密林熊蜂蜂王腸道拮抗菌株的分離鑒定及生理生化特性分析

關(guān)鍵詞密林熊蜂;拮抗菌株;分離鑒定；生理生化特性;抑菌效果

中圖分類號(hào)S891文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào) 0517-6611（2025）13-0064-07

doi：10.3969/j. issn. 0517-6611.2025.13. 013

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation，Sreng，detatiodygicalandiocheialCaracteristicsalysisofGutAtagosticSasoot Bumblebee Queens

WANG Wen-long，CHENYi-zuo，WANGJing-zhuoetal（SchoolofifeSciences，ChangchunNoal Universty，Changchun，ilin 130032）

AbstractObectie]oinvestgatetherelationshipbetweenbumblebeesandteirgutmicrobiota.Method]Thisstudyiedtosolate， screnadintfotetialgostcisfroutfmutgtss，dtesigatetibctealo Intialsceingasasdofrecsinolooloiz，ndmorpolog，lodyuiplesrakpurfatiostoainpreultures.ntagosseedateedoodibeliabilid iologicalandocalracteristfieatisupatassedsulterinchidt inhibitoryectistStalcoccusueussetifdscbcillsueiouhGBnktabseomparsot tionsupeaantfemosdiantictiistEheccoldclsblisW， catalaseandahdrosectityutitsrolisctiityactiisgtieddoleductactsii [Conclusion]ssdsuefuloladdentidtetagostic 3ittetalaplatiofrhutspat agiatusqens.ebod-sptanibactealaivitydsabilitofthmetatiosupeatantofsainW3igghtitsprsingp plicationin the development of biological bactericides.

Keywordsspttusagosticasoaodt;aldicalacest effect

熊蜂授粉是一種高效的生物授粉方式[]，不僅能夠有效提高農(nóng)作物的產(chǎn)量及改善果實(shí)形態(tài)，減少畸形果的出現(xiàn)，還規(guī)避了化學(xué)授粉可能導(dǎo)致的激素殘留問題[2]。此外，熊蜂還可以用于牧草等作物的傳粉，對(duì)提高牧草產(chǎn)量也有顯著效果[3]。由于熊蜂相比蜜蜂趨光性弱、更耐低溫、工作時(shí)間長、訪花頻率高。在設(shè)施農(nóng)業(yè)中熊蜂授粉效率明顯高于蜜蜂[4]，另外熊蜂也能夠用于解決蜜蜂對(duì)于帶有特殊氣味的茄科作物采集度不高的問題[5]。我國擁有豐富的熊蜂資源，約占全球熊蜂種類的 50% ，但是經(jīng)人工馴化并投入商用仍任重道遠(yuǎn)，熊蜂資源開發(fā)正備受關(guān)注[]

研究表明，腸道微生物在提升宿主的免疫力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，故探索熊蜂與其體內(nèi)微生物群落間的相互作用關(guān)系，對(duì)于增強(qiáng)熊蜂的生存能力具有重要意義[]。歷經(jīng)漫長的進(jìn)化過程，昆蟲與細(xì)菌之間建立了互利的共生關(guān)系，它們腸道內(nèi)寄居的菌群對(duì)寄主極為有益，它們參與食物中營養(yǎng)物質(zhì)的攝取與轉(zhuǎn)化過程，滿足昆蟲自身及其生長發(fā)育的需求[8]作為無脊椎動(dòng)物的昆蟲，缺乏完備的免疫系統(tǒng)，昆蟲腸道細(xì)菌具備分泌抗菌肽的能力，能夠?qū)共≡w的侵害[9]。曹喆等[10]利用牛津杯法對(duì)短頭熊蜂（Bombusbreviceps）腸道進(jìn)行拮抗菌株篩選鑒定及其生物特性評(píng)價(jià)，篩選出5株優(yōu)異拮抗菌，其中果桿菌CZ01具有抑菌活性高、穩(wěn)定性好、抑菌譜廣等特性。雷清芝等[1]從東方蜜蜂（Apiscerana Fabricius）成年工蜂腸道內(nèi)分離獲得的羅伊氏乳桿菌LP4具有良好的益生特性，飼喂給東方蜜蜂成年工蜂后，該菌可通過改善腸道微生態(tài)平衡（如增加乳酸菌數(shù)量，減少腸球菌、真菌數(shù)量）和增強(qiáng)腸道免疫功能明顯提高東方蜜蜂成年工蜂的存活率。密林熊蜂是吉林省周邊優(yōu)勢(shì)野生蜂之一，具有商品化潛能，通過篩選和應(yīng)用具有特定抗病性的拮抗菌，可以提高蜂王的抗病性、促進(jìn)生長發(fā)育、降低馴化過程中的病蟲害風(fēng)險(xiǎn)，為密林熊蜂的人工馴化提供有力的支持。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株。病原指示菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）大腸桿菌（Esch-erichiacoli）均由長春師范大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室保存使用。

1.1.2主要試劑。PCR試劑、通用引物27F和1492R、胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K，生工生物工程（上海）股份有限公司；LB和MRS培養(yǎng)基，廣東中山百微生物技術(shù)有限公司；TSB培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。1.1.3主要儀器。二氧化碳培養(yǎng)箱、醫(yī)用潔凈工作臺(tái)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；高壓滅菌鍋，山東博科消毒設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)、水浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司； pH 精確試紙，杭州特種紙業(yè)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 密林熊蜂蜂王腸道細(xì)菌的分離純化。于4月末5月初在長白山附近捕獲越冬完成、外出覓食的密林熊蜂蜂王，查閱資料，綜合特征確認(rèn)采集的熊蜂樣本為蜂王。首先，取3只密林熊蜂蜂王，1只為一組，3組重復(fù)，試驗(yàn)開始前需饑餓處理 18～24h （存活）。隨后，使用鑷子將樣本浸泡在 75% 乙醇中 1min ，再移至無菌水燒杯中輕微振蕩以去除乙醇。在超凈工作臺(tái)中解剖腸道，用灼燒并冷卻的剪刀從螯針處剪至腹部，再用同樣處理的鑷子取出腸道，迅速放入裝有 1mL 生理鹽水的研缽中研磨成勻漿。取 100μL 研磨液加入 900μL 生理鹽水的滅菌離心管中稀釋，制備成 10^-1?10^-3 和 10^-5 3 個(gè)濃度梯度的稀釋液。各取 100μL 稀釋樣本均勻涂布在LB和MRS固體培養(yǎng)基上，每組重復(fù)3次，置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 36～48h 。根據(jù)菌落的外觀特性進(jìn)行初步篩選后，用接種環(huán)挑取單一菌落進(jìn)行劃線分離，重復(fù)此純化步驟2次，共進(jìn)行3次純化，以獲得純凈菌株。鑒于菌株的分類和培養(yǎng)溫度未明確，參考前人試驗(yàn)[12]，選擇37^°C 作為標(biāo)準(zhǔn)溫度條件。將純化后的菌株接種于 5mL 液體培養(yǎng)基中，在 37°C，150r/min 的條件下培養(yǎng) ^12h ，然后與甘油 1：1 混合，保存于 -80°C 超低溫冰箱中備用。

1.2.2革蘭氏染色。將分離純化得到的單菌落，通過肉眼進(jìn)行初步觀察，以評(píng)估其菌落表面的基本形態(tài)。隨后挑取單個(gè)菌落，均勻地涂抹在載玻片上，對(duì)樣品進(jìn)行革蘭氏染色處理[13]，并將染色后的樣品置于顯微鏡的 100× 倍物鏡下觀察，結(jié)合顯微形態(tài)和染色情況，初步確定單菌落的分類歸屬

1.2.3發(fā)酵上清液的提取。將純化的菌株培養(yǎng)液以 1% 的劑量接種到 50mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于水浴恒溫振蕩器中 培養(yǎng) 24h ，分裝到 5mL 離心管中，再用高速冷凍離心機(jī)離心 10min 后去沉淀取發(fā)酵上清液，封裝置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆肹14] O

1.2.4拮抗菌株的抑菌圈篩選。采用平板挖孔法來測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性，首先用棉棒蘸取濃度為 10^-3 的金黃色葡萄球菌沿 120°?240°?360° 3 個(gè)方向涂勻涂滿整個(gè)固體培養(yǎng)基，再用 100～1000μL 的移液槍藍(lán)色槍頭粗端沿平板中分線在兩端挖孔，孔內(nèi)注滿單菌落發(fā)酵上清液，觀察抑菌圈以找出抑制金黃色葡萄球菌的拮抗細(xì)菌。為了驗(yàn)證這些菌株的抑菌效果，設(shè)置了對(duì)照試驗(yàn)，使用等量且經(jīng)過高溫滅活的各菌株對(duì)應(yīng)的發(fā)酵上清液。每組試驗(yàn)均進(jìn)行了3次重復(fù)。

抑菌效果的評(píng)估依據(jù)參照朱成科等[15]的方法并適當(dāng)修改：抑菌圈直徑 lt;9mm ，無抑菌效果； 9mm? 抑菌圈直徑lt;14mm ，低度抑菌效果； 14mm? 抑菌圈直徑 lt;19mm ，中度抑菌效果；抑菌圈直徑 ?19mm ，高度抑菌效果。

1.2.5拮抗細(xì)菌的DNA 提取與菌種鑒定。依據(jù)Justé等[16]的方法，提取金黃色葡萄球菌的拮抗菌株中的DNA。隨后，利用細(xì)菌通用引物正向引物27F（ 5^′ -AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3）和反向引物1492R（ 5^′ -TACGACTTAAC-CCCAATCGC-3'），利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化與測(cè)序處理。將測(cè)序所得的數(shù)據(jù)上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，借助BLAST這一在線工具，對(duì)序列間的相似性進(jìn)行比對(duì)分析。從數(shù)據(jù)庫中篩選并獲取了與待測(cè)序列相關(guān)的多個(gè)屬種的16SrRNA基因序列，并利用MEGA11軟件建立了系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 細(xì)菌生理生化特性分析

1.3.1過氧化氫酶活性分析。在拮抗菌株的固體培養(yǎng)基中直接倒入 5% 的 H₂O₂ 溶液， H₂O₂ 溶液需完全沒過菌株，觀察如果有氣泡產(chǎn)生，判定該細(xì)菌的發(fā)酵液具有過氧化氫酶活性，反之則無[17]

1.3.2酪素水解活性分析。在制備TSB固體培養(yǎng)基時(shí)，添加 10% 的脫脂牛奶。將待測(cè)的拮抗菌接種于這一特殊培養(yǎng)基上，并將其置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出清晰的菌落時(shí)，仔細(xì)觀察菌落周圍的情況。如果觀察到菌落邊緣形成了明顯的透明圈，表明該菌落具有酪蛋白水解的能力，即具有酪素水解活性；若未見此現(xiàn)象，則意味著該菌落不具備此活性[17]

1.3.3脂酶活性分析。配制 TSB 固體培養(yǎng)基時(shí)加入 0.50g NaCl、0.01gCaCl₂?7H₂0、1.00g 蛋白陳和 1% Tween80，將拮抗菌株接種在該培養(yǎng)基上，置于 濃度為 5% 的CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯菌落，如果菌落周圍出現(xiàn)暈圈，則表明該菌落的發(fā)酵液具有酯酶活性，反之則無[18]

1.3.4淀粉水解活性分析。制備TSB固體培養(yǎng)基時(shí)，添加1% 的可溶性淀粉。再將拮抗菌接種到該培養(yǎng)基表面，并放置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基上長出明顯菌落。當(dāng)菌落形成后，將已經(jīng)稀釋20倍的盧戈氏碘液從培養(yǎng)基平板的側(cè)邊緩緩倒入，讓其均勻覆蓋。靜置 3～4min ，輕輕倒去多余的碘液。此時(shí)，若在自然光線下觀察到培養(yǎng)基表面出現(xiàn)了透明的光圈，表明該菌株具有淀粉水解酶的活性;若未觀察到透明光圈，則表明該菌株不具備此酶活性[18]

1.3.5V-P反應(yīng)分析。在制備TSB液體培養(yǎng)基的過程中，添加了 0.5% 的葡萄糖作為補(bǔ)充成分。將拮抗菌的菌液接種到該特殊的液體培養(yǎng)基中，隨后，將該培養(yǎng)基置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24h 。培養(yǎng)結(jié)束后，取1 mL 40% NaOH與 1mL 菌液混合，再加入微量 0.3% 的肌酸，經(jīng)過劇烈搖動(dòng)以達(dá)到充分混合均勻的狀態(tài)后，讓其靜置10min 。如果溶液顯現(xiàn)紅色，則表明該菌株V-P反應(yīng)為陽性;反之，則判定為陰性[19]

1.3.6吲哚產(chǎn)生反應(yīng)分析。在制備TSB液體培養(yǎng)基的過程中，加入 1% 的胰蛋白脈。隨后，將拮抗菌的菌液接種到添加了胰蛋白脈的培養(yǎng)基中，將該培養(yǎng)基放置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24h 。培養(yǎng)結(jié)束后，向菌液中加人 1～2mL 乙醚，并輕輕搖晃使其混合，之后靜置等待溶液分層。當(dāng)溶液出現(xiàn)明顯分層后，往其中加入數(shù)滴吲哚試劑，注意液體分層界面的顏色變動(dòng)，如果觀察到有紫紅色出現(xiàn)，則可判定為陽性反應(yīng)；相反，如果未見紫紅色，則判定為陰性反應(yīng)[19]

1.4拮抗菌發(fā)酵上清液的抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性

1.4.1不同酶溶液處理后的發(fā)酵液穩(wěn)定性。將發(fā)酵上清液的pH調(diào)整至7.0后，加入濃度為 1mg/mL 胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K的溶液。隨后，將這些混合物置于 37°C 的水浴鍋中進(jìn)行 ^2h 的恒溫水浴處理。再通過 80^qC 水浴加熱10min 使酶變性失活。參照文獻(xiàn)[20]的方法，為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，設(shè)置了未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液作為參照組，并且所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4.2發(fā)酵上清液對(duì)其他致病菌的抑制作用。利用挖孔和棉棒涂布法[21]，評(píng)估發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活性。同時(shí)設(shè)置了高溫滅活后的發(fā)酵液作為對(duì)照組。整個(gè)試驗(yàn)過程重復(fù)3次。

1.4.3發(fā)酵液的熱、酸堿穩(wěn)定性分析。為了評(píng)估拮抗菌株發(fā)酵上清液的熱穩(wěn)定性，將發(fā)酵上清液置于水浴或金屬浴中加熱 30min ，加熱溫度梯度為 37，60，80，100，121^°C ；加熱完成后自然冷卻至室溫，進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)定。為了測(cè)試拮抗菌株發(fā)酵上清液的酸堿穩(wěn)定性[22]，使用 5mol/L 的HCl溶液和

5mol/L 的 ΔNaOH 溶液，將發(fā)酵上清液的 pH 調(diào)整至2、4、6、8、10，調(diào)整后的樣品經(jīng) 37^°C 水浴 2h 穩(wěn)定后，再將 ΔpH 回調(diào)至7.0，進(jìn)行酸堿穩(wěn)定性測(cè)定。在這2項(xiàng)測(cè)試中，以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照組，并且所有測(cè)試均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)分析在此次試驗(yàn)中，所有數(shù)據(jù)均源自3次平行試驗(yàn)的測(cè)定，并以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ Mean±SD ）的形式呈現(xiàn)。利用GraphpadPrism9.5.1和Excel2021軟件系統(tǒng)整理與深入分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。分析過程中，綜合運(yùn)用 χ_t 檢驗(yàn)（Student’st -test）來比較兩組數(shù)據(jù)均值的差異顯著性，單因素方差分析（One-WayANOVA）來評(píng)估多組數(shù)據(jù)間均值的整體差異，以及最小顯著差異法（LSD）來明確組別間的均值差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，所有分析均以 Plt;0.05 作為判斷差異顯著的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1抑菌菌株的篩選通過挖孔和棉棒涂布法，篩選出3株對(duì)金黃色葡萄球菌有較明顯抑制作用的菌株（W8、W10、W13），且3株菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑在16.46＼～19.08mm ，抑菌圈最小的是W10（ 16.46mm^? ），較大的抑菌圈菌株是W8（ 17.75mm ），抑菌圈最大的菌株為W13（ 19.08mm? ），對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳，因此選擇W13為后續(xù)的深入研究對(duì)象，后續(xù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)W13發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等病毒指示菌也有明顯的抑制效果（圖1和表1）。

注：A.金黃色葡萄球菌；B.枯草芽孢桿菌；C.大腸桿菌。

Note：A.Staphylococcusaureus;B.Bacillussubtilis;C.Escherichiacoli.

圖1拮抗菌株抑菌效果

Fig.1The antibacterial effect of antagonistic strains

2.2 拮抗菌株W13的鑒定

2.2.1菌株W13形態(tài)學(xué)觀察。在MRS固體培養(yǎng)基平板上對(duì)菌株W13進(jìn)行 12h 培養(yǎng)，菌落呈現(xiàn)出圓形、白色、表面光滑且不透明、邊緣整齊的特點(diǎn)（圖2A）。通過對(duì)菌株W13進(jìn)行革蘭氏染色并在 100× 光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌體呈現(xiàn)紫色，表明該菌株為革蘭氏陽性菌，且菌體形態(tài)為桿狀（圖2B）。

圖2菌株W13的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色鏡檢（B）

Fig.2Colony morphology（A）and Gram staining microscopic examination（B）of strain W13

2.2.2菌株W13的分子鑒定。采用挖孔和棉棒涂布法篩選，試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株W13對(duì)金黃色葡萄球菌展現(xiàn)出高度抑菌效果。隨后，對(duì)該菌株進(jìn)行16SrRNA基因測(cè)序，并將獲得的序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號(hào)為PQ656483。

基于這一16SrRNA基因序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對(duì)，拮抗菌株W13與Apilactobacilluskunkeei的16SrRNA基因序列相似性達(dá)到 99% ，選取了相似性超過 99% 的細(xì)菌種類作為參考，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

2.3發(fā)酵液生理生化特性分析

2.3.1過氧化氫酶活性分析。在接種了菌株W13的固體培養(yǎng)基中倒入 5% 的 H₂O₂ 溶液， H₂O₂ 溶液覆蓋菌株即可，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒有氣泡產(chǎn)生（圖4A），說明菌株沒有分解過氧化氫酶的活性。

2.3.2酪素水解活性分析。按照“1.3.2\"方法處理后，當(dāng)培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出清晰的菌落時(shí)，觀察到明顯的透明圈（圖4B），這一現(xiàn)象表明菌株W13具備酪蛋白水解的能力。

2.3.3脂酶活性分析。按照“1.3.3”方法處理后，待出現(xiàn)明顯菌落，并未發(fā)現(xiàn)皺縮暈圈（圖5A），表明菌株W13不具有脂酶活性。

2.3.4淀粉水解活性分析。按照“1.3.4\"方法處理后，在自然光線下進(jìn)行觀察，未發(fā)現(xiàn)明顯的透明光圈形成（圖5B），表明菌株W13并不具備淀粉水解酶活性。

2.3.5V-P反應(yīng)分析。按照“1.3.5\"方法處理后，溶液未呈現(xiàn)紅色（圖6A），表明菌株W13的V-P反應(yīng)為陰性。

2.3.6吲哚產(chǎn)生反應(yīng)分析。按照\"1.3.6\"方法處理后，在溶液的分層界面處出現(xiàn)紫紅色的吲哚環(huán)（圖6B），表明菌株W13的吲哚產(chǎn)生反應(yīng)為陽性。

2.4發(fā)酵液穩(wěn)定性分析

2.4.1發(fā)酵上清液的酶敏感性。采用平板挖孔法和棉棒涂布法測(cè)定拮抗菌株W13發(fā)酵上清液經(jīng)胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K處理后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），經(jīng)處理后的抑菌效果均顯著下降，與未經(jīng)酶處理的對(duì)照組（CK）相比，胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K的抑菌圈直徑分別顯著減少了 27.88%.23.38%.23.87% ，表明胃蛋白酶1的抑菌效果下降最顯著，達(dá)到了低度抑菌效果；胃蛋白酶A的抑菌效果最好。這可能是由于胃蛋白酶A的數(shù)據(jù)變異較大或者其處理效果相對(duì)較弱所致。

2.4.2發(fā)酵上清液的熱處理穩(wěn)定性。W13發(fā)酵上清液經(jīng)過不同溫度梯度處理后的抑菌效果如圖8所示，在 37^°C 時(shí)，抑菌圈直徑較大，平均約為 19.0mm ，這表明在接近適宜熊蜂生存溫度的環(huán)境下，抑菌物質(zhì)能夠較好地發(fā)揮其抑菌作用。隨著溫度的升高，抑菌圈直徑逐漸減小，在 60，80，100^°C 時(shí)，抑菌圈直徑分別顯著減少至 16.5，15.6，15.1mm ，這表明隨著溫度的升高，抑菌物質(zhì)的抑菌效果逐漸減弱；在 121^°C 時(shí)，抑菌圈直徑顯著減小至 9.1mm ，這一急劇變化表明在高溫條件下，抑菌物質(zhì)的抑菌效果受到了嚴(yán)重影響，可能由于高溫導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或失活。

2.4.3發(fā)酵上清液的酸堿穩(wěn)定性。從圖9可以看出，調(diào)整 注： 表示與CK相比，差異顯著（ Plt;0.05 。 Note：* indicates significant difference compared with C K（Plt;0.05）

發(fā)酵上清液的 ΔpH 對(duì)抑菌效果有明顯影響，不同 pH 處理組的抑菌圈直徑與對(duì)照組（ pH=7 ）相比均存在顯著差異（ Plt; 0.05），且在一定范圍內(nèi)（ ），抑菌效果隨 ΔpH 的升高而增強(qiáng)，但超過一定范圍（ pH=8 ）后，抑菌效果急劇下降，在pH=10 時(shí)拮抗菌株W13發(fā)酵上清液的抑菌能力幾乎喪失。在 ΔpH 為6的條件下，發(fā)酵上清液的抑菌效果最佳，這可能是由于在該 pH 下發(fā)酵上清液中的活性成分最穩(wěn)定。

注：*表示與CK相比，差異顯著（ Plt;0.05 。Note： * indicates significant difference compared with CK（ Plt;0.05） ：

3討論與結(jié)論

熊蜂是一種重要的授粉昆蟲，在自然界和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，熊蜂在設(shè)施作物中具有顯著的生物學(xué)特性優(yōu)勢(shì)、授粉技術(shù)優(yōu)勢(shì)以及生態(tài)與社會(huì)效益優(yōu)勢(shì)，是設(shè)施農(nóng)業(yè)中不可或缺的授粉昆蟲[23]。近年來，它們正面臨著來自環(huán)境的多因素壓力，包括生存范圍縮小、環(huán)境惡化、農(nóng)藥脅迫、全球升溫、病原菌侵染等，尋找保護(hù)熊蜂的方法迫在眉睫[24]。研究發(fā)現(xiàn)，熊蜂腸道是最大的菌群聚集地，經(jīng)過長久的進(jìn)化，腸道微生物已經(jīng)與個(gè)體形成高度平衡的互利共生關(guān)系[25]，在昆蟲的個(gè)體生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用，包括營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)免疫力和抗逆能力、解毒和抵抗病原菌等[26]。絕大多數(shù)熊蜂的生命周期只有1年，但它們體內(nèi)的菌群并非一成不變而是動(dòng)態(tài)變化的[27]，新出房的工蜂會(huì)通過與較大日齡工蜂交哺和食糞來獲取蜂群共有的菌群，也會(huì)因?yàn)橥獬鲆捠车确绞将@取相對(duì)特殊的腸道菌群[28]Weinhold等[29研究顯示，包括乳酸桿菌在內(nèi)的某些腸道微生物對(duì)一些致病菌具有顯著的拮抗作用，乳酸桿菌等在保護(hù)宿主的同時(shí)，還能夠延長蜂王體內(nèi)食物的保質(zhì)期。熊蜂腸道中的共生菌群可能是其有效抵御病原性短膜蟲入侵的主要機(jī)制[30]，并且腸道內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量多少與短膜蟲的感染頻率之間呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過對(duì)四川、青海、甘肅、內(nèi)蒙古這4個(gè)省份的短膜蟲流行狀況及腸道細(xì)菌數(shù)量差異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)維持腸道功能菌群的平衡狀態(tài)對(duì)于保障寄主的健康狀態(tài)具有極其關(guān)鍵的意義[31]

該研究通過對(duì)密林熊蜂蜂王腸道進(jìn)行拮抗菌株的分離、篩選及鑒定，旨在發(fā)掘具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抑菌資源。在分離篩選過程中，依據(jù)菌落的外觀特性進(jìn)行了初步篩選，并通過多次劃線純化獲得了純凈無雜菌的培養(yǎng)菌株。鑒于菌株的分類地位及最適培養(yǎng)溫度尚未明確，選擇了 37^°C 作為標(biāo)準(zhǔn)溫度條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，這一選擇基于試驗(yàn)方法的通用性以及對(duì)熊蜂腸道微生物生長特性的初步考慮。通過此方法，成功篩選出了對(duì)金黃色葡萄球菌具有高度抑菌效果的菌株W13。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)W13發(fā)酵上清液不僅對(duì)金黃色葡萄球菌有高度抑菌效果，還對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等指示菌表現(xiàn)出明顯的抑制活性，這顯示了W13具有廣譜抑菌的潛力。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，菌株W13在MRS固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形、白色、表面光滑且不透明、邊緣整齊的特點(diǎn)，且革蘭氏染色呈陽性，菌體形態(tài)為桿狀。這些特征為菌株W13的初步鑒定提供了重要依據(jù)。通過16SrRNA基因測(cè)序及在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，進(jìn)一步確定W13為厚壁菌門（Firmicutes）乳桿菌目（Lactobacillales）乳桿菌科（Lactobacillaceae）Apilactobacillus屬的乳酸菌Apilactobacilluskunkeei。

針對(duì)菌株W13對(duì)病毒指示菌的高效拮抗活性，該試驗(yàn)又進(jìn)一步對(duì)W13發(fā)酵上清液的生理生化反應(yīng)和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)W13發(fā)酵上清液無脂酶、過氧化氫酶、淀粉水解酶的活性，但具有酪素水解活性，V-P反應(yīng)為陰性，吲哚產(chǎn)生反應(yīng)為陽性。再經(jīng)胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K處理后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后的抑菌效果均顯著下降，胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K相對(duì)于對(duì)照組抑菌圈直徑分別顯著減少了27.88%.23.38%.23.87% ，由此猜測(cè)發(fā)酵上清液的抗菌物質(zhì)成分可能是多肽或者蛋白質(zhì)。在熱穩(wěn)定中，發(fā)現(xiàn)抑菌活性在37^°C 最高，隨著溫度增加抑菌活性逐漸下降，溫度升高至121^°C 抑菌活性幾乎喪失，可能由于高溫導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或失活[32]。酸堿穩(wěn)定性中，在pH過高或者過低條件下，均會(huì)顯著影響拮抗活性，表現(xiàn)出較差的酸堿穩(wěn)定性。

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