輻射污染區(qū)細(xì)菌多樣性及相關(guān)菌株篩選的多方法分析

中圖分類號：Q93-3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）03-0715-08

0 引言

【研究意義】放射性輻射會顯著改變周圍土壤的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性，導(dǎo)致環(huán)境生物多樣性下降[1]。然而，輻射污染區(qū)仍存在豐富的微生物資源。截至目前，針對核輻射污染區(qū)微生物的相關(guān)研究報道較為有限?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高放射性污染和低放射性污染的土壤中均含有多種微生物[2]。輻射污染程度嚴(yán)重的環(huán)境中仍存在豐富的真菌多樣性，而且含黑色素的菌種占主導(dǎo)地位，具有極強(qiáng)的抗輻射特性[3]。同時，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)輻射環(huán)境中土壤微生物對維持和修復(fù)土壤生態(tài)功能至關(guān)重要[4]，通過參與氧化還原、溶解、沉淀、吸附和甲基化等反應(yīng)影響放射性元素的遷移[5]，可用于重金屬和放射性核素污染土壤及廢水修復(fù)[6-7]，甚至在作物育種[8]、生物醫(yī)藥開發(fā)[9]等多個領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。通過高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，輻射污染程度會顯著影響土壤中微生物群落分布，隨著污染程度的提高放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門及未分類菌門所占比例逐步提高，并且發(fā)現(xiàn)污染區(qū)內(nèi)存在大量未分類單元[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】然而，在分離的1500余株各類微生物中，涉及上百余屬，但獲得的新種屬資源較為有限[11-18]。隨著“微生物培養(yǎng)組學(xué)（Microbial cul-turomics）\"概念提出等[19]，微生物培養(yǎng)組學(xué)利用高通量測序結(jié)果為指引，通過使用多種培養(yǎng)條件不僅可獲得大量未/難培養(yǎng)微生物，也可有效校正高通量測序試驗結(jié)果的偏差[20]，已成為微生物資源挖掘和研究的重要手段?！緮M解決的關(guān)鍵問題采用高通量測序技術(shù)，分析輻射污染土樣內(nèi)細(xì)菌群落組成及多樣性，并通過多種分離培養(yǎng)方法挖掘樣品中豐富的微生物資源，研究菌株的生長特性和功能，為進(jìn)一步揭示輻射污染區(qū)內(nèi)的微生物群落多樣性、挖掘潛在微生物菌種資源提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.1 材料

1. 1.1 樣品采集

樣品采自高輻射區(qū)域（ gt;10000Bq/kg 地下5～20cm 的土壤，隨機(jī)選取3個采樣點(diǎn)，各采樣區(qū)域在 5m×5m 采取五點(diǎn)采樣法采集樣品，并放置在鉛盒內(nèi)，送至實驗室， 4^°C 保存，備用。

1. 1.2 主要試劑與儀器

磁性法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒（天根公司）；PCR相關(guān)試劑（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（Biowest公司）； 50×TAE （Genview公司）；核酸染料（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）所有試劑均為分析純。

EPOCH-2酶標(biāo)儀（美國博騰儀器有限公司）；DYCP-31DNDNA電泳槽（北京六一儀器廠）；DYY-5穩(wěn)壓電泳儀（北京六一儀器廠）；GelDocGO凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機(jī)（中國凱特實驗儀器有限公司）；BiometraTonePCR儀（德國耶拿公司）等。

1. 1.3 培養(yǎng)基

2216E（海洋肉湯）培養(yǎng)基（ g/L） ：蛋白脈 5_g ，酵母提取物 1g ，檸檬酸鐵 0.1g，NaCl19.45g MgCl₂5.9g，Na₂SO₄3.24g，CaCl₂1.8g，KCl0.55 22mg，Na₂SiO₃?9H₂O4mg，NaF2.4mg，NH₄NO₃ 1.6mg，Na₂HPO₄8mg ，蒸餾水1L，瓊脂 _15g 。

G（高氏一號）培養(yǎng)基 KH₂PO₄0.5g ， MgSO₄ 0.5 g， FeSO₄ 0.01 g，NaCl 0.5g ，可溶性淀粉 20g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH7.2＼～7.4。

R2A培養(yǎng)基（ ）：酵母浸出粉 0.5g ，蛋白脈 0.5g ，酪蛋白水解物 0.5g ，葡萄糖 0.5g ，可溶性淀粉 0.5g，K₂HPO₄0.3g ，無水 MgSO₄0.024g ，丙酮酸鈉 ，蒸餾水1L，瓊脂 15g ，額外添加1% NaCl， pH7.2～7.4 。

TSA培養(yǎng)基 （g/L） ）：胰酪陳 15g ，大豆木瓜蛋白酶水解物 5g，NaCl5g ，瓊脂 15g，pH 7.2～ 7.4。

淀粉酶培養(yǎng)基（ ：淀粉 10g ，牛肉膏 3Δg 蛋白豚 10g，NaCl5g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH 7.2＼～7.4。

蛋白酶培養(yǎng)基（ g/L ：脫脂奶粉 50g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH 7.2～7.4 。

纖維素酶培養(yǎng)基（ ）：羧甲基纖維素鈉10g，（NH₄）₂SO₄4g，KH₂PO₄2g，MgSO₄0.5g ，蛋白陳 10g ，牛肉膏 5g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH 7.2 ～7.4 。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、擴(kuò)增與測序

采用磁性法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒提取土壤樣品微生物DNA。細(xì)菌上游引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA - 3^′ ），下游引物為806R（ 5^′ -GGACTACHVGGGTWTCTA- ），PCR擴(kuò)增體系為：5XPhusionbuffer4μL ，dNTPs（10 mmol/L） 0.4μL ，上、下游引物（5μmol/L 各 0.8μL ，Phusion DNA 聚合酶 0.2μL ，模板DNA 10ng ，用 補(bǔ)足至 20μL 。PCR擴(kuò)增條件為： 98^°C 1 min， 98^qC 10 s， 50% 30 s，72% 30s進(jìn)行30次循環(huán)，最后在 72% 下延長5min 。

PCR產(chǎn)物采用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用EPOCH-2酶標(biāo)儀進(jìn)行定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用 2% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶采用通用型DNA純化回收試劑盒（TianGen）回收產(chǎn)物。委托北京諾禾致源科技股份有限公司通過Illumi-naNovaSeq高通量測序平臺進(jìn)行測序分析。

1.2.2 高通量數(shù)據(jù)

測序獲得的原始序列進(jìn)行：（1）使用FLASH（V1.2.11）軟件對每個樣本的reads進(jìn)行拼接，得到原始Tags數(shù)據(jù)（RawTags）；（2）使用fastp（VO.23.1）軟件對拼接的得到的RawTags進(jìn)行過濾得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)；（3）使用USEARCH（V11.0.667）軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（EffectiveTags）；（4）使用QI-IME2（V1.9.1）軟件中的Uparse算法（V7.0.1001）對樣本中在 100% 相似度水平的Ef-fectiveTags進(jìn)行聚類，獲得各分類水平下個樣本內(nèi)的擴(kuò)增子序列變體（Amplicon SequenceVari-ants，ASVs）組成，并根據(jù)Silva分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對ASVs進(jìn)行分類學(xué)注釋，得到每個樣品的ASVs。利用Past軟件（v4.09）計算 ∝ 多樣性指數(shù)（chaol、coverage、Shannon和Simpson）。采用微科盟生信云平臺（https：//bioincloud.tech/）對土樣的微生物物種進(jìn)行可視化分析，采用韋恩圖展示各樣品間不同的細(xì)菌群落組成。

1.2.3輻射污染區(qū)土壤內(nèi)細(xì)菌的分離培養(yǎng)

撒土法培養(yǎng)：稱取 0.2g 王樣去除石子和較大雜質(zhì)后，將土樣均勻覆蓋在G、1/32216E、R2A和TSA培養(yǎng)基表面。

傳統(tǒng)稀釋法：稱取 5.0g 土樣加人 50mL 生理鹽水中， 處理1h，之后室溫靜置 30min 獲得稀釋10倍的土壤懸浮液。通過稀釋梯度法制作 10^-2～10^-5 的土壤懸浮液，取不同濃度梯度的土壤懸浮液 100μL ，涂布于G、1/32216E、R2A和TSA培養(yǎng)基平板中。

BiologEco生態(tài)板法：稱取 土樣加入50mL 生理鹽水中 37^°C，150r/min 處理1h，之后室溫靜置 30min 獲得稀釋10倍的土壤懸浮液。通過稀釋梯度法制作 10^-3 的土壤懸浮液，每孔150μL ，加入BiologEco生態(tài)板及稀釋3倍后的BiologEco生態(tài)板內(nèi)，培養(yǎng)后按照碳源利用情況每孔取100μL ，涂布于G、1/32216E、R2A和TSA培養(yǎng)基平板內(nèi)。

紫外輻照預(yù)處理：稱取 1.0g 土樣在含有10ml無菌水平皿內(nèi)，利用 6W 紫外燈輻照 20min 后，吸取 100μL 土壤懸浮液，在 G，1/3 2216E 、R2A和TSA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行稀釋涂布培養(yǎng)。

所有平板均在 37% 恒溫培養(yǎng)5＼～7d，挑取不同形態(tài)菌株單菌落劃線培養(yǎng)。分離到的菌株保存在相應(yīng)斜面上，在 4^°C 下保存，同時采用 30% 甘油管和安瓿管保藏于 -80% 冰箱。

1.2.4 菌株16SrRNA基因測序

細(xì)菌的16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增模板DNA采用快速凍融法，擴(kuò)增引物為27F（ 5^′ -AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（ 5^′ - GGTTAC-CTTGTTACGCTT -3^′ ）。PCR擴(kuò)增體系為（ 30μL ：

2×PCR Taq Master Mix 15μL ，上、下游引物（10μmol/L 各 1μL ，模板DNA 2μL ddH₂O11μL_c PCR反應(yīng)體系： 94°C 5 72^°C45s，35 個循環(huán)， .72%10min 。

1.2.5 細(xì)菌功能特性

1. 2.5.1 細(xì)菌耐受性

選取97株不同種的細(xì)菌進(jìn)行鹽堿及產(chǎn)酶活性分析。將NaCl添加至培養(yǎng)基中使?jié)舛冗_(dá)到3.0%.5.0%.10.0% 和 12.0% ，將待測菌株在平板上劃線培養(yǎng)后放入 37% 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d，以確定菌株耐受NaCl的生長范圍。

用 1mol/L 的鹽酸和氫氧化鈉將培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0、9.0、11.0和12.0，將待測菌株在平板上劃線培養(yǎng)后放人 37% 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3～5d 。以上檢測每組3個重復(fù)。

1. 2.5. 2 菌株產(chǎn)酶特性

采用點(diǎn)接法將待測菌株接種于產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基上， 37% 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3～5d 。其中，蛋白酶、纖維素酶采用透明圈法；淀粉酶活性采用 1% 碘液法，觀察菌苔周圍培養(yǎng)基變色情況；氧化酶活性通過滴加 1% 四甲基對苯二胺鹽酸鹽溶液，觀察菌體是否立即變色；過氧化氫酶活性滴加 3% 過氧化氫溶液，觀察菌體是否有氣泡產(chǎn)生；每組3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將濃度合格的樣品送至上海生物生工技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果經(jīng)DNAstar-Lasergenev6軟件檢查峰圖后，將兩端序列進(jìn)行拼接和校對，獲得有效序列。將所得序列用EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net）和NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)相似度較高的序列確定菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落組成及多樣性分布

研究表明，共獲得347326條細(xì)菌16SrRNA基因序列，308067條質(zhì)控序列，有效序列為285122條，占比 82.09% 。按 100% 相似度聚類，共有2178個ASVs。各樣品文庫覆蓋率均在 99% 以上。FS1樣品的Chao1和Shannon指數(shù)較高，該地點(diǎn)微生物群落多樣性較豐富。表1～2

試驗共獲得2178個ASVs，涉及30個門、384個屬，各樣品菌群總體組成相似。厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）擬桿菌門（Bacteroidota）及放線菌門（Actinobacteriota）為輻射污染區(qū)細(xì)菌的優(yōu)勢菌門，累計占比在 97.60% 以上。同時，樣品中還檢測到典型耐輻射菌奇異球菌屬Deinococcus所在菌門（Deinococcota），但占比較低，僅為 0.04% 。屬水平上動性球菌屬（Pl-anococcu）Exiguobacterium、芽孢桿菌屬（Bacil-lus）海洋桿菌屬（Pontibacter）和變形桿菌屬（Pro-teus）等占比均在 5% 以上，累計占比在 46.51% ＼～53.23% 。另外，試驗還發(fā)現(xiàn)存在著較多未明確分類菌屬，占比在 5.45%～6.26% 。圖1

2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌及其分子鑒定

研究表明，共分離獲得277株細(xì)菌，基于16SrRNA基因序列比對，共涉及4個門、51個屬、97個種。其中，微小桿菌（Microvirga）、鏈霉菌（Streptomyces）海洋桿菌（Pontibacter）纖維單胞菌（Cellulomonas）芽孢桿菌（Bacillus）、固氮螺旋菌（Azospirillum）和假單胞菌（Pseudomonas）等屬菌株較多。鏈霉菌屬菌株涉及種類最多，包含18個種45株，占 16.25% ，其次為海洋桿菌屬，占7.22% 。盡管分離到的微小桿菌最多，但種類較少，包含5個種69株，占 24.91% 。圖2

表1 不同土壤樣品內(nèi)基因組DNA序列信息

2.3 不同方法篩選細(xì)菌

研究表明，傳統(tǒng)稀釋法分離到121株細(xì)菌，涉及29個屬，57個種，其次為BiologEco生態(tài)板碳源利用情況進(jìn)行分離，獲得102株細(xì)菌，涉及20個屬，27個種。不同篩選方法也表現(xiàn)出互補(bǔ)性，如撒土方法分離到了ActinomaduraBailinhaonel-laKibdelosporangium等；傳統(tǒng)稀釋法分離到Plas-torhodobacter、BrachybacteriumPorifericola及Brevundimonas等；BiologEco生態(tài)板分離到SaccharomonosporaMicrobacterium、Indioceanicola和Pig-mentiphaga等；而經(jīng)紫外輻照預(yù)處理后則分離到Modestobacter、Rhodocytophaga 和 Halalkalibacter等屬。圖3＼～4

2.4 潛在細(xì)菌新種挖掘

研究表明，在分離獲得的277株細(xì)菌株中，有10株菌與已知模式菌株序列相似性均小于98.5% 共涉及4個屬，其中有6株海洋桿菌屬（Pontibacter）2株假紅桿菌屬（Plastorhodobacter）等。輻射污染區(qū)內(nèi)存在諸多需要進(jìn)一步挖掘的潛在微生物新類群（物種）資源。表3

表3潛在新種的16SrRNA基因序列比對

2.5 篩選菌株抗逆特性及生物學(xué)活性

2.5.1 菌株鹽堿耐受特性

研究表明，此次篩選的細(xì)菌菌株中絕大部分具有耐鹽堿能力，其中 89.69% 的菌株能耐受 3% 的 NaCl，21.65% 的菌株可在 10% NaCl以上濃度生長， 65.98% 的菌株可在pH9的條件下生長，30.93% 的菌株能在 pH11 條件下生長。圖5

2.5.2 菌株生物活性

研究表明，試驗菌株產(chǎn)酶特性中： 65.98% 的菌株具有淀粉酶活性； 46.39% 的菌株具有蛋白酶活性； 44.33% 的菌株具有纖維素酶活性； 38.14% 的菌株有氧化酶活性； 97.94% 的菌株具有過氧化氫酶活性。圖6

3討論

3.1LinXueju等[21]采用高通量測序技術(shù)在漢福德試驗場地下微生物群落組成的分析中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌和古菌譜系中的新支系，同時發(fā)現(xiàn)了變形菌門中未培養(yǎng)的譜系。MarieRagon等2發(fā)現(xiàn)細(xì)菌域變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和放線菌門等在切爾諾貝利核電站污染區(qū)域占比較高；真菌域中子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomyco-ta）和壺菌門（Chytridiomycota）等占比較高。團(tuán)隊前期采用高通量測序技術(shù)初步發(fā)現(xiàn)輻射污染區(qū)共涉及細(xì)菌域的19個門和6個潛在菌門及其它未分類菌門的726個屬。在高輻射污染區(qū)中DevosiaHalomonasBacillusMicrovirga 和 Jeotgali-bacillus等屬為主要菌群，并發(fā)現(xiàn)存在大量未分類菌屬占比在 24.79% [10]。試驗研究發(fā)現(xiàn)，采集的土壤樣品中共包含30個門，240個科，384個屬，其中以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門及放線菌門占比較高，累計占比在 97.60% 以上，與前期結(jié)果基本一致。但在高輻射不同區(qū)域內(nèi)菌群在屬水平分類上存在差異，主要菌屬為Planococcu、Exig-uobacteriumBacillusPontibacter和Proteus，且未分類種屬明顯降低，占比在 5.45%～6.26% 。

3.2J-CLagier等19通過采用212種不同的培養(yǎng)條件，分離鑒定出174種同時與高通量測序結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)282個已知物種內(nèi)有51個與培養(yǎng)組學(xué)鑒定結(jié)果重疊。AmiDiakite等[23研究結(jié)果表明，培養(yǎng)組學(xué)獲得了35個未知的細(xì)菌，其中19個是新的分類群，與分子方法相比培養(yǎng)組學(xué)使豐度提高了 20% 。李文鈞等[24通過培養(yǎng)組學(xué)方法，針對鏈霉菌屬微生物設(shè)計培養(yǎng)基，獲得了400個潛在新種其中 12% 屬于鏈霉菌屬，并且與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，效率提高了4倍。盡管前期從輻射污染區(qū)分離到1500多株微生物，也鑒定命名了Yu-hushiella deserti、Deinococcus wulumuqiensis、Deino-coccus malanensis及 Paenibacillus wulumuqiensis等新種[15，25-27]，但與高通量結(jié)果相比獲得物種仍較為有限。通過采用撒土法、傳統(tǒng)稀釋法、BiologEco生態(tài)板法和紫外輻照預(yù)處理等方法，共獲得277株細(xì)菌，隸屬于變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，涉及51個屬，97個種，顯著提高了輻射污染區(qū)微生物分離效率和物種多樣性。而且個別菌屬也只在一種篩選方法內(nèi)獲得，表明不同篩選方法具有較好的互補(bǔ)性。同時，與高通量測序結(jié)果比較Porifericola、Mesobacillus、Paeniba-cillus和Kibdelosporangium等屬僅在培養(yǎng)法獲得，進(jìn)一步證明培養(yǎng)組學(xué)方法可獲得高通量測序未發(fā)現(xiàn)的微生物，并且可有效校正試驗偏差。

4結(jié)論

土壤樣品內(nèi)細(xì)菌域共涉及30個門384個屬，輻射污染區(qū)大部分菌株均有良好的耐鹽堿能力，獲得許多產(chǎn)功能酶菌株，并發(fā)現(xiàn)10株潛在新種。

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Abstract：【Objective】 To screen and mine the microbial species resources by analyzing the diversity and community composition of soil bacteria in the radiation-contaminated area.which provides a theoretical basis for the comprehensive mining and utilization of the microbial resources in radiation-contaminated areas. 【Methods】Soil samples were randomly colected from three sites in the high radiation area of a radiation - contaminated area in northwest China，and the composition of soil bacterial communities in the area was analyzed by using Ilumina NovaSeq high -throughput sequencing technology； the bacteria within the soil were isolated by various screening methods，molecularly identified by using 16S rRNA，and their functional properties were preliminarily studied.【Results】The results of high-throughput sequencing showed that the bacterial domains within the soil samples involved 3O phyla and 384 genera，with the dominant phyla being Firmicutes （52.15% ），Proteobacteria （30.17% ），Bacteroidota （10.42% ）and Actinobacteriota （4.94% ）. Actinobacteriota， 4.94% ）.Planococcus （17.45% ），Exiguobacterium（ 13.65% ），Bacillus （6.97% ）and Pontibacter （ 6.78% ）were the dominant genera. Culturable methods were used to isolate 277 bacterial strains which belonged to 51 genera and 97 species. The dominant bacteria genera were Microvirga （24.91% ）， Streptomyces（ 16.25% ），Pontibacter （7.22% ），Cellulomonas （5.78% ），etc.Ten potential new species were isolated，and majority of the obtained strains had strong salinity tolerance and functional enzyme-producing activities.【Conclusion】The diversity of soil bacteria in radiation-contaminated areas is relatively rich.

Key words ：radiation -contaminated area； high -throughput sequencing；culturable bacteria； functionalcharacteristics