬繪制成的聚類熱圖如圖8所示。由圖可以看出：反應器第1階段污泥樣品中發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化菌Candidatus_Brocadia 和厭氧氨氧化菌Candidatus_Kuenenia 的存在[19]，與樣本 A₀ 相比，樣本 A₁ ！ A₂ 中的厭氧氨氧化菌的相對豐度顯著提高，投加磁性顆粒的反應器 R₂ 中厭氧氨氧化菌Candidatus_Kuenenia相對豐度提升較明顯，較好地解釋了反應第1階段主要反應為厭氧氨氧化反應。在反應器第2階段污泥樣品中均檢測出了厭氧氨氧化菌Candi-datus_Brocadia、厭氧氨氧化菌Candidatus_Kuenenia、亞硝酸菌Nitrosomonas、未命名的硝化螺旋菌Uni-dentified_Nitrospi-raceae、未命名的硝化螺旋菌Uni-dentified_Nitrosomonadaceae、維氏紅細菌Rhodobacter、陶厄式菌Thauera、紅環(huán)菌Denitratisoma、砂單胞菌Arenimonas、湖沉積桿菌Limnobacter和熱單胞菌Thermomonas、根際假河桿菌Rivibacter，說明在第2階段形成了以短程硝化反硝化和厭氧氨氧化為主的復合生物脫氮體系。亞硝酸菌Nitrosomonas是一種重要的AOB，能夠為厭氧氨氧化作用提供所需的亞硝酸鹽底物。研究發(fā)現(xiàn)，樣本 A₁ 、 A₂ 、 A₃ 、 A₄ 中亞硝酸菌Nitrosomonas相對豐度分別為 1.10% 、1.05%.0.56%.0.55% ，說明在磁場的作用下，亞硝化菌屬有一定優(yōu)勢。未命名的硝化螺旋菌Uni-dentified_Nitrospiraceae、未命名的硝化螺旋菌Uni-dentified_Nitrosomonadaceae屬于NOB，2種菌屬的作用是將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮，造成硝態(tài)氮濃度升高，未命名的硝化螺旋菌Unidentified_Nitrospiraceae在樣本 A₃?A₄ 中的相對豐度分別為 0.49%.0.23% 未命名的硝化螺旋菌Unidentified_Nitrospiraceae在樣本 A₁，A₂，A₃， A₄ 相對豐度分別為 2.10% ！ 0.77% ！0.88% 、 0.86% ，說明磁性顆粒對NOB有一定的抑制作用，說明反應器第2階段發(fā)生了短程硝化反應。有反硝化功能的菌屬有維氏紅細菌、陶厄式菌、紅環(huán)菌、砂單胞菌、湖沉積桿菌和熱單胞菌，根際假河桿菌[20]，陶厄氏菌是短程反硝化的重要功能菌，能夠將硝態(tài)氮轉化為亞硝態(tài)氮[21-22]，添加磁性顆粒的樣品 A₄ 中陶厄式菌的豐度較樣品 A₃ 的顯著提高，相對豐度由 3.60% 提高到 10.87% ，陶厄式菌為優(yōu)勢菌屬并占據(jù)有利生態(tài)位。添加磁性顆粒后熱單胞菌的相對豐度由樣本 A₃ 中的 0.67% 提高至樣本A₄ 中的 1.67% ，說明磁性顆粒對復合生物脫氮體系中這2種菌生長有促進作用，較好地解釋了第2階段主要反應為短程硝化反硝化反應。另外，磁性顆粒對湖沉積桿菌和根際假河桿菌有抑制作用，在樣本 A₄ 中相對豐度分別降低至 0.44% 和 0.99% ，表明磁場深刻影響了反應器的生物群落結構。

3結論

本文中通過對比實驗探究了磁性顆粒對復合生物脫氮體系啟動過程的影響，得出如下結論：

1）在反應器第1階段，厭氧狀態(tài)下以氨氮與亞硝態(tài)氮為底物，反應器均能成功啟動，反應器 R₁ 、R₂ 均能發(fā)生以厭氧氨氧化為主的反應，并且添加磁性顆粒的反應器 R₂ 中厭氧氨氧化反應占比更大。2）在反應器第2階段，在低溶解氧條件下，繼續(xù)接種硝化污泥，能形成較穩(wěn)定的復合生物脫氮體系，啟動過程中氨氮去除率分別為 60% 、 74% ，穩(wěn)定運行過程中，總氮的去除率分別為 50% 1 65% 。3）與接種污泥樣本 A₀ 比較，在反應器第1階段2個反應器厭氧氨氧化菌相對豐度均增大，投加磁性顆粒的反應器 R₂ 中厭氧氨氧化菌Candidatus_Kuenenia豐度提升較明顯，在反應器第2階段，投加磁性顆粒的反應器 R₂ 對NOB和亞硝酸菌具有抑制作用，陶厄式菌和熱單胞菌的豐度提升明顯。

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（責任編輯：于海琴）