甘草根系解磷DSE菌株的分離、鑒定及其解磷特性

甘草（Glycyrrhiza glabralL.）是豆科甘草屬多年生草本植物，又名甜草根、粉草或蜜草，其味甘性平，屬于補益類中草藥。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等作用，是臨床上常用的中藥之一[1]。甘草中分離出的三萜類、黃酮類及多糖類活性化合物已被證實具有保肝、抗病毒、抗炎、抗癌等多種生物學(xué)作用[2-4]。除了具有藥用價值外，甘草提取物也被廣泛地應(yīng)用于化工、食品等領(lǐng)域。

甘草產(chǎn)區(qū)主要分布在陜西、甘肅、寧夏等西北干旱半干旱地區(qū)，該地區(qū)土地貧瘠，土壤中磷元素多以難溶性磷形式存在，供甘草直接吸收和利用的可溶性磷很少[5-6]。磷是甘草生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，也是甘草主要藥用成分甘草酸、甘草苷和甘草黃酮等合成與積累的重要元素[7]，土壤磷狀況直接關(guān)系到甘草的品質(zhì)與產(chǎn)量。目前，施用磷肥是解決土壤有效磷不足的最常用的措施之一，但是施加的磷肥不能完全被作物利用，磷肥中的有效磷很容易被土壤中的 Ca²⁺ 、 Fe³⁺ ） Al³⁺ 等金屬離子固定形成不能被作物直接利用的難溶性磷酸鹽，這些磷肥也可能會隨著水土流失進入水環(huán)境，進而造成水體富營養(yǎng)化。除此之外，化肥的長期使用容易造成土壤板結(jié)和生態(tài)環(huán)境破壞[8-9]。另一方面，中國磷礦資源并不豐富，開發(fā)強度高，據(jù)估計2050年后磷礦或?qū)⒊蔀橹袊木o缺資源[10]。解磷微生物具有溶解無機磷或礦化有機磷的能力，從而可以將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可直接吸收利用的形態(tài)[11]。因此，在土壤中可溶性磷濃度低但潛在磷源相對豐富的情況下，從植物根系分離得到解磷微生物，充分利用土壤中潛在磷資源，對緩解土壤磷資源短缺和實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有深遠意義。

深色有隔內(nèi)生真菌（Darkseptateendophytes，DSE）是一類種類組成和生態(tài)學(xué)功能多樣、定殖于植物根內(nèi)、不產(chǎn)孢或產(chǎn)無性孢子的子囊菌或半知菌[12]，其主要特征是深色菌絲和明顯的橫膈膜，在植物根系中可觀察到有隔菌絲或微菌核結(jié)構(gòu)[13]。DSE分布廣泛，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能，能夠改善宿主的營養(yǎng)狀況、增強宿主的抗逆能力（包括重金屬、鹽堿、干旱、病、澇和寒等）和提高植物群落的穩(wěn)定性等[14-15]。DSE 還能產(chǎn)生纖維素酶、酸性磷酸酶、植酸酶等多種酶類，或者通過代謝產(chǎn)生釋放有機酸和質(zhì)子到真菌體外環(huán)境中，將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可直接吸收的可溶性磷，從而提高宿主植物對土壤中磷素的利用率[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，DSE 菌株對難溶性磷有較好的解磷效果。Spagnoletti等[18]的研究表明，從小麥（Triticumaestiuum）根系中分離得到的DSE（Alternariaalternata）能夠?qū)⒘姿徕}、磷酸鋁和磷酸鐵等難溶性無機磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷。Luo等[19]從藍莓（Vaccinium uliginosum L.）根系中分離得到的DSE菌株P(guān)eziculaericae對磷酸鈣的溶磷量達到 413.68mg/L 。Monica等[20]的研究則證實，DSE對有機磷具有較強的礦化能力。研究發(fā)現(xiàn)，解磷微生物的解磷能力與生長狀況有一定的相關(guān)性。Jiang等[21]發(fā)現(xiàn)從板栗（Casta-neamollissima）和錐栗（C.henryi）根系分離的5株共生真菌對植酸鈣的溶解率與其菌絲干質(zhì)量、菌落直徑呈顯著正相關(guān)，發(fā)酵液pH與溶磷率呈極顯著負(fù)相關(guān)。另外，通過比較DSE在不同磷源下的生物量能一定程度上反映其對不同形態(tài)磷素的利用能力[22]。因此，DSE在不同磷源下的生長特征和解磷活性是后續(xù)進行菌種篩選及應(yīng)用的重要指標(biāo)。

甘草根系中廣泛存在著DSE 的定殖[23]，然而目前甘草根系具備解磷能力的DSE種質(zhì)資源的發(fā)掘和研究尚未開展。本研究以野生甘草為材料，從甘草根系中分離出具備解磷能力的DSE，并研究其解磷特性，為利用DSE提高甘草磷營養(yǎng)和提升甘草品質(zhì)提供理論依據(jù)，也為開發(fā)利用DSE菌種資源并將其應(yīng)用于藥用植物生態(tài)種植與品質(zhì)提升提供理論支持。

1材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

麥芽浸膏培養(yǎng)基（MEA）：麥芽浸粉 30g/L 大豆蛋白膚 3.0g/L ，瓊脂 15g/L 0蒙金娜培養(yǎng)基（PVK）：葡萄糖 10.0g/L ，硫酸銨 0.5g/L ，氯化鈉 0.3g/L ，硫酸鎂 0.3g/L 硫酸錳 0. 03g/L ，硫酸鉀 0. 03g/L ，硫酸亞鐵0.03g/L ，瓊脂 15g/L，pH7.0～7.5. 0磷源：有機難溶性磷（卵磷脂， 5g/L） ，無機難溶性磷（磷酸鈣， 5g/L） ，可溶性磷（磷酸二氫鉀，5g/L） 。

1.2甘草根系解磷DSE菌株的分離

從內(nèi)蒙古赤峰地區(qū) （ 42° 15^′ 23 ： 50^′′ΔN 118^°52^′58.14^′′E） 采集甘草（ G ：glabra）根系樣品，將根系表面進行消毒后，用無菌刀片切成 2～ 3mm 根段，垂直置于含 0.5% 的卵磷脂或磷酸鈣的PVK固體培養(yǎng)基上，每皿 10～15 個根段，然后將培養(yǎng)皿用封口膜封口， 25°C 培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每天觀察，待剛有深色菌絲長出時，小心挑取少量菌絲接種到MEA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。純化后的菌株轉(zhuǎn)接新鮮的MEA固體培養(yǎng)基中， 4^°C 保存。

1.3DSE的形態(tài)特征及分子鑒定

依據(jù)《真菌鑒定手冊》對DSE菌株的菌落形態(tài)、培養(yǎng)基顏色變化以及菌絲體和孢子的形態(tài)特征進行鑒定。

從新鮮菌落上挑取DSE菌絲體，使用艾科瑞公司通用基因組DNA提取試劑盒（AG21009）提取DSE的基因組DNA，對基因組DNA進行PCR擴增，擴增和測序所用的引物ITS1與ITS4（ITS1： 5^′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG- ?3^′ ，ITS4： 5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3^′ ）。PCR的反應(yīng)體系為 20μL ，包括 2，0μL DNA模板， 10μL2×Taq Master Mix，1. 0μL 上引物，1. 0μL 下引物， 6. 0μL ddH₂O 。PCR條件：95°C 預(yù)變性 4min;94°C 變性 30s，54^°C 引物退火 1min，72^°C 延伸 1min，37 個循環(huán);最后 72°C 延伸 10min 。對PCR產(chǎn)物進行純化后，由生工生物工程（上海）公司進行測序。得到的測序結(jié)果在GenBank（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov）中進行Blast比對分析，最后用MEGA（version11.0，MegaLimited，Auckland，New Zealand）進行發(fā)育分析和構(gòu)建最大似然樹，自展值為 1 000 。

1.4DSE的回接宿主與再分離試驗

將分離得到的DSE菌株通過盆栽試驗重新接種到甘草幼苗根系，回接試驗步驟如下：用70% 乙醇進行對甘草種子進行表面消毒 1min 再用 0.1%HgCl₂ 浸泡 7min 。將消毒后的種子用無菌水沖洗干凈，最后在 28^°C 下催芽。待種子萌發(fā)形成幼苗時，挑選生長一致的幼苗備用。將幼苗移植到裝有滅菌河沙 （1000g） 的已消毒塑料盆中。將4個直徑 5mm 的DSE菌餅放置在甘草幼苗的根系周圍。將所有的幼苗置于 14h/ ^10h （光照/黑暗），溫度 27°C/22°C （日/夜）和相對濕度 60% 的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 90d 。90d后將甘草幼苗從培養(yǎng)盆中取出，用蒸餾水沖洗根系，并于光學(xué)顯微鏡下鏡檢觀察根系中DSE的定殖情況。

1.5 不同磷源下DSE生長曲線的測定

用無菌打孔器（ d=5mm 在生長旺盛的DSE的菌落邊緣打取菌餅，將菌餅分別接種到以磷酸二氫鉀、卵磷脂和磷酸鈣為磷源的PVK固體平板上， 28^°C 暗培養(yǎng)，每隔 24h 使用十字交叉法測量DSE的菌落直徑 （d） ，連續(xù)測量10d，繪制成為曲線。每種處理重復(fù)3次。

1.6不同磷源下DSE生物量的測定

用無菌打孔器 （d=5mm ）在生長旺盛的DSE的菌落邊緣打取菌餅，分別接種到以磷酸二氫鉀、卵磷脂和磷酸鈣為磷源的PVK液體培養(yǎng)基中，每個處理接種一個菌餅，以不接菌的PVK液體培養(yǎng)基為對照（CK），在 條件下震蕩培養(yǎng) 10d 。培養(yǎng)完成后，用定性濾紙過濾培養(yǎng)液收集菌絲，將菌絲體置于 60^°C 烘干至恒質(zhì)量，并用萬分之一天平測定菌絲干重。每種處理重復(fù)3次。

1.7難溶性磷源下DSE發(fā)酵液中可溶磷含量及 pH 的測定

取“1.6\"中各DSE菌株和對照組培養(yǎng)10d后的發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心 20min（4Λ°C，10 000 r/min） 取上清液，使用鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液中可溶性磷濃度，用精密 pH 計測量發(fā)酵液 pH 。每種處理重復(fù)3次。

1.8難溶性磷源下DSE發(fā)酵液中磷酸酶活性的測定

取“1.6”中各DSE菌株和對照組培養(yǎng)10d后的發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心 20min（4Λ°C，10 000 r/min） 取上清液，使用酸性磷酸酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A060-1-1）及堿性磷酸酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A059-1-1），于紫外可見分光光度計 520nm 測定酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性。每種處理重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel（version 2021，Microsoft，USA）對數(shù)據(jù)進行整理，使用SPSS（Version26.0，SPSSInc，USA）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用方差分析（ANOVA）對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，鄧肯檢驗用于處理間的顯著性，在 5% 概率水平上進行分析，使用OriginPro（Version 202l，Origin LabCorporation，USA）繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1分離的DSE 菌株形態(tài)特征

從野生甘草根系內(nèi)分離得到9株具有解磷能力的疑似DSE 菌株，分別標(biāo)記為D1、D2、D3、D21、D22、D53、D325、X05及C10。這9株真菌在MEA培養(yǎng)基中形成的菌落形態(tài)如圖1所示，菌落及菌絲形態(tài)特征見表1。該9株菌的菌落呈暗色或灰黑色，生長緩慢，菌絲為暗色、有隔菌絲，菌絲直徑 5～10μm ，與DSE的生長特點相符。

2.2 DSE菌株的分子鑒定

將獲得的9株真菌ITS序列上傳至NCBI獲得Genbank登錄號，再進行Blast后和與之相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，D1、D2、D3、D21、D325、X05、C10 分別與 Fusarium sp.（GQ169492. 1）、Botryosphaeria dothidea（MW56-1922.1）、Parasympodiella laxa（GQ303285.1）、Pleosporales sp.（OM106456.1）、Cladosporium te-nuissimum（MH712173.1）、Phialophora cyclaminis（MW296844.1）和 Exophiala salmonis（KT582075.1）序列相近，自展值均達到 100% 。D22 和 Phoma sp.（MT251173.1）聚合在同一分支（自展值 99% ）；D53和Curuularialunata（MWo771o3.1）聚成自展值較高的分支（ 82% ）。

因此，根據(jù)9株真菌的形態(tài)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，9株菌分別屬于不同的種屬：鐮刀菌（Fusarium sp.，Dl）、葡萄座腔菌（Botryospha-eriadothidea，D2）小近軸霉（Parasympodiellalaxa，D3）、格孢腔菌（Pleosporalessp.，D21）莖點霉菌（Phoma sp.，D22）、新月彎孢霉菌（Cur-vularialunata，D53）、極細枝孢菌（Cladospori-umtenuissimum，D325）、仙客來瓶霉（Phialophoracyclaminis，Xo5）和沙門外瓶霉（Exophia-lasalmonis，C10）。

2.3DSE的回接宿主與再分離試驗

將9株DSE菌株的菌絲體回接于甘草幼苗根部，培養(yǎng)9Od后，接種DSE菌株的甘草幼苗根部及地上部分均沒有觀察到病變特征。對甘草根系進行染色后觀察，發(fā)現(xiàn)9株真菌均回接甘草根系成功，即在根系中發(fā)現(xiàn)深色有隔菌絲或微菌核（圖3）。9株DSE菌株在甘草根部的定殖特征為：深色菌絲，菌絲有橫隔，菌絲沿根部縱軸線平行的方向延伸，表皮或組織細胞內(nèi)有膨大的細胞堆積形成的微菌核。從甘草根系重新分離得到的9株DSE，其在培養(yǎng)基上的形態(tài)與回接前基本一致，表明9株真菌均為DSE菌株。

2.4不同難溶性磷源下DSE形態(tài)特征

不同DSE菌株在分別以卵磷脂和磷酸鈣為磷源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d的菌落形態(tài)如圖4所示。由圖4可知，除X05菌株外，同一DSE菌株在不同難溶性磷源平板上形態(tài)特征有顯著差異。2種磷源下9株DSE菌株的菌落形態(tài)特征見表2。雖然9株菌在兩種難溶性磷源的平板上均可以生長，但在培養(yǎng)基上均沒有觀察到明顯的透明圈。

2.5不同磷源下DSE菌株的生長曲線

9株DSE菌株在分別以卵磷脂、磷酸鈣和磷酸二氫鉀為唯一磷源的培養(yǎng)基上的菌落直徑變化如圖5所示。由圖5可知，以卵磷脂為磷源時，D1、D2、D22和D53的生長曲線為對數(shù)型，其他5株菌的生長曲線為線性趨勢。在磷酸鈣為磷源時，D1、D2、D22和D53的生長曲線則變?yōu)椤癝”型，其他5株菌生長曲線仍然為線性趨勢。當(dāng)磷源是磷酸二氫鉀時，D1、D2和D53的生長曲線為對數(shù)型，D22的生長曲線則為“S\"型，其他菌株生長曲線仍然為線性趨勢。相較于其他菌株，D1、D2和D22在3種不同磷源平板上均表現(xiàn)出較好的生長活性，培養(yǎng)1Od的菌落直徑達到82.1mm～89.5mm 。D1、D2、D22和D53這4株菌在不同磷源平板上的生長曲線有差異，但是生長10d后的菌落直徑相近，為 82.1mm～89.5 mm 。D3、D21、D325、X05和C10等5株菌在2種難溶性磷源平板上的菌落直徑有顯著差異，卵磷脂條件下的菌落直徑分別是磷酸鈣條件下的2.22倍、2.56倍、1.45倍、1.79倍和1.37倍，說明這些菌株對卵磷脂的利用效率更高。綜上，9株DSE在不同磷源下均能生長，且在卵磷脂平板上生長較磷酸鈣平板好，其中D1、D2和D22的生長活性高于其他菌株。

2.6 不同磷源下DSE的生物量

9株DSE在分別以卵磷脂、磷酸鈣和磷酸二氫鉀為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d的生物量如圖6所示。由圖6可知，以卵磷脂為磷源時，各菌株生物量除D3相比于對照組提高28.97% 外，其他8株菌比對照組下降 24.16%～ 68.07% 。而在磷酸鈣磷源下，所有菌株生物量相比于對照組均有所降低，下降范圍為 7.29%～ 19.55% ，其中D3下降量最低，D1最高。因此，在不同磷源液體培養(yǎng)下，各菌株生物量除D3表現(xiàn)為卵磷脂 gt; 磷酸二氫鉀 gt; 磷酸鈣外，其他8株菌均表現(xiàn)為磷酸二氫鉀 gt; 磷酸鈣 gt; 卵磷脂。同一磷源中，不同菌株的生物量不同，在以卵磷脂為磷源時，D2的生物量最大，其次為D325和D53，生物量最小為C10。在以磷酸鈣為磷源時，D2的生物量最大，其次為D1和D53，C10的生物量仍然為最小。不同菌株對難溶性磷源的適應(yīng)性存在一定差異，D3及D22相比于對照組生物量下降最少，對難溶性磷源適應(yīng)性最優(yōu)。

2.7難溶性磷源下DSE發(fā)酵液的可溶磷含量及 pH

9株DSE在分別以卵磷脂和磷酸鈣為唯一磷源下培養(yǎng) 10d 后發(fā)酵液的可溶性磷含量及pH見表3。由表3可知，以卵磷脂為磷源時，D22及C1O發(fā)酵液檢出可溶磷濃度分別為 1. 93mg/L 及 2.27mg/L ，其余各菌的發(fā)酵液中均未檢出可溶性磷。在以磷酸鈣為磷源時，9株DSE發(fā)酵液中的可溶磷濃度在 0.56mg/L～47.92mg/L ，其中，D22及D1發(fā)酵液中可溶性磷濃度顯著高于其他菌株（ Plt;0， 05） ，分別為 47. 92mg/L 和47.24mg/L，D3 發(fā)酵液中可溶磷濃度最低，僅為0.56mg/L 。9株DSE在卵磷脂磷源下解磷量很低，但在磷酸鈣磷源下解磷量較大，其中僅D22和C10在兩種難溶性磷源下均檢測到可溶性磷含量。

不同磷源下9株DSE發(fā)酵液中的 pH 不同。

以卵磷脂為磷源時，除D3發(fā)酵液顯示為酸性，pH 為4.74，其余8株菌發(fā)酵液的 pH 范圍為7.38～8.42 ，偏堿性，其中D1發(fā)酵液 pH 最大，Cl0為最低。磷酸鈣磷源下，C10發(fā)酵液 pH 為7.30，偏堿性，其余8株菌發(fā)酵液為酸性， pH 范圍為 5.41～6.75 ，其中，D2 和 D21的發(fā)酵液 pH 較低，分別為5.41和5.50。

綜上，菌株D1和D22在以磷酸鈣為唯一磷源時的解磷量顯著高于其他菌株（ ?Plt;0. 05） ，且D22對卵磷脂也有一定的解磷能力。因此，菌株D1和D22在提高植物對難溶性磷源的利用效率方面具有較高的應(yīng)用潛力。

2.8難溶性磷源下DSE發(fā)酵液中磷酸酶活性

9株DSE在分別以卵磷脂和磷酸鈣為唯一磷源的培養(yǎng)液中的磷酸酶活性如表4所示。不同DSE菌株發(fā)酵液中的酸性磷酸酶活性差異顯著，在卵磷脂磷源下，D1和D22發(fā)酵液中的酸性磷酸酶活性顯著高于其他菌株，分別為10.04U/100mL 和 6.67U/100mL ；D53及空白對照組均未檢出酸性磷酸酶活性；其他菌株酸性磷酸酶活性較低，為 0.19U/100mL～0.89U/100mL 0在以磷酸鈣為磷源時，D22發(fā)酵液中的酸性磷酸酶活性最高，達到 35. 42U/100mL ；其次是D1，為 16.89U/100mL;X 05及空白對照組均未檢出酸性磷酸酶活性；其他菌株的酸性磷酸酶活性較低，為 0.04U/100mL～0.83U/100mL 0

不同菌株發(fā)酵液中的堿性磷酸酶的活性也有顯著差異。在以卵磷脂為磷源時，D1發(fā)酵液中的堿性磷酸酶活性最高，為 0.70U/100mL ，除D53未檢出外，其他菌株發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性較低，為 0.19～0.43U/100mL 。以磷酸鈣為磷源時，各菌株發(fā)酵液堿性磷酸酶活性相比于卵磷脂磷源有所升高，D1和D22的堿性磷酸酶活性顯著高于其他菌株（ Plt;0. 05） ，分別為6.04U/100mL 和 3.10U/100mL 。除X05未檢出外，其他發(fā)酵液中的堿性磷酸酶活性范圍為0.11U/100mL～0.64U/100mL 0

綜上所述，在2種難溶性磷源下，D1和D22發(fā)酵液中的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均顯著高于其他菌株（ Plt;0.05） ，具有較高的磷酸酶活力。而D1和D22對磷酸鈣的解磷量也顯著高于其他菌株，說明酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性的提高是D1和D22解磷的重要機制。

3討論

低磷是限制甘草生長及有效成分積累的重要因素之一[7]。這是因為磷元素作為植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等有機化合物的重要組成成分，以酶或者底物的存在形式參與到甘草的生理代謝活動中，影響甘草的次生代謝物含量[24]。甘草的有效成分多為次級代謝產(chǎn)物，因此，改善甘草磷營養(yǎng)是提高甘草品質(zhì)的重要途徑之一。

研究表明，DSE往往具有一定的解磷能力，并能夠有效提升宿主植物的磷營養(yǎng)狀況[25]。Barresi等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，DSE（Curuularia sp.）能溶解高梁（SorghumbicolorL.Moench）根際土壤的難溶性無機磷，從而提高高粱對磷素的利用率。Mikheev等[27]從野生越橘（Vaccinium vi-tis-idaeaL.）根系分離得到DSE（Phialocephalafortinii），它能夠在蔓越莓（V.macrocarpon）的根部定殖并增加植株對磷的吸收量。因此，對難溶性磷環(huán)境下DSE自身適應(yīng)策略的深人研究，將對揭示低磷脅迫下DSE與宿主植物的共生作用機制具有重要意義。本研究從野生甘草根系中分離得到的9株DSE均能在分別以卵磷脂、磷酸鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基上生長，且均能在相應(yīng)的發(fā)酵液中檢測到可溶性磷，這說明了9株DSE具備一定解磷的能力。除菌株D3外，其余各菌株在磷酸鈣磷源下的生物量比卵磷脂大，這說明大部分的DSE更容易利用難溶性無機磷。有研究表明，微生物利用有機難溶性磷時要先對其進行礦化，將有機難溶性磷轉(zhuǎn)化為無機難溶性磷，然后再進一步利用，這使得微生物更難利用難溶性有機磷[28]。本研究中9 株 DSE 均能在難溶性磷培養(yǎng)基上生長，且對磷酸鈣的溶磷效果較好，這可能與宿主植物甘草長期生長的土壤環(huán)境有關(guān)，在磷酸鈣為主要磷源的土壤環(huán)境下DSE經(jīng)過長時間馴化，對脅迫環(huán)境產(chǎn)生一定的生態(tài)適應(yīng)性，這將有利于促進DSE解磷能力的提升。DSE在兩種難溶性磷源平板上的生長曲線在一定程度上體現(xiàn)了菌株的解磷能力，對磷酸鈣解磷能力最強的D1和D22在兩種平板上的生長活性也較高，且兩株菌在以磷酸鈣為磷源的發(fā)酵液中的磷酸酶活性也高于其他菌株。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，D21和X05在磷酸鈣為磷源下的生物量無顯著差異，但前者的解磷量是后者的6.85倍。因此，DSE生長量并不能直接反映其解磷能力，菌株的解磷量可能與多種因素相關(guān)。

磷素也是DSE菌絲細胞的重要組成元素，它以酶或者底物的形式參與到DSE菌絲細胞的生理代謝活動中。在低磷環(huán)境下，菌絲細胞磷素來源減少，影響菌絲細胞物質(zhì)代謝，甚至抑制菌絲的生長發(fā)育，而磷酸酶可以將難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，在一定程度上增加環(huán)境中的可溶性磷濃度，緩解真菌菌絲低磷脅迫[29]。Barrera等[30]的研究結(jié)果表明，可以通過影響酸性磷酸酶的產(chǎn)生，使微生物體外的可溶性磷水平上升，說明磷酸酶活性與菌株解磷能力密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在液體培養(yǎng)條件下，9株DSE中溶磷量高的菌株對應(yīng)有較高的磷酸酶活性，這說明了磷酸酶在DSE的解磷過程中發(fā)揮了重要作用。微生物存在多種解磷機制，其中重要機制之一是微生物產(chǎn)生大量的質(zhì)子，這些質(zhì)子可以與難溶性磷酸鹽反應(yīng)，使得酸度升高，從而使難溶性磷溶解[31-32]。在本試驗中，以磷酸鈣為磷源的發(fā)酵液中可溶性磷濃度較高的同時，對應(yīng)有較低的 pH ，亦說明DSE的解磷與菌株產(chǎn)生質(zhì)子有關(guān)。值得注意的是，在以卵磷脂為磷源的發(fā)酵液中，可溶性磷的濃度很低或檢測不到，這可能是因為卵磷脂轉(zhuǎn)化為可溶性磷較少，且很快被菌株所利用，也說明分離的DSE對難溶性有機磷的溶解能力較弱。

提高磷酸酶活性和分泌質(zhì)子被認(rèn)為是DSE應(yīng)對低磷脅迫的重要策略[33-34]。當(dāng)環(huán)境中可溶磷含量低，DSE的生長受到影響，DSE就會提高胞外磷酸酶活性，從而水解難溶性磷，釋放出有效磷或者礦化有機磷酸鹽使其成為可利用的可溶磷，同時，DSE代謝過程中會產(chǎn)生大量質(zhì)子，這些質(zhì)子會與難溶性磷酸鹽發(fā)生交換作用促使難溶性磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷。除此之外，菌株分泌如乙酸、乳酸、草酸等有機酸從而降低土壤環(huán)境中的 pH ，且與鈣、鋁、鐵等離子形成螯合物，從而促進菌株對難溶性磷的利用也被認(rèn)為是DSE解磷的重要機制[35]。然而，不同DSE 對低磷脅迫的響應(yīng)存在明顯的差異，這與其自身的解磷機制密切相關(guān)。未來仍需要進一步對不同DSE的解磷機制進行綜合和系統(tǒng)研究，這將為深人了解DSE促進植物磷吸收的作用機制提供新的視角。

4結(jié)論

從野生甘草根系內(nèi)分離得到9株具備解磷能力DSE，分別標(biāo)記為D1、D2、D3、D21、D22、D53、D325、X05及C10。經(jīng)形態(tài)和分子鑒定，9株真菌分別屬于不同的種屬：鐮刀菌（Fusarium sp.，Dl）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea，D2）、小近軸霉（Parasympodiellalaxa，D3）、格孢腔菌（Pleosporalessp.，D21）、莖點霉菌（Pho-masp.，D22）、新月彎孢霉菌（Curvularialuna-ta，D53）、極細枝孢菌（Cladosporiumtenuissi-mum，D325）、仙客來瓶霉（Phialophoracycla-minis，Xo5）和沙門外瓶柄霉（Exophialasalmo-nis，C10）。

不同菌株在不同磷源下的生長速率不同，各菌在卵磷脂平板上的生長速度高于磷酸鈣。液體條件下，除D3外，各菌株生物量表現(xiàn)為：磷酸二氫鉀 gt; 磷酸鈣 gt; 卵磷脂。

9株分離得到的DSE均有解磷能力，尤其以D22和D1解磷能力最強，且兩株菌對磷酸鈣的解磷能力高于卵磷脂。

D1和D22在兩種難溶性磷源下的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均顯著高于其他菌株（ Plt; 0.05），是具有較強解磷能力的重要原因。

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Isolation，Identification and Characteristics of Phosphorus Solubilizing DSE from Licorice Roots

BAN Yihui1 ，MO Xiantong1，WANG Anyue1 ，JIA Chenyue ¹ ， TAN Jiayuan1 and XU Zhouying2

（1.SchoolofChemistry，ChemicalEngineeringandLifeSciences，WuhanUniversityofTechnology，Wuhan China;2.ScholofCivil Engineering andArchitecture，Wuhan Universityof Technology，Wuhan430o7o，China）

AbstractThe aim of this study was to isolate efficient phosphorus-solubilizing dark septate endophytes （DSE） from licorice roots and to provide high-quality resources for improving licorice rhizosphere soil and developing biological fertilizers. In this study，DSEs were isolated from licorice roots using insoluble phosphorus medium，and identified based on morphological characteristics and ITS sequence characteristics. The phosphorus-solubilizing capacity and reasonable mechanisms were analyzed by growth characteristics，biomass，effective phosphorus content，pH value，and phosphatase activity. The results were as follows：9 DSEs were isolated from the roots of licorice，and their morphological and molecular identification were as follows： Fusarium sp. （D1），Botryosphaeria dothidea （D2），Parasympodiella laxa （D3），Pleosporales sp. （D21），Phoma sp. （D22），Curuularia lunata （D53），Cladosporium tenuissimum （D325），Phialophora cyclaminis （Xo5），and Exophiala salmonis （C10）.The colony diameter of 9 DSEs on the lecithin was larger than that of calcium phosphate. In liquid culture，the biomass of other DSEs under different phosphorus sources was potassium dihydrogen phosphate gt; calcium phosphate gt; lecithin，except for D3. The phosphorus solubilizing amounts of 9 DSEs under lecithin and calcium phosphate were 0mg/L to 2.27mg/L and 0.56mg/L to 47.92 mg/L . The solubilizing ability of DSEs to calcium phosphate was greater than that of lecithin. The phosphorus-solubilizing capacities of D22 and Dl for calcium phosphate were significantly higher than those ofother DSEs （ .Plt;0. 05 ）. The acid phosphatase and alkaline phosphatase activities of Dl and D22 were significantly higher than those of other DSEs （ ΔPlt;0. 05 ） when cultured with calcium phosphate as the phosphorus source. Moreover，Dl and D22 exhibited high phosphatase activity.

Key wordsLicorice; Dark septate endophytes; Insoluble phosphorus； Phosphorus solubilizing microorganism；Phosphatase

Received 2023-10-31 Returned 2024-01-03

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China （No. 318o042O）；Natural Science Foundation of Shandong Province in China （No. ZR2022MD108，No. ZR2022MC218）.

First author BAN Yihui，male，associate professor. Research area：rhizosphere microorganisms of medicinal plants. E-mail：banyihui@whut.edu.cn

Corresponding authorXU Zhouying，female，associate professor. Research area： microbial ecology. E-mail： xuzhouying@whut. edu.cn

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsibleeditor：GUOBaishou）