亞甲基藍(lán)-LED光動力法抑殺海洋弧菌研究

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，漁藥的使用量也日益增加，對養(yǎng)殖水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)造成了極大的壓力[1。為了減少漁藥的使用量，實(shí)現(xiàn)綠色健康養(yǎng)殖效果，新型環(huán)保高效的抗菌技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究日益引起水產(chǎn)研究者的關(guān)注。光動力法滅菌技術(shù)（Photodynamic technology，PDT）是使用特定波長的激發(fā)光照射光敏劑，使其被激發(fā)并產(chǎn)生高氧化活性的氧自由基或單線態(tài)氧，進(jìn)而通過氧化作用破壞細(xì)菌的磷脂、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，使膜系統(tǒng)變形或者使酶系統(tǒng)失活，從而殺滅細(xì)菌等微生物[2-3]PDT滅菌方法對多種常見的致病菌如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等均可有效殺滅，并且具有作用機(jī)制及療效明確、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，因此在醫(yī)療、食品、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用正與日俱增[4]。

亞甲基藍(lán)（methyleneblue，MB）是水產(chǎn)養(yǎng)殖的常用藥物之一，價格低廉，在國內(nèi)長期應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣譜抗真菌、驅(qū)蟲及藥浴消毒。而在光動力療法中，亞甲基藍(lán)也是廣泛使用的一種高效光敏劑，使用亞甲基藍(lán)為光敏劑的光動力處理法（MB-PDT）在念珠菌、葡萄球菌等細(xì)菌的抗菌實(shí)驗(yàn)中已顯示出確切的滅菌作用，因此MB-PDT法對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的致病菌也可能具有殺傷作用。當(dāng)前，隨著我國海水養(yǎng)殖業(yè)向集約化、規(guī)?；较虬l(fā)展，海洋弧菌引發(fā)的細(xì)菌性疾病日益頻發(fā)，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失[。因此本研究選取海洋弧菌為研究對象，以亞甲基藍(lán)為光敏劑，LED燈為光源，研究MB-PDT對海洋弧菌的殺滅作用。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

TY-19弧菌菌株（林茂老師課題組提供）、亞甲基藍(lán)（分析純）、TCBS瓊脂平板培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基（添加 1% 氯化鈉）、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

LED燈的光源使用單顆功率3W、中心波長 660nm 的LED燈珠，燈具支架由實(shí)驗(yàn)室自制，可以自由調(diào)節(jié)LED燈與樣品的距離。本實(shí)驗(yàn)所用的光敏劑亞甲基藍(lán)在 660nm 處具有較大吸收力，因此使用 660nm 的光源可以與光敏劑相匹配。此外還使用中心波長分別為560、600、 630nm 的單顆3WLED燈珠自制了幾種光源，以研究光源波長對光動力反應(yīng)的影響。

1.2實(shí)驗(yàn)過程

第一，TY-19弧菌的純化、擴(kuò)大培養(yǎng)和稀釋。

解凍、活化于冷藏室保藏的TY-19弧菌菌株，用一次性 接種環(huán)以劃線法接種于TCBS培養(yǎng)基，置于37 °C 恒溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng) 18h ；再將純化后生長的單菌落用接種環(huán)接種于 200mL LB液體培養(yǎng)基，置于37 C 搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18h 光動力 實(shí)驗(yàn)前用無菌水將菌液稀釋200倍，遮光貯存?zhèn)溆谩?/p>

第二，光動力殺菌實(shí)驗(yàn)。

取 200μL 稀釋200倍的TY-19弧菌菌液加入多孔細(xì)胞培養(yǎng)板各個孔中，加入適量亞甲基藍(lán)水溶液（空白組不添加亞甲基藍(lán)），將培養(yǎng)板置于LED燈下，LED燈珠與培養(yǎng)板的距離固定為 10cm ；開啟 660nm LED燈進(jìn)行光動力反應(yīng)，并在5、10、20min時分別取 20μL 菌液涂布TCBS平板；涂布后的平板于 30% 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h后，采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計各平板的菌落數(shù)，計算滅菌率。滅菌率計算公式為：

滅菌率=（ N₀-N_x ） /N₀×100%

公式中的N為空白組避光放置 0min 時的菌落數(shù)； N_x 為各個實(shí)驗(yàn)組不同時間的菌落數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1光照對滅菌效果的影響

實(shí)驗(yàn)組和對照組均加入稀釋菌液和 10.18μg/mI 的亞甲基藍(lán)，實(shí)驗(yàn)組開啟LED光源進(jìn)行光照滅菌實(shí)驗(yàn)，對照組避光放置；經(jīng)過一定時間后分別取樣、測量滅菌率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，避光黑暗環(huán)境中，亞甲基藍(lán)對TY-19弧菌也具有一定的殺滅作用，因?yàn)閬喖谆{(lán)本身就是水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的一種消毒殺菌劑，常用于水產(chǎn)動物藥浴以防治細(xì)菌性疾病，因此無光照時仍具有一定的滅菌作用。但亞甲基藍(lán)作為殺菌劑使用時，通常需要較高濃度（ gt;10μg/mL ）才能達(dá)到理想的殺菌效果，在濃度較低時其殺菌能力較弱，例如本實(shí)驗(yàn)中，濃度為 0.18μg/mL 的亞甲基藍(lán)在無光照時經(jīng)過20min的滅菌效率只能達(dá)到 151.5% 。而當(dāng)施加光照，激發(fā)光動力反應(yīng)后，可觀察到弧菌的菌落數(shù)迅速降低，殺菌效率明顯提升，20min時滅菌率達(dá)到 83.9% ，遠(yuǎn)超亞甲基藍(lán)無光照時的 20min 滅菌率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，光照可以使亞甲基藍(lán)產(chǎn)生光敏活化，激發(fā)光動力滅菌效應(yīng)，因此采用光動力法滅菌可以同時發(fā)揮亞甲基藍(lán)自身殺菌以及PDT殺菌的雙重作用，擁有比單獨(dú)使用亞甲基藍(lán)更強(qiáng)的滅菌效果。圖1結(jié)果還顯示，光照時長與光動力法滅菌效果呈正相關(guān)的關(guān)系，光照反應(yīng)時間越長，產(chǎn)生的具有殺菌能力的活性自由基越多，滅菌效果也越明顯。

2.2亞甲基藍(lán)濃度對光動力滅菌的影響

當(dāng)亞甲基藍(lán)濃度分別為0、0.18、0.36、 0.72μg/mL ，光動力滅菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光動力法滅菌效果和光敏劑亞甲基藍(lán)的濃度成正相關(guān)，亞甲基藍(lán)濃度越高，滅菌效果越明顯，滅菌速率也越高。如亞甲基藍(lán)濃度為 0.36μg/mL 時，5min時滅菌率為 47.7% ， 20min 滅菌率為 88.5% ；而當(dāng)亞甲基藍(lán)濃度提高至 0.72μg/mI 時，5min滅菌率即可達(dá)到 88.1% ， 20min 滅菌率達(dá) 96.8% 。光敏劑濃度提高時，光動力處理產(chǎn)生的活性自由基也相應(yīng)增加，因此可以有效地提高殺菌效率。實(shí)驗(yàn)組中亞甲基藍(lán)濃度在 0.18～0.72μg/mL ，遠(yuǎn)低于亞甲基藍(lán)單獨(dú)作為抗菌藥物時的使用濃度 （10μg/mL） ，但各濃度組均顯示出較高的滅菌活性，可見亞甲基藍(lán)-光動力處理法在短時間內(nèi)就可將TY-19弧菌抑制在極低水平，并且可大幅度降低亞甲基藍(lán)的使用濃度，有利于養(yǎng)殖水環(huán)境的保護(hù)工作。

2.3光照波長對光動力殺菌效果的影響

為研究光源波長對亞甲基藍(lán)-PDT的影響，設(shè)置亞甲基藍(lán)濃度固定為 0.18μg/mL ，分別使用560、600、630、 660nm 波長的LED燈進(jìn)行了PDT實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，560、600、630、 660nm 這4種不同波長的光均能激發(fā)亞甲基藍(lán)-PDT反應(yīng)活性，光照時長同樣為5min時， 660nm 光源的滅菌率為 33.5% ，明顯高于560、600、 630nm 光源的滅菌率，且反應(yīng) 10min 內(nèi)的滅菌速率更大，可見 660nm 波長的光具有更好的激發(fā)效果和滅菌性能。當(dāng)光照時長到達(dá)20min時，各個波長組的滅菌率較為接近，可見在光敏劑的有效吸收波長范圍內(nèi)，光源波長對最終滅菌率的影響較小，處理時間較長時均能發(fā)揮出較高的殺菌作用，因此亞甲基藍(lán)-光動力法在實(shí)際應(yīng)用中還可以根據(jù)實(shí)際情況的需要，在 550～700nm 范圍內(nèi)靈活地選擇適宜的光源波長。

PDT療法中，光源發(fā)出的光被光敏劑充分吸收時，才能有效激發(fā)光敏劑，從而發(fā)揮PDT的活性[10]。若光源與光敏劑不匹配，光敏劑不能吸收光源光線，則光敏劑無法成功激發(fā)，PDT反應(yīng)也無法進(jìn)行。普通的白熾燈、白光LED的光譜都較寬，因此在PDT實(shí)驗(yàn)時只有部分光譜可被利用，造成耗電增加，能量浪費(fèi)，而選用窄光譜的LED可以有效提高光利用率，降低能耗，減少溫升。亞甲基藍(lán)對可見光的吸收范圍為 550～700nm ，因此本實(shí)驗(yàn)選用的560、600、630、 660nm 等幾個波長的光均可被亞甲基藍(lán)吸收并成功激發(fā)PDT反應(yīng)。但亞甲基藍(lán)的最大吸收波長為 660nm ，因此660nm 光波具有最好的激發(fā)效果，滅菌率和滅菌速率均優(yōu)于其他波長的光。除此之外， 660nm 的光波在水體及動物體內(nèi)穿透力較高，對動物安全無害，在深水及動物體內(nèi)也能發(fā)揮作用，因此在亞甲基藍(lán)-PDT中使用 660nm LED作為激發(fā)光源，不僅可以有效激發(fā)亞甲基藍(lán)，使其發(fā)揮PDT殺菌活性，而且在深水區(qū)域、動物體內(nèi)也可以順利進(jìn)行PDT反應(yīng)，適合水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用。

結(jié)語

以亞甲基藍(lán)為光敏劑、 660nm 波長LED燈為光源、TY-19弧菌為試驗(yàn)菌種，進(jìn)行了亞甲基藍(lán)介導(dǎo)的LED光動力滅菌研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光動力法可以有效地殺滅海洋弧菌，亞甲基藍(lán)濃度 0.72ug/mL ，光照 20min 條件下滅菌率可達(dá) 96.8% ，提高光敏劑濃度、延長光照時間可以有效提高滅菌率； 660nm LED可以和亞甲基藍(lán)光敏劑較好匹配，具有更高的PDT滅菌速率，適合作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中光動力滅菌法的光源。

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收稿日期：2025-04-15

作者簡介：卜凡（2002—），男，漢族，本科。研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。

*通訊作者：黃利強(qiáng)（1975一），男，漢族，博士，講師。研究方向：漁業(yè)水質(zhì)監(jiān)控與管理。