百香果果生炭疽菌小GTP酶基因Rab7的鑒定與功能分析

關(guān)鍵字：百香果；果生炭疽菌；小GTP酶基因Rab7；致病性中圖分類號：S436.639 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號： 1000-4440（2025）06-1107-09

Abstract：Anthracnose of Passflora edulis caused by Coletotrichum fructicola isa significant disease afecting the yield andqualityof pasionfruit.Elucidating thepathogenicmolecularmechansmsofColetotrichumfructicolaisof greatsignificance for disease control. In this study，we identified the small GTPase Rab7 from c . fructicola and compared its amino acid sequences withthoseof Rab7 proteins from various fungi.Phylogeneticanalysis revealed that theRab7proteinof c fructicola hadthemost distantrelationshipwiththeRab7proteinofScharomycescerevsiae，whileitwasloselyelatedtotheRab7proteinsofColeto trichumgloeosporioidesand Colletotrichumgraminicola.Using homologous recombination technology，we constructed the Rab7 gene knockout strain ΔRab7 and the complemented strain △Rab7/Rab7.Phenotypic analysis showed that comparedwith thewild type and Δ Rab7/Rab7，the Δ Rab7 mutantexhibited significantlyreducedcolonydiameter on PDAY and MM media，significantly increased melanin accumula

tion，and significantly decreased conidial production.However， Δ Rab7and the wild type N425did not show significant differences in sensitivity to H₂O₂ stress.Confocal laser scanning microscopy observations indicated that the Rab7-GFP fusion protein was localized to the vacuolar membrane，and the vacuoles in Δ Rab7appeared fragmented，suggesting that Rab7 gene maintained normal vacuolar morphology in c fructicola by regulating vacuolar fusion.This study provides a theoretical basis for elucidating the molecular mechanisms of pathogenicity in C_* fructicola.

Key Words： Passiflora edulis；Coletotrichum fructicola；small GTPase gene Rab7；pathogenicity

百香果（Passifloraedulis），又稱西番蓮、雞蛋果，是西番蓮科西番蓮屬的多年生常綠攀緣草質(zhì)藤本植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在中國廣西、、廣東和海南等地廣泛種植，其果汁色澤鮮艷，酸甜可口，富含營養(yǎng)，具有較高的食用價值、觀賞價值、藥用價值，深受消費者喜愛[1-3]。炭疽病是百香果的重要病害之一，已成為百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素。因此，深入研究百香果炭疽病的發(fā)病機(jī)理具有重要意義。已有研究結(jié)果表明，果生炭疽菌是引起百香果炭疽病的主要病原菌之一[4]。近年來，關(guān)于果生炭疽菌功能基因的研究逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)，Homeobox家族轉(zhuǎn)錄因子Htf2調(diào)控菌株的營養(yǎng)生長、分生孢子形態(tài)建成以及黑色素合成；半胱氨酸蛋白酶 Atg4 與 Atgδ 相互作用，共同調(diào)控果生炭疽菌的生長、自噬和致病性；雙特異性磷酸酶Msg5受轉(zhuǎn)錄因子Ap1調(diào)控，其調(diào)節(jié)著果生炭疽菌對油茶的致病性[5-7]。然而，與稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌等模式病原真菌相比，針對果生炭疽菌功能基因的系統(tǒng)性研究仍然較少，尤其是關(guān)于其致病基因在百香果宿主中的作用尚未深入探索。因此，進(jìn)一步研究果生炭疽菌的功能基因，有助于揭示其致病分子機(jī)制，為百香果炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

Rab蛋白是Ras超級家族成員，也被稱為小G蛋白，是一類相對分子量為 2×10⁴～4×10⁴ 的單體蛋白，具有內(nèi)源GTP酶活性，主要參與囊泡運輸過程，包括胞吞和胞吐。其中，Rab7蛋白參與了早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變過程[8]。在絲狀真菌中，Rab7與液泡融合密切相關(guān)，其缺失會導(dǎo)致菌絲液泡碎片化[9-]。此外，在植物病原真菌中，Rab7不僅參與囊泡運輸，還調(diào)控病原菌的生長發(fā)育和致病性。例如，F(xiàn)gRab7缺失會導(dǎo)致禾谷鐮刀菌的菌落生長減緩、菌絲分枝增多、分生孢子產(chǎn)量降低、有性發(fā)育受阻、毒素合成減少、致病性幾乎完全喪失[9]。在稻瘟病菌中，Rab7同源蛋白MoYpt7的缺失會導(dǎo)致菌株的營養(yǎng)生長變緩、產(chǎn)孢能力下降、液泡融合受阻以及自噬體形成異常。此外，由于附著胞形成受阻，該菌株對水稻的侵染能力也顯著降低[10，12]。目前，針對炭疽菌屬Rab蛋白的研究較少，因此有必要對該家族蛋白的功能進(jìn)行深人探究，以明確其在炭疽菌致病過程中的作用。本研究擬以Rab7蛋白為研究對象，旨在揭示其在果生炭疽菌中的生物學(xué)功能及其在侵染百香果過程中的作用機(jī)制，從而為解析果生炭疽菌的致病分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

果生炭疽菌野生型菌株N425、質(zhì)粒 pCZ003 和pCZ025由寧德師范學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院保存。病原菌接種試驗所用百香果品種為金元寶。馬鈴薯葡萄糖瓊脂酵母培養(yǎng)基（PDAY）：馬鈴薯 200g ，酵母粉 1g ，葡萄糖 20g ，瓊脂粉 20g ，蒸餾水定容到 ?；A(chǔ)培養(yǎng)基（MM）： Na₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g MgSO₄?7H₂O0.2g，NaCl1.0g ，葡萄糖4 ，用 ΔNaOH 將 pH 值調(diào)至7.2，固體培養(yǎng)基另添加瓊脂粉 20.0g ，蒸餾水定容到 0原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基（TB3）：酵母提取物 3Δg ，酪氨酸水解蛋白 3g ，蔗糖 200g ，固體培養(yǎng)基另添加瓊脂粉 20g ，蒸餾水定容到 ¹L 。完全培養(yǎng)基（CM）：酵母提取物 6g ，酪氨酸水解蛋白 6g ，蔗糖 10g ，瓊脂粉 20g ，蒸餾水定容到 ^1L 。以上培養(yǎng)基均經(jīng)高壓滅菌，室溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 Rab7蛋白氨基酸序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建從果生炭疽菌 N425 基因組數(shù)據(jù)庫中獲取Rab7基因序列[13]，通過NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對獲得其氨基酸序列。同時下載膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）禾谷炭疽菌（Colletotrichumgraminicola）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、粗糙脈孢霉（Neurosporacras-sa）禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）釀酒酵母（Saccharomycescere-visiae）7種真菌的Rab7同源蛋白氨基酸序列。使用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列比對，使用ENDscript軟件進(jìn)行序列著色。采用MEGA11軟件的鄰接法（Neighbor-joining）進(jìn)行1Ooo次bootstrap檢驗構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2果生炭疽菌Rab7基因的敲除與回補(bǔ)利用SDS 法[14]提取果生炭疽菌N425基因組DNA，并以其為模板，使用引物AF/AR和BF/BR分別擴(kuò)增Rab7基因上下游同源臂片段A和B；以pCZ025為模板，分別使用引物G418F/G41R和G18F/G418R擴(kuò)增新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（GEN）的前2/3片段（Ga）和后2/3 片段（Gb），通過融合PCR將A與Ga片段連接獲得AG片段，B與Gb片段連接獲得GB片段，將AG和GB片段共轉(zhuǎn)化至N425原生質(zhì)體中，原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化參照彭成彬等[15]的方法。利用終質(zhì)量濃度為 400μg/mL 的新霉素G418篩選轉(zhuǎn)化子，提取這些轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，利用3對引物OF/OR、UAF/UAR和DBF/DBR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗證轉(zhuǎn)化子是否為 Rab7 基因缺失突變體。

利用引物CF/CR從N425基因組中擴(kuò)增Rab7基因開放閱讀框片段C，引物CF/CR分別含有BamHI和NotI酶切位點，將C片段連接至pCZ003質(zhì)粒的GFP基因下游，構(gòu)建回補(bǔ)載體，將回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化至Δ Rab7突變體原生質(zhì)體中，利用終質(zhì)量濃度為400μg/mL的潮霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取這些轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，利用3對引物OF/OR、UAF/UAR和DBF/DBR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗證轉(zhuǎn)化子是否為Rab7基因回補(bǔ)菌株。引物序列如表1所示。

1.2.3果生炭疽菌菌落形態(tài)觀察將各菌株接種于PDAY和MM平板培養(yǎng)基上， 26^°C 光照培養(yǎng)5d后，測量菌落直徑并觀察菌絲形態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)3d后，觀察黑色素合成情況。將各菌株接種于CM固體培養(yǎng)基（添加 ，終濃度為 9.79mmol/L ）上，暗培養(yǎng)3d后，測量菌落半徑并計算 H₂O₂ 對各菌株的抑制率。

1.2.4分生孢子產(chǎn)量統(tǒng)計與孢子形態(tài)觀察將直徑 5mm 的菌絲塊接種于 100mL CM液體培養(yǎng)基中， 26°C 條件下 150r/min 振蕩培養(yǎng) 5d 。過濾收集分生孢子，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，通過顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)。用 ddH₂0 將孢子含量調(diào)節(jié)至至 1mL 5×10⁴ 個，滴于疏水蓋玻片上，暗培養(yǎng) ^12h 后觀察附著胞形態(tài)。

1.2.5致病性分析取新鮮百香果葉片，清水洗凈后，在葉片上制造十字傷口。將菌絲塊接種于傷口處，保濕培養(yǎng)3～7d后觀察病斑形成情況，以接種無菌瓊脂塊的葉片為對照。

1.2.6Rab7蛋白亞細(xì)胞定位觀察取 Rab7 基因互補(bǔ)菌株的菌絲塊置于載玻片上，分別滴加無菌水和4μmol/L FM4-64染料，保濕孵育 30min 。使用激光共聚焦顯微鏡分別在明場、藍(lán)光激發(fā)（檢測FM4-64熒光）和綠光激發(fā)（檢測GFP熒光）條件下進(jìn)行Rab7-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位觀察。

1.2.7菌絲液泡形態(tài)觀察分別取野生型和Δ Rab7突變體菌絲，用 4μmol/L FM4-64染料染色，保濕孵育 30min 后用激光共聚焦顯微鏡觀察菌絲中液泡形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1Rab7蛋白親緣關(guān)系與結(jié)構(gòu)域分析

如表2所示，將果生炭疽菌與膠孢炭疽菌（Col-letotrichumgloeosporioides）、禾谷炭疽菌（Colletotri-chumgraminicola）稻瘟病菌（Pyriculariaoryzae）粗糙脈孢霉（Neurosporacrassa）禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）的Rab7蛋白的氨基酸序列一致度較高，與釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的Rab7蛋白的氨基酸序列一致度較低。如圖1所示，8個真菌的Rab7蛋白均包含小分子GTP酶特征性結(jié)構(gòu)域G1＼～G5、5個保守結(jié)構(gòu)域F1＼～F5以及C端膜定位信號序列，這些區(qū)域在不同真菌中也顯示出較高的序列一致性，表明Rab7蛋白在真菌進(jìn)化過程中具有高度保守性。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，果生炭疽菌Rab7蛋白與釀酒酵母 Ypt7 蛋白的氨基酸序列相差較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而與同屬真菌（膠孢炭疽菌、禾谷炭疽菌）Rab7蛋白的氨基酸序列高度相似，其中與膠孢炭疽菌Rab7蛋白的氨基酸序列完全一致。值得注意的是，稻瘟病菌能夠產(chǎn)生附著胞，其Rab7蛋白與果生炭疽菌的Rab7蛋白親緣關(guān)系較近；禾谷鐮刀菌、構(gòu)巢曲霉、粗糙脈胞菌均不能產(chǎn)生附著胞，其Rab7蛋白與果生炭疽菌的Rab7蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2果生炭疽菌Rab7基因敲除菌株與Rab7基因 回補(bǔ)菌株的驗證

本研究利用同源重組技術(shù)將Rab7基因替換為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（GEN）[16]。如圖2所示，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得4個轉(zhuǎn)化子，使用引物OF/OR進(jìn)行檢驗，僅1個轉(zhuǎn)化子未擴(kuò)增出Rab7 基因，將其命名為 Δ Rab7（圖2B）。進(jìn)一步使用引物UAF/UAR和DBF/DBR進(jìn)行驗證，確認(rèn) Δ Rab7為Rab7基因缺失突變體。隨后，將Rab7基因的回補(bǔ)載體導(dǎo)人△Rab7中，獲得回補(bǔ)菌株 ΔRab7/Rab7 。

上產(chǎn)生明顯的黑色素積累，而野生型N425和△Rab7/Rab7僅產(chǎn)生少量黑色素，表明 Rab7 基因負(fù)調(diào)控黑色素的合成。

2.5Rab7基因?qū)烤揖稚咦赢a(chǎn)量和附著胞的影響

如圖5所示， Rab7 基因的缺失造成果生炭疽菌分生孢子產(chǎn)量顯著下降， ΔRab7 分生孢子產(chǎn)量約為野生型N425、 Δ Rab7/Rab7的1/10，但△Rab7分生孢子的形態(tài)與野生型N425和 Δ Rab7/Rab7無顯著差異，表明Rab7基因調(diào)控果生炭疽菌分生孢子產(chǎn)量但不影響分生孢子的形態(tài)建成。

2.3Rab7基因?qū)烤揖鸂I養(yǎng)生長的影響 2.6Rab7基因?qū)烤揖虏⌒缘挠绊?/p>

如圖3所示， ΔRab7 在PDAY和MM培養(yǎng)基上的生長速率顯著低于野生型N425，其中MM培養(yǎng)基上△Rab7的菌落直徑僅為野生型N425的 1/3 。Δ Rab7氣生菌絲量明顯減少，該表型缺陷在Δ Rab7/Rab7中得到恢復(fù)。 H₂O₂ 脅迫試驗結(jié)果表明， ΔRab7 與野生型N425對氧化脅迫的敏感性無顯著差異。

2.4Rab7基因?qū)烤揖谏匦纬傻挠绊?/p>

如圖4所示，培養(yǎng) 7d，ΔRab7 在PDAY培養(yǎng)基

如圖6所示， Δ Rab7在百香果葉片上并沒有產(chǎn)生明顯病斑。而野生型N425、 Δ Rab7/Rab7均在葉片上產(chǎn)生典型病斑，表明Rab7是果生炭疽菌的重要致病因子。

2.7 果生炭疽菌Rab7蛋白亞細(xì)胞定位

如圖7所示，Rab7-GFP與FM4-64染料共定位于液泡膜。 Δ Rab7的液泡呈現(xiàn)碎片化分布，而Rab7基因回補(bǔ)菌株 Δ Rab7/Rab7的液泡完整，表明Rab7基因通過調(diào)控液泡融合維持正常液泡形態(tài)。

A：果生炭疽菌 Rab7基因的敲除策略，GEN為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，引物AF/AR、G418F/G41R、G18F/G418R、BF/BR、CF/CR、OF/OR、UAF/UAR、DBF/DBR序列見表1;B：果生炭疽菌Rab7基因敲除菌株和 Rab7 基因回補(bǔ)菌株的驗證，△Rab7為Rab7基因敲除菌株， Δ Rab7/Rab7為Rab7基因回補(bǔ)菌株，N425為野生型果生炭疽菌。

N425 △Rab7 △Rab7/Rab7 N425 △Rab7 △Rab7/Rab7 80[C 000 000 （%）率 7060504302010 B N425 △Rab7 A 菌株

A：各菌株在PDAY培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，虛線為菌落切割位置;B：各菌株在MM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； C：H₂0₂ 對各菌株營養(yǎng)生長的抑制率。△Rab7為Rab7基因敲除菌株， ΔRab7/Rab7 為Rab7基因回補(bǔ)菌株，N425為野生型果生炭疽菌。

真菌中。研究結(jié)果表明，與禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）Rab7相比，果生炭疽菌（Colletotrichumfructicola）Rab7與稻瘟病菌（Pyriculariaoryzae）Rab7的親緣關(guān)系更近。禾谷鐮刀菌和稻瘟病菌的Rab7蛋白均為其致病性必需因子[9-10]。果生炭疽菌和稻瘟病菌的Rab7基因不僅參與營養(yǎng)生長的調(diào)控，還參與黑色素合成的負(fù)調(diào)控[10]。Rab7基因缺失的禾谷鐮刀菌菌落生長速率降低，且其受到的生長抑制程度較果生炭疽菌和稻瘟病菌更為顯著，但是禾谷鐮刀菌中Rab7基因缺失并未對色素合成產(chǎn)生明顯影響[9]

3 討論與結(jié)論

Rab蛋白在真核生物中高度保守，特別是在絲狀

亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明，果生炭疽菌Rab7定位于液泡膜，與酵母、稻瘟病菌和禾谷鐮刀菌中的Rab7 同源蛋白定位一致[9，12，17-18]。在禾谷鐮刀菌中，F(xiàn)gRab7是液泡融合過程中的關(guān)鍵因子，F(xiàn)gRab7基因的缺失會導(dǎo)致液泡難以融合[9]。在構(gòu)巢曲霉和蘋果腐爛病菌中， Rab7 基因缺失也會導(dǎo)致液泡碎片化[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，果生炭疽菌 Δ Rab7突變體，同樣表現(xiàn)出液泡融合缺陷，證明Rab7基因的液泡調(diào)控功能在不同植物病原真菌中高度保守。

果生炭疽菌可以通過附著胞穿透宿主細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)侵入宿主細(xì)胞，也可通過葉片傷口侵入宿主細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)， ΔRab7 菌株無法在機(jī)械損傷的百香果葉片上形成病斑，這可能與 Δ Rab7菌株對宿主防御機(jī)制更加敏感有關(guān)，也可能與△Rab7菌株自身營養(yǎng)生長受限有關(guān)。植物通過產(chǎn)生超氧化物抵御病原菌的入侵[21-22]，受禾谷炭疽菌侵染時，玉米體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧[23]。 ΔRab7 菌株可能對宿主產(chǎn)生的活性氧更加敏感，從而造成致病力喪失。然而本研究中 H₂O₂ 對野生型N425和△Rab7菌株的抑制率無顯著差異，表明 ΔRab7 菌株致病性的喪失可能與宿主的其他防御機(jī)制相關(guān)。在本研究中，Rab7基因的缺失引起果生炭疽菌營養(yǎng)生長減慢，尤其是在營養(yǎng)貧乏的MM培養(yǎng)基中， ΔRab7 菌株的營養(yǎng)生長缺陷更加明顯，表明 Rab7 基因的缺失使菌株對外界營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力下降。 Δ Rab7菌株菌絲在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，可能無法利用宿主細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致致病力喪失。前人研究發(fā)現(xiàn)，Rab7基因的缺失造成病原菌致病性顯著下降，同時其營養(yǎng)生長也存在缺陷，表明致病性的減弱可能是由營養(yǎng)生長缺陷造成的[24-27]，該結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究首次揭示了果生炭疽菌Rab7蛋白在致病過程中的重要作用，為深入解析百香果果生炭疽菌的致病分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）