不同光質(zhì)處理下糙皮側(cè)耳qRT-PCR內(nèi)參基因的優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)： S646.1⁺41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）06-035-09

Optimization of reference genes for qRT-PCR of Pleurotus ostreatus under different lighting treatments

HUMengdan， ZHUMengke， ZHANG Peng， GAO Yuqian，QIULiyou，LI Yanan （CollgeofLifeiensHennAgicturalUesitKeyboratyofrictualcbalEeEngengstfA ricultureandRuralAffairs，Zhengzhou45oo46，Henan，China）

Abstract：To identify suitable reference genes for analyzing the specific gene expressonof Pleurotus ostreatus under differentlightingtreatments，themyceliumof P. ostreatuswasused asthematerial，and12 geneswere screened fromthe transcriptome data of mycelium under different lighting treatments as candidate reference genes forqRT-PCRof P. ostreatus，and their expression abundanceand expresionstabilitywereevaluated.Theresults indicatedthatthe primersof12 candidatereference genes had goodspecificity inqPCR，with single peaks in the meltingcurve，andthe CTvalues of the genes were between18and26，demonstrating good gene expressionabundance.Theexpression stabilityanalysisof geNorm，NormFinderand BestKeepershowedthatthe expressionstabilityofeukaryotic translationinitiation factorl encodinggene（eIF1），ubiquitin-conjugating enzyme encoding gene（UBC），40S ribosomal protein encoding gene（40SRP）and actinl encoding gene（Actin1）were atthe forefrontin thethree analyses.The expression abundanceof these four genes underdifferent lighting treatments from high to lowwas UBC，eIF1，Actinland 40SRP.eIF1and UBCcanbeused as the best reference gene combinationatthe high abundance expresion levelof target genes.40SRPandActinlcanbeused as the best reference gene combination at medium and low abundance expression levels of target genes.

Keywords：Pleurotus ostreatus;Reference gene;Lighting treatment; qRT-PCR

食用菌在栽培過(guò)程中需要適宜的光照1，不同品種的食用菌對(duì)光照具有不同的要求和響應(yīng)[2-]。研究發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，杏鮑菇原基可以形成，但難以進(jìn)一步分化成具有正常結(jié)構(gòu)的子實(shí)體；而在紅光和藍(lán)光條件下，原基能夠正常分化，且在藍(lán)光下分化的速度快，數(shù)量比紅光下多。在藍(lán)光下，與光調(diào)控相關(guān)的脫氧核糖二嘧啶光解酶基因PHR表達(dá)量顯著上調(diào)3。Kim等研究表明，藍(lán)光對(duì)香菇菌蓋和菌柄的發(fā)育有顯著影響，對(duì)其分析發(fā)現(xiàn)碳水化合物活性酶編碼基因和部分轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，為進(jìn)一步解析光照對(duì)其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。糙皮側(cè)耳（Pleurotusostreatus），又名平菇，是我國(guó)栽培量最大、栽培范圍最廣的食用菌之一[7，因其具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用特性而著名。在糙皮側(cè)耳的生長(zhǎng)中，其對(duì)光照的需求主要體現(xiàn)在原基分化時(shí)期和子實(shí)體形成及發(fā)育時(shí)期。目前通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同程度的光照對(duì)糙皮側(cè)耳菌絲培養(yǎng)時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育也會(huì)產(chǎn)生不同的影響。分析不同光照條件下生長(zhǎng)發(fā)育和調(diào)控中相關(guān)基因的表達(dá)差異，是解析其光調(diào)控機(jī)制的重要研究途徑。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是研究基因表達(dá)差異的主要方法。該方法具有微量、高效、快速得到結(jié)果的特點(diǎn)。qRT-PCR計(jì)算基因表達(dá)量時(shí)通常采用 2^-ΔΔCt 的方法，該方法基于CT（cyclethresh-old）值，即反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)達(dá)到閾值以上的最小循環(huán)數(shù)，通過(guò)計(jì)算目標(biāo)基因與其內(nèi)參基因之間的 CT 值差異，進(jìn)而轉(zhuǎn)換為表達(dá)量的對(duì)數(shù)比值，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平變化的相對(duì)定量。內(nèi)參基因用于校正組內(nèi)和組間由于樣本處理、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量效率等可能存在的試驗(yàn)誤差，對(duì)其進(jìn)行歸一化處理，確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[]。因此，內(nèi)參基因的選擇在分析基因表達(dá)差異的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，不合適的內(nèi)參基因的使用會(huì)導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)水平和表達(dá)趨勢(shì)的誤判。通常，選擇在不同組織和不同處理?xiàng)l件下表達(dá)量穩(wěn)定且相對(duì)較高的管家基因作為內(nèi)參基因[l-12]。管家基因中 β. -肌動(dòng)蛋白（ β. -actin）、 β. 微管蛋白（ β -tublin）、甘油醛-3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase）編碼基因作為常用的內(nèi)參基因[13]。但是在特定處理?xiàng)l件下，一些常規(guī)管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性可能也會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致其不再適合作為特定研究的內(nèi)參基因。此時(shí)，需要通過(guò)分析對(duì)比通用管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性，以篩選出更合適的內(nèi)參基因。

目前可用于分析基因表達(dá)水平穩(wěn)定性的軟件有g(shù)eNorm[14]、NormFinder[15]、BestKeeper[1等。Ge-Norm軟件可以篩選出兩個(gè)及兩個(gè)以上較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，通過(guò)程序運(yùn)算，計(jì)算各個(gè)基因的 M 值， M 值越低，其作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高；反之越低[4]。NormFinder可用來(lái)篩選1個(gè)基因作為最優(yōu)內(nèi)參基因，通過(guò)程序計(jì)算出 S 值， s 值越低，表明該基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高；反之越低[5]。BestKeeper通過(guò)程序計(jì)算出每個(gè)基因相應(yīng)的變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差，變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差低的基因適合作為內(nèi)參基因。通常情況下，可通過(guò)這3個(gè)軟件的綜合評(píng)價(jià)分析，篩選出最優(yōu)內(nèi)參基因。

真核翻譯起始因子編碼基因eIF在日本桉 （Eu. onymusjaponicus）[7]、秋葵（AbelmoschusesculentusL.）[8]、魔芋（AmorphophallusKonjac）[]等植物中被廣泛用作內(nèi)參基因，但在食用菌中使用此基因作為內(nèi)參基因的報(bào)道較少。Yang等[2研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌中新型內(nèi)參基因RNB、V-ATP和VAMP比傳統(tǒng)內(nèi)參基因ACTB、β-TUB和GAPDH更為穩(wěn)定。王文沛等[2]發(fā)現(xiàn)在草菇（Volvariellavolvacea）常用菌株和繼代退化菌株中最佳參考基因組合為SPRYp和α -TUB，但Tao等[22發(fā)現(xiàn)，SPRYp、Ras和Vps26在草菇中表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。VSN、CYP、Ctsyn、UBC、40SRP和60SRP在生物脅迫下篩選內(nèi)參基因中也有較多報(bào)道[23-24]，但在食用菌中使用頻率較低。在糙皮側(cè)耳中，VSN和Rbp在不同氮源處理下比Ac-tin1更適合作為內(nèi)參基因，但在熱脅迫條件下，Actin1成為最佳選擇[25]。不同光照條件下內(nèi)參基因的篩選報(bào)道較少，在植物刺葡萄（VitisdavidiiFoex.）愈傷組織中，不同光條件下最適內(nèi)參基因?yàn)?0SRP和TUB2，目前并未發(fā)現(xiàn)在食用菌中不同光質(zhì)處理的內(nèi)參基因的報(bào)道。筆者初步對(duì)這些基因在不同光照下糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)錄組中的本底FPKM值進(jìn)行分析，篩選出了12個(gè)候選內(nèi)參基因，并進(jìn)一步對(duì)其表達(dá)豐度和表達(dá)穩(wěn)定性充分對(duì)比分析，以期能夠?yàn)椴煌赓|(zhì)處理下qRT-PCR的規(guī)范和數(shù)據(jù)處理的保真性提供支撐，為研究糙皮側(cè)耳的基因表達(dá)水平和光調(diào)控機(jī)制提供保障。

1材料與方法

試驗(yàn)于2024年4一8月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院力行樓進(jìn)行。

1.1供試菌株及培養(yǎng)基

糙皮側(cè)耳X831由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌課題組保存；麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮 20g 蛋白豚 2.0g? 酵母粉 2.0g.MgSO₄?7H₂O0.5g.KH₂PO₄0.46g.K₂HPO₄ 1.0g? 瓊脂粉 20g. 加去離子水補(bǔ)足至 1000mL ，分裝后使用滅菌鍋于 121^°C 高壓滅菌 30min 0

1.2 不同光質(zhì)處理

將活化后的菌種接種于麩皮固體培養(yǎng)基中，25°C 恒溫黑暗培養(yǎng)。在培養(yǎng)2d后，每天對(duì)菌絲分別進(jìn)行紅光、藍(lán)光、白光 2h 光照處理（約 1000lx ，共處理6d），以黑暗培養(yǎng)的菌絲作為對(duì)照，培養(yǎng)7d后收集菌絲并于液氮中速凍，置于 -80^°C 冰箱備用。

1.3總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用TRIeasyTM Total RNA Extraction Reagent（購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司）提取已保存菌絲的總RNA，具體按照說(shuō)明書(shū)操作。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性和濃度。使用 4×gDNA wiper Mix、 5× HiScript IIIqRTSuperMix（購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA片段，保存于 -20°C 備用。

1.4候選內(nèi)參基因的篩選、引物設(shè)計(jì)與基因克隆

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[17-26]，使用NCBIblast比對(duì)分析，在糙皮側(cè)耳中初步選擇了20個(gè)內(nèi)參基因，對(duì)其在不同光質(zhì)下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步篩查，以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中平均FPKM值 gt;100 以及 MFC?2 （最大值與最小值的比值）2作為參考依據(jù)，初步篩選出進(jìn)一步重點(diǎn)關(guān)注的候選內(nèi)參基因。查找候選內(nèi)參基因的編碼序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，并對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。引物由生工（上海）生物工程有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 100～200bp 。

1.5熒光定量引物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和擴(kuò)增效率分析

qRT-PCR反應(yīng)體系為 20μL 。使用定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，運(yùn)行過(guò)程中通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析引物特異性。在熒光定量PCR引物的外側(cè)設(shè)計(jì)引物并通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲取模板核酸片段的標(biāo)準(zhǔn)品，凝膠回收后測(cè)定其核酸濃度 （ρ）（100ng?μL^-1 左右），將模板標(biāo)準(zhǔn)品按照梯度稀釋 （10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4） ，并分別進(jìn)一步進(jìn)行熒光定量PCR，記錄各稀釋濃度下對(duì)應(yīng)的 CT 值，用于分析引物擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和擴(kuò)增效率。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以基因的 CT 值為縱坐標(biāo)，計(jì)算分析各基因的斜率 k 和回歸系數(shù) R² ，通過(guò)E=10^-1/k-1 計(jì)算出各內(nèi)參引物的擴(kuò)增效率[]。

1.6不同候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

以不同光質(zhì)處理的糙皮側(cè)耳的cDNA為模板，采用1.5中確認(rèn)過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和擴(kuò)增效率正常的熒光定量引物進(jìn)行qRT-PCR，記錄其CT值，用于后續(xù)對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的篩選。將不同光質(zhì)處理下各候選內(nèi)參基因的CT值通過(guò)geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行分析，以反映基因表達(dá)的穩(wěn)定性，具體參照Vandesompele等[14]、An-dersen等[]和Michael等[的方法。最終，對(duì)不同軟件中的穩(wěn)定性排名進(jìn)行綜合評(píng)估[2，以確定最合適的內(nèi)參基因。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2016記錄整理數(shù)據(jù)；采用SPSS對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Prism10對(duì)試驗(yàn)分析結(jié)果繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因的篩選

通過(guò)查閱文獻(xiàn)初步選擇20個(gè)內(nèi)參基因，基于糙皮側(cè)耳在不同光質(zhì)處理下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)反映基因表達(dá)豐度的FPKM值進(jìn)行匯總分析。在前期試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)FPKM值低于100時(shí)，其qPCR結(jié)果顯示的CT值大于26，此時(shí)CT值相對(duì)過(guò)大，不再適合作為內(nèi)參基因。結(jié)果分析顯示（表1），絲狀真菌中的新型內(nèi)參基因SPRYp、RNB、V-ATP、VAMP的平均FPKM值低于100，其中RNB和VAMP在某些處理下幾乎不表達(dá)，V-ATP在不同光質(zhì)處理下存在超過(guò)2倍的表達(dá)差異。此外，不同氮源下篩選到的糙皮側(cè)耳最優(yōu)內(nèi)參基因?yàn)镽bp和VSN，但在本研究中， Rbp 的平均FPKM值小于100，不再適合作為常規(guī)表達(dá)量的內(nèi)參基因。同時(shí)，Ctsyn和Actin3的平均FPKM值也低于100，而Cyp的平均FPKM值高于5000，也不適合作為常規(guī)表達(dá)量的內(nèi)參基因。當(dāng) MFC?2 時(shí)，基因處于嚴(yán)格穩(wěn)定狀態(tài)， MFCgt;2 的基因不適合作為內(nèi)參基因。最后通過(guò)篩查獲得了12個(gè)候選內(nèi)參基因，分別為Vps26、Ras、eIF1、eIF5A、Actinl、Actin2、GAPDH、TUB、UBC、VSN、60SRP、40SRP。

2.2 RNA質(zhì)量和引物特異性檢測(cè)

將提取后的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，均具有明亮的18S和28S條帶，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)其 A_260/280 在 1.8～2.1 之間， A_260/230 在 2.0～2.4 之間，說(shuō)明提取的總RNA完整性較好。實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線(xiàn)呈單一峰（圖1），說(shuō)明引物特異性較好。as、40SRP、Vps26、VSN、對(duì)12個(gè)基因繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率處于 91%～116% 之間，回歸系數(shù)處于0.990 8～0.999 5 之間（表2）。結(jié)果顯示，引物擴(kuò)增效率符合后續(xù)分析的要求。

表2不同候選內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和擴(kuò)增效率分析

2.3 候選內(nèi)參基因CT值分析

對(duì)不同光質(zhì)處理下12個(gè)候選內(nèi)參基因的CT值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)12個(gè)內(nèi)參基因的CT值均處于18＼～26之間，其中基因表達(dá)豐度較高的為UBC、eIF1、eIF5A、TUB；基因表達(dá)豐度為中等水平的是Actin1、40SRP、60SRP；基因表達(dá)豐度較低的是Actin2、Ras、GAPDH、Vps26和VSN。同一基因在不同處理中的CT值波動(dòng)幅度可反映其表達(dá)穩(wěn)定性，波動(dòng)值越小，基因穩(wěn)定性越高。候選內(nèi)參基因中穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因?yàn)镽as、40SRP、eIF1、GAPDH；穩(wěn)定性中等的為Vps26、VSN、Actin1、UBC、60SRP；穩(wěn)定性較差的為eIF5A、Actin2、TUB（圖2）。對(duì)這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)一步利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行定量分析。

2.4候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.4.1geNorm分析通過(guò)geNorm分析不同光質(zhì)處理下候選內(nèi)參基因的 CT 值，獲得候選內(nèi)參基因的 M 值。 M 值越大，表明該基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越低；M值越小，穩(wěn)定性越高；當(dāng) M 值 gt;1.5 時(shí)，不適宜作為內(nèi)參基因。分析12個(gè)候選內(nèi)參基因數(shù)據(jù)，通過(guò) M 值對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行比較（圖3），發(fā)現(xiàn) M 值均小于1.5，其中UBC和60SRP的 M 值最小，Ac-tin1和eIF1次之，這些基因表達(dá)穩(wěn)定性較高，TUB和Actin2表達(dá)穩(wěn)定性較差。

2.4.2NormFinder分析通過(guò)NormFinder分析不同光質(zhì)處理下候選內(nèi)參基因的 CT 值，獲得候選內(nèi)參基因的 s 值。 s 值越大，表明該基因作為內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越低， S 值越??；其作為內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高。分析結(jié)果得到候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排名如圖4所示，eIF1的 s 值最低，穩(wěn)定性最強(qiáng)，UBC、Actin1和40SRP次之。此排名順序與geNorm的結(jié)果有所差異。

2.4.3BestKeeper分析通過(guò)BestKeeper分析不同光質(zhì)處理下候選內(nèi)參基因的 CT 值，獲得候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù) （CV） 。 CV 和SD越大，說(shuō)明穩(wěn)定性越弱，反之穩(wěn)定性越強(qiáng)。當(dāng)SDgt;1 時(shí)，基因的穩(wěn)定性較差，不宜作為內(nèi)參基因。如表3所示，試驗(yàn)中所選的12個(gè)基因 SD 均小于1，其中 SD 相對(duì)小的為Ras、40SRP、Vps26和VSN;CV 較低的基因?yàn)镽as、40SRP、Vps26、VSN。對(duì)這2項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行排序，并通過(guò)幾何平均數(shù)法得出Best-Keeper分析中各基因的穩(wěn)定性排名，結(jié)果顯示，排名靠前的候選內(nèi)參基因是Ras、40SRP、Vps26、VSN、GAPDH、eIF1和Actin1。

2.4.4候選內(nèi)參基因的綜合性分析通過(guò)幾何平均數(shù)法對(duì)3種軟件的分析結(jié)果進(jìn)行綜合排序（圖5），發(fā)現(xiàn)geNorm、NormFinder和BestKeeper分析后的優(yōu)勢(shì)內(nèi)參基因排名有所差異，geNorm和NormFinder分析排名較為一致。結(jié)果表明，綜合排名較靠前的基因?yàn)閑IF1、UBC、40SRP和Actin1，適合作為不同光質(zhì)處理下的內(nèi)參基因。TUB和Actin2整體排名較靠后，不適合作為不同光質(zhì)處理下的內(nèi)參基因。

2.4.5候選內(nèi)參基因兩兩變異性分析多項(xiàng)研究表明，僅使用一個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行靶基因表達(dá)量分析是不充分的，通常要2個(gè)及以上的內(nèi)參基因?qū)Π谢虻谋磉_(dá)量進(jìn)行分析更為準(zhǔn)確。通過(guò)geNorm對(duì)12個(gè)候選基因進(jìn)行兩兩變異分析（圖6），以確定適合不同光質(zhì)處理下參考基因的數(shù)量，當(dāng) V_n/n+1lt;0.15 時(shí)，認(rèn)為適合該條件下的參考基因數(shù)量為 n 個(gè)。在不同光質(zhì)處理下V_2/3lt;0.15 ，意味著最適參考基因數(shù)量為2個(gè)。綜合考慮上述對(duì)基因表達(dá)豐度和表達(dá)穩(wěn)定性的分析結(jié)果，當(dāng)靶標(biāo)基因的表達(dá)量處于高水平時(shí)， eIFI 和UBC可以作為最佳內(nèi)參基因組合；對(duì)于中度和低表達(dá)水平的靶標(biāo)基因，40SRP與Actin1可作為理想的內(nèi)參基因組合。

3 討論與結(jié)論

內(nèi)參基因的選擇對(duì)基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行基因表達(dá)量分析之前，必須對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行綜合評(píng)估，以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[23-24]。并非所有傳統(tǒng)內(nèi)參基因均適用于作為不同條件下的參照標(biāo)準(zhǔn)，這一現(xiàn)象可能歸因于不同物種之間以及不同處理方式下的生物學(xué)差異[3]。因此，精心挑選一個(gè)適宜的傳統(tǒng)型內(nèi)參基因?qū)υ囼?yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。由于不同光質(zhì)處理下內(nèi)參基因的選擇未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道，在本研究中，筆者對(duì)糙皮側(cè)耳中內(nèi)參基因的選擇進(jìn)行了深入分析，旨在評(píng)估不同光質(zhì)處理下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。在絲狀真菌中，傳統(tǒng)的內(nèi)參基因如β-ACT、β-TUB和GAPDH常被用于qRT-PCR試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)化分析，但是Yang等2的研究中報(bào)道了3個(gè)新的內(nèi)參基因RNB、V-ATP和VAMP在絲狀真菌穩(wěn)定性評(píng)估中表現(xiàn)出比傳統(tǒng)內(nèi)參基因更高的穩(wěn)定性。筆者的研究結(jié)果表明，這些新型候選內(nèi)參基因RNB、V-ATP和VAMP在不同光質(zhì)處理下的糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)量低且在不同處理組中相對(duì)不穩(wěn)定，不再適合作為內(nèi)參基因。

筆者通過(guò)基因熒光定量PCR獲得CT值，并通過(guò)geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件對(duì)12個(gè)候選內(nèi)參基因在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)在不同光質(zhì)處理下，常規(guī)內(nèi)參基因Actin2和TUB不再適合作為糙皮側(cè)耳中的內(nèi)參基因，這一發(fā)現(xiàn)與Trichodermaatroviride中Actin在光照條件下表達(dá)不穩(wěn)定的研究結(jié)果一致2。在草菇中，Actin不適合作為內(nèi)參基因，而在熱脅迫下糙皮側(cè)耳中，Actin可作為最佳內(nèi)參基因[28]。此外，在橡膠靈芝菌[2]、天藍(lán)苜蓿[3中，TUB不適合作為內(nèi)參基因。而在茯苓[中， a-TUB 適合作為不同組織中的內(nèi)參基因。這些結(jié)果顯示，不同的生物學(xué)背景，不同的處理?xiàng)l件，常規(guī)內(nèi)參基因的適用性也會(huì)發(fā)生改變。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同光質(zhì)處理下糙皮側(cè)耳的eIF1、UBC、40SRP和Actin1基因表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性，適合作為最優(yōu)內(nèi)參基因的選擇。其中，有關(guān)eIF1的這一結(jié)論與積雪草[32]、廣藿香[33]、青錢(qián)柳[34]、魔芋[19]和黑麥草[35]等植物中 eIF 基因的高穩(wěn)定性相一致，表明這些植物中eIF基因在不同條件下均能保持相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平。然而，在斑地錦[3]、桑果[37]和樟葉越橘[38]中， eIF 基因則不適合作為內(nèi)參基因，因?yàn)檫@些植物在特定條件下eIF基因的表達(dá)穩(wěn)定性不足。在植物中，真核翻譯起始因子eIF作為內(nèi)參基因的應(yīng)用較為廣泛，但在食用菌中鮮有報(bào)道。同樣，40SRP和UBC在食用菌中的研究也較為有限。這些新型內(nèi)參基因的鑒定為食用菌內(nèi)參基因的選擇提供了新的參考依據(jù)。

在選擇內(nèi)參基因時(shí)，除了考慮其表達(dá)穩(wěn)定性外，還要考慮其表達(dá)量的平均值大小，要與目標(biāo)基因相匹配。Yang等[2對(duì)內(nèi)參基因選擇時(shí)將其歸為適用于不同表達(dá)水平靶標(biāo)基因的內(nèi)參基因。在本研究中，綜合考慮基因表達(dá)豐度和表達(dá)穩(wěn)定性，當(dāng)靶標(biāo)基因的表達(dá)量處于高水平時(shí)，eIF1和UBC可以作為最佳內(nèi)參基因組合；對(duì)于中度和低表達(dá)水平的靶標(biāo)基因，40SRP與Actin1的組合可作為理想的內(nèi)參基因組合。這種劃分可以使不同表達(dá)豐度的基因表達(dá)水平的計(jì)算更加科學(xué)。

綜上所述，真核翻譯起始因子編碼基因（eIF1）、泛素結(jié)合酶編碼基因（UBC）、40S核糖體蛋白編碼基因（40SRP）和肌動(dòng)蛋白編碼基因（ActinI）在geNorm、NormFinder和BestKeeper3種分析方法中的表達(dá)穩(wěn)定性均位于前列，其中eIF1和UBC可以作為靶標(biāo)基因高豐度表達(dá)水平下的最佳內(nèi)參基因組合，40SRP和Actin1可作為靶標(biāo)基因中、低豐度表達(dá)水平下的最佳內(nèi)參基因組合。研究結(jié)果為不同光質(zhì)處理下qRT-PCR的規(guī)范性和數(shù)據(jù)處理的保真性奠定了基礎(chǔ)。

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