妥甸醬油發(fā)酵功能菌株篩選及應(yīng)用

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.006

中圖分類號(hào)：TS264.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）05-0037-11

Screening and Application of Functional Strains for Fermentation of Tuodian Soy Sauce

WU Quan-rong，ZHANG Hui，HU Yong-jin，ZHU Ren-jun

College of Food Science and Engineering，Yunnan Agricultural University， Kunming 65O201，Chi1

Abstract： Tuodian soy sauce is a special product of Shuangbai region in Yunnan. The relationship between the formation of its excellent quality and microorganisms is not clear. At present，there are mainly problems such as low utilization rate of raw materials，unstable flavor quality，difficulty in precise and stable control of fermentation process，and long fermentation period. In this study，the dominant microorganisms in the mash of Yunnan Tuodian soy sauce are isolated and identified，and three strains with strong enzyme production capacity and high sensory scores are screened out，which are mixed to make fermentation agent and applied for soy sauce fermentation，so as to optimize the soy sauce production process. The results show that the ratio of XT6-5，RT5-3 and JT7-3 is 3：3：2 ： The optimal fermentation process parameters are fermentation temperature of 41^°C ，inoculation amount of 6% and salt concentration of 8% . When the fermentation is completed，the content of amino acid nitrogen of mash is 0.936g/100g ，and the sensory score is 78. 4 points. This study has provided a theoretical basis for improving the quality stability of Tuodian soy sauce.

Key words： soy sauce; screening of bacteria; mixed fermentation agent; process optimization

醬油作為中國傳統(tǒng)的調(diào)味品之一，已有2000多年的釀造歷史，由自然接種和混合培養(yǎng)發(fā)酵而成，微生物群落在其風(fēng)味的形成中起著重要的作用[1]。近年來，研究者們越來越重視醬油發(fā)酵菌種、品質(zhì)、安全、功能等方面的研究[2]。因此，在醬油生產(chǎn)過程中，明確的混合發(fā)酵劑對于更好地控制發(fā)酵過程和提高產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性十分重要[3]。

妥甸醬油是云南雙柏地區(qū)的特色產(chǎn)品，其發(fā)酵過程在一個(gè)開放的混菌發(fā)酵體系中完成，存在原料利用率低、風(fēng)味品質(zhì)不穩(wěn)定、發(fā)酵過程難以精準(zhǔn)穩(wěn)定控制、發(fā)酵周期長等問題。針對以上問題，本文從妥甸醬油醬醪中分離篩選影響醬油品質(zhì)的高產(chǎn)功能微生物，通過人工純化培養(yǎng)，強(qiáng)化功能微生物在發(fā)酵中的作用，提高原料氮轉(zhuǎn)化率，縮短發(fā)酵周期，為提高妥甸醬油的品質(zhì)穩(wěn)定性提供了理論依據(jù)，對提升醬油品質(zhì)具有實(shí)際生產(chǎn)意義。

1材料與方法

1.1材料

醬醪樣品：取自云南省楚雄彝族自治州雙柏縣妥甸鎮(zhèn)某醬油廠，保藏于一 80°C 超低溫冰箱中備用；大豆、帶殼小麥、食鹽：購于市尚購超市。

1.2培養(yǎng)基

酵母浸出粉脈葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD瓊脂培養(yǎng)基）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；YPD肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；大曲酶解液[4]：將發(fā)酵好的大曲與水以 1：4 （質(zhì)量比）混合， 40^°C 酶解 ，離心取上清液備用，使用時(shí)按需要調(diào)節(jié)鹽濃度。

1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AX223ZH/E電子天平奧豪斯儀器（常州）有限公司；BSC-250恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；PTQZ-6振蕩培養(yǎng)箱常州普天儀器制造有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；STARTER3100/F數(shù)字型 pH 計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SF-TDL-4A高速離心機(jī)上海菲恰爾分析儀器有限公司；NikonE20O-F顯微鏡南京新飛達(dá)光學(xué)儀器公司。

1.4方法

1.4.1樣品采集和保存

采集妥甸醬油不同發(fā)酵時(shí)間的醬醪。每批醬醪取3個(gè)平行，每份 500g ，裝入無菌袋中封袋后保存于冰盒中，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈操作臺(tái)上進(jìn)行優(yōu)勢微生物培養(yǎng)，余下的樣品分裝于貼好標(biāo)簽的無菌采樣管中，放入 -80^°C 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 優(yōu)勢微生物的分離純化

稱取 10g 醬醪樣品，用無菌生理鹽水梯度稀釋，取250μL 稀釋液均勻涂布于無菌平板上。細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于 36^°C 培養(yǎng) 24h ，乳酸菌用MRS培養(yǎng)基于36°C 培養(yǎng) 24h ，酵母菌用YPD瓊脂培養(yǎng)基于 培養(yǎng)72h[5]。

觀察培養(yǎng)完成后的平板，根據(jù)菌落形態(tài)挑選出優(yōu)勢細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌劃線分離，直至獲得純凈的單菌落。將分離純化后的細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，乳酸菌接種于MRS斜面上，酵母菌接種于YPD瓊脂斜面上，于 4^°C 冰箱中保藏以備后續(xù)研究。

1.4.3 高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

將純化后的菌株接種至對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中活化2代，進(jìn)行產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，篩選出不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣的細(xì)菌，產(chǎn)酸能力強(qiáng)、不產(chǎn)氣的乳酸菌和產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力強(qiáng)的酵母菌，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為 1.0×10⁸ CFU/mL，接種到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵 48h ，以 10000r/min 離心提取上清液，測定蛋白酶活力。

蛋白酶活力的測定參照盧超等[的福林酚比色法并稍作改動(dòng)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，線性回歸方程為 y=0.002 4x+0.000 8，R² 為0.9994，線性擬合較好，可用于蛋白酶活力的測定。

1.4.4高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

選擇蛋白酶活力排名前三的細(xì)菌和排名前二的乳酸菌、酵母菌，活化后測定脂肪酶活力和 α -淀粉酶活力，乳酸菌還需測定產(chǎn)酸能力。

脂肪酶活力的測定參照李成龍等的直接滴定法； α -淀粉酶的測定參照GB/T24401— 2009??α? 淀粉酶制劑》。

1.4.5單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將目標(biāo)菌株活化后調(diào)整為統(tǒng)一的菌液濃度，接種到大曲酶解液中在適宜溫度下發(fā)酵7d，分別進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量測定和感官評價(jià)。邀請實(shí)驗(yàn)室9名無鼻炎、嗅覺正常、有一定感官評價(jià)經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)組成感官評價(jià)小組，對發(fā)酵液進(jìn)行嗅聞，并根據(jù)醬油特征香氣對發(fā)酵液香氣進(jìn)行分類打分[8-9]（見表1），從而確定最終用于發(fā)酵的菌株。

1.4.6 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

挑取斜面保藏的目標(biāo)菌株在無菌一次性平板上劃線培養(yǎng)，選擇無雜菌污染且分離出單菌落的平板，做好標(biāo)記，用封口膜密封后放入冰盒中，寄往武漢天一華煜基因科技有限公司進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。細(xì)菌類選擇16SrDNA位點(diǎn)進(jìn)行測定[1°]，酵母菌類選擇ITSrDNA位點(diǎn)進(jìn)行測定[8]

1.4.7 目標(biāo)菌株生長曲線繪制

將活化目標(biāo)菌株配制成相同濃度的菌懸液，按 2% 的接種量接入對應(yīng)的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48h ，其中細(xì)菌類的培養(yǎng)溫度為 37^°C ，酵母菌類的培養(yǎng)溫度為 28°C ，每 ^2h 取樣測定吸光度值（ OD_600nm ），重復(fù)測定3次，繪制菌株生長曲線。

1.4.8 菌株間拮抗作用的驗(yàn)證

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選用的3個(gè)菌株均能在PCA平板上正常生長，故采用交叉劃線法驗(yàn)證菌株間是否存在拮抗作用[11]。

1.4.9 菌株配比的確定

將目標(biāo)菌株活化后調(diào)整菌液濃度為 1.0×10⁸CFU/mL 按照XT6-5、RT5-3和JT7-3的比例為 1：1：1.1：2：2 、 1：3：3，2：1：2，2：3：1，2：2：3，3：1：3，3：2：1： 3：3：2 混勻后接種至大曲酶解液中發(fā)酵 ^72h ，測定發(fā)酵 液中氨基酸態(tài)氮的含量。

1.4.10 凍干菌粉的制備及存活率的檢測

以XT6-5、RT5-3和JT7-3為 3：3：2 制備混合菌懸液，與滅菌后的保護(hù)劑按 1：2 的比例混勻后，取樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，立即將混合菌懸液于-20^°C 預(yù)冷凍 24h ，隨后放入預(yù)凍好的真空冷凍干燥機(jī)中，干燥完成后再次取樣測定活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.4.11 醬油后發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.11. 1 醬油發(fā)酵工藝

本實(shí)驗(yàn)采用的醬油發(fā)酵工藝根據(jù)妥甸醬油發(fā)酵方法進(jìn)行改進(jìn)：選擇飽滿、無蟲蛀的大豆和帶殼小麥作為原料，按照 66% 大豆和 34% 小麥進(jìn)行備料。將大豆破碎成兩半，用純凈水浸潤 8h ，潤水量為大豆質(zhì)量的1.25倍，放入高壓鍋中蒸制，蒸熟的大豆應(yīng)呈淡紅褐色，有彈性但能夠用手碾碎。將小麥放入烤箱中烤至茶色，破碎成顆粒狀，拌入蒸熟的大豆，攪拌均勻后冷卻至 40^°C 左右。將培養(yǎng)好的種曲碾碎拌人原料中， 保持濕度為 90% 制曲 48～72h ，期間翻曲 2～3 次，發(fā)酵至曲料質(zhì)地松散，黃綠色孢子飛揚(yáng)，具有成曲特有的香氣，無異味。制曲完成后，按照料液比 1：1 拌入鹽水，攪拌均勻后進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為 10d_c 。固態(tài)發(fā)酵10d后，按照料液比 1：1.5 混人 15Be^° 鹽水，攪拌均勻后，于 36^°C 繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后壓榨過濾獲得生醬油。

1. 4.11. 2 單因素實(shí)驗(yàn)

醬油后發(fā)酵是將大曲與鹽水混合后再進(jìn)行發(fā)酵，因此單因素實(shí)驗(yàn)將菌株接種至大曲發(fā)酵液中模擬醬油發(fā)酵。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度、接種量、鹽濃度為單因素，其他因素為固定因素。每組設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

a.發(fā)酵溫度的確定

固定接種量為 4% ，大曲酶解液鹽濃度為 7% ，將發(fā)酵溫度設(shè)置為 32，35，38，41，44^°C ，恒溫發(fā)酵 ⁷d 。

b.接種量的確定

固定發(fā)酵溫度為 35°C ，大曲酶解液鹽濃度為 7% 將接種量設(shè)置為 2%4%.6%.8%.10% ，恒溫發(fā)酵 ⁷d 0c.鹽濃度的確定。

固定接種量為 4% ，發(fā)酵溫度為 35°C ，將大曲酶解液鹽濃度設(shè)置為 6.5%.7%.7.5%.8%.8.5% ，恒溫發(fā)酵7d。

1. 4.11.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵溫度、接種量、鹽濃度為因素，以發(fā)酵55d時(shí)醬醪的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表2。

表2醬油后發(fā)酵響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平

1. 4.12 醬醪感官評分

由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備限制，無法將實(shí)驗(yàn)制備的少量醬醪壓榨獲得足夠感官評價(jià)的醬油成品，因此選擇發(fā)酵結(jié)束時(shí)的醬醪進(jìn)行檢測。參考張偉等[12]關(guān)于釀造醬油感官評價(jià)的方法，改進(jìn)后使用。從實(shí)驗(yàn)室邀請身體健康、嗅覺和味覺正常的5女4男對滅菌后的醬醪進(jìn)行感官評價(jià)，感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3醬油的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1優(yōu)勢微生物的分離純化

從妥甸醬油的醬醪樣品中分離得到優(yōu)勢菌株53株，其中細(xì)菌28株，乳酸菌10株，酵母菌15株。將分離純化后的細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，乳酸菌接種于MRS斜面上，酵母菌接種于YPD瓊脂斜面上，置于 4°C 冰箱中保藏。

2.2高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

根據(jù)葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)結(jié)果，剔除不符合要求的菌株后，剩余菌株見表4，乳酸菌R6、R10、RT5-3、RT15-6-1的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，酵母菌JT2、JT7-1、JT7-3、JT7-4的產(chǎn)氣能力較強(qiáng)，故選擇以下菌株測定蛋白酶活力。

注：產(chǎn)氣中“一\"表示沒有氣體產(chǎn)生；“ + ”表示杜氏小管中有 1/4 氣體；“ ⁺⁺ \"表示杜氏小管中有1/3氣體；“ +++ ”表示杜氏小管中有1/2氣體； …++++ ”表示杜氏小管中充滿氣體；產(chǎn)酸中“一\"表示培養(yǎng)液呈紫色；“ + ”表示培養(yǎng)液變成黃紫色；“ ⁺⁺ ”表示培養(yǎng)液完全變成黃色。

將活化好的菌株接種至液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)^48h 測定蛋白酶活力，結(jié)果見圖2。細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力明顯強(qiáng)于乳酸菌和酵母菌，細(xì)菌中蛋白酶活力排名前三的是XT3-7-1、XT2-6-2、XT6-5，其中XT3-7-1的蛋白酶活力最高，達(dá)到 1 123U/mL ，XT2-6-2和XT6-5的蛋白酶活力分別為 1081，1064U/mL ；酵母菌蛋白酶活力排名前二的是JT7-3和JT7-1，蛋白酶活力分別達(dá)到 170，126U/mL ；乳酸菌蛋白酶活力排名前二的是RT5-3、RT15-6-1，蛋白酶活力分別為 78，62U/mL ，故選擇以上7株菌進(jìn)入下一階段的篩選。

Fig.2 Screening results of protease production capacity of strains

2.3 高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

2.3.1菌株產(chǎn)脂肪酶能力測定

Fig.3Determination resultsoflipase production capacity of strains由圖3可知，細(xì)菌產(chǎn)脂肪酶能力強(qiáng)于酵母菌和乳酸菌；3株細(xì)菌中XT6-5產(chǎn)脂肪酶能力最強(qiáng)，可達(dá)到30U/mL ，XT3-7-1次之，XT2-6-2的產(chǎn)脂肪酶能力最弱；酵母菌中JT7-3的脂肪酶活力為 22.8U/mL ，強(qiáng)于JT7-1；乳酸菌中RT5-3的脂肪酶活力為 16U/mL ，強(qiáng)于RT15-6-1。

2.3.2 菌株產(chǎn) α -淀粉酶能力測定

由圖4可知，3株細(xì)菌中XT6-5產(chǎn) α -淀粉酶能力最強(qiáng)，達(dá)到 69.5U/mL，XT3-7-1 次之，XT2-6-2產(chǎn) α? -淀粉酶能力最弱；酵母菌中JT7-1產(chǎn) α -淀粉酶能力略強(qiáng)于JT7-3；乳酸菌中RT5-3產(chǎn) α -淀粉酶能力略強(qiáng)于RT15-6-1，但總體來看7株菌的 α -淀粉酶活力均在 60～70U/mL 之間。

2.3.3 乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力測定

乳酸菌分泌有機(jī)酸會(huì)降低發(fā)酵液的pH，可通過測定發(fā)酵液pH的動(dòng)態(tài)變化分析乳酸菌的產(chǎn)酸情況。乳酸菌產(chǎn)酸曲線見圖5。

Fig.5 Acid-production curve oflactic acid bacteria

由圖5可知，總體來看隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，兩株菌的發(fā)酵液pH不斷下降，在 8～12h 時(shí)急劇下降，表明該時(shí)間段乳酸菌生長活動(dòng)旺盛，產(chǎn)生大量酸類物質(zhì)，隨后發(fā)酵液的 pH 基本穩(wěn)定，乳酸菌生長活動(dòng)減慢，產(chǎn)酸量減少；RT5-3的產(chǎn)酸能力強(qiáng)于RT15-6-1。

2.3.4菌株形態(tài)學(xué)觀察

7株菌經(jīng)過革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖6。

注：A為菌株XT3-7-1，B為菌株XT6-5，C為菌株XT2-6-2， D為菌株JT7-1，E為菌株JT7-3，F(xiàn)為菌株RT5-3，G為菌株 RT15-6-1。

由圖6可知，菌株XT3-7-1、RT5-3、RT15-6-1呈紫色，XT6-5和XT2-6-2呈藍(lán)色，可以確定它們是革蘭氏陽性菌；XT2-6-2為桿狀；XT3-7-1和XT6-5菌體較小，呈現(xiàn)卵圓狀，不易分散，能夠觀察到有明顯的細(xì)胞壁；JT7-1和JT7-3菌體較大，能夠觀察到出芽生殖，JT7-1為圓球狀，JT7-3為橢球狀且有菌絲。RT5-3、RT15-6-1菌體均為球形，成對出現(xiàn)。

2.3.5單菌模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

由圖7和圖8可知，單菌模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，添加XT6-5、JT7-3的發(fā)酵液具有明顯的醬香味，同時(shí)散發(fā)烤土豆的香氣，JT7-3的氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量高于JT7-1；添加RT5-3的發(fā)酵液酸香較明顯，除烤土豆味外，其余項(xiàng)目的感官評分均高于RT15-6-1，且氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量最高。XT2-6-2的感官評分排名最低，說明其不能產(chǎn)生足夠的醬油特征香氣，故后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)剔除該菌。

2.4菌株分子生物學(xué)鑒定和生長曲線

將篩選得到的6個(gè)菌株進(jìn)行同源性比對，結(jié)果見表5，按照打分排序，提供得分最高且匹配度最佳的一條序列作為鑒定結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖9。

生長曲線能夠從宏觀層面反映微生物的生長情況，通過測定不同培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)液在 600nm 處的吸光度值，能夠大概確定微生物生長的延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，為菌株在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐[13]。菌株生長曲線見圖10。

由圖10可知，6株菌在培養(yǎng) 前后進(jìn)入對數(shù)生長期，在 14～20h 進(jìn)入穩(wěn)定期。其中，RT5-3和XT6-5的對數(shù)生長期略早于其他幾株菌，且對數(shù)生長期維持時(shí)間較長，意味著這兩株菌具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和繁殖能力。JT7-3雖然較晚進(jìn)人對數(shù)生長期，但該菌能夠在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)人穩(wěn)定期，且在穩(wěn)定期內(nèi)維持較高濃度，說明該菌具有較強(qiáng)的維持穩(wěn)定生長的能力。此外，將菌株進(jìn)行分類，得知酵母菌與細(xì)菌相比具有更強(qiáng)的生長穩(wěn)定性，而細(xì)菌生長速率快，但到達(dá)穩(wěn)定期后會(huì)出現(xiàn)吸光度值下降的情況。

2.5混合菌株發(fā)酵劑研制

2.5.1 菌株拮抗作用驗(yàn)證結(jié)果

綜合前期篩選過程中對菌株生長特性和穩(wěn)定性的研究，XT6-5、RT5-3、JT7-3這3株菌具有產(chǎn)酶能力強(qiáng)、生長繁殖快、發(fā)酵穩(wěn)定性較好的特點(diǎn)，故選擇這3株菌作為后續(xù)發(fā)酵的菌株?；炀l(fā)酵需要考慮菌株間是否存在拮抗作用，菌株間的拮抗作用通常使用十字交叉劃線法和紙片法進(jìn)行驗(yàn)證[14]。本研究使用交叉劃線法進(jìn)行驗(yàn)證，將3株菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上兩兩交叉劃線，生長情況見圖11。

圖11中菌株交叉處菌落生長正常，并未出現(xiàn)明顯抑菌區(qū)域，表明3株菌之間不存在拮抗作用或拮抗作用不明顯，因此判定可以將這3株菌混合后進(jìn)行醬油發(fā)酵。

2.5.2菌株配比模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

有研究表明共培養(yǎng)的微生物間往往存在協(xié)同作用，它們分工合作，為彼此提供營養(yǎng)，擴(kuò)大微生物對底物的利用范圍，控制發(fā)酵體系 pH ，轉(zhuǎn)移或消除有毒的抑制產(chǎn)物，因此混菌發(fā)酵不僅能夠提高發(fā)酵效率，縮短發(fā)酵周期，而且可以避免雜菌污染，控制產(chǎn)品質(zhì)量[15-16]。

Fig.l2 Amino acid nitrogen content of compound fermentation由圖12可知，XT6-5、RT5-3和JT7-3按 3：3：2 接入大曲酶解液中復(fù)配發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量最高，可達(dá)到 0.102g/100mL 。

2.5.3凍干存活率結(jié)果

因目標(biāo)菌株中酵母菌的耐受力較強(qiáng)，選擇凍干保護(hù)劑時(shí)側(cè)重偏向于對細(xì)菌活性的保持，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，選取以下3個(gè)保護(hù)劑配方與菌泥按比例混合進(jìn)行冷凍干燥。

配方一：脫脂乳粉 8% ，海藻糖 5% ，甘油 4%^[17]

配方二：脫脂乳粉17%，海藻糖9%，谷氨酸鈉11%[18]

配方三：脫脂乳粉 11% ，谷氨酸鈉 6.5% ，檸檬酸 鈉14.7%[19]

測定凍干前后的活菌數(shù)，計(jì)算存活率，結(jié)果見圖13。確定脫脂乳粉 17% 、海藻糖 9% 、谷氨酸鈉 11% 為最適的保護(hù)劑，凍干后活菌數(shù)的對數(shù)值為8.26，菌株存活率為 79.5% 。

2.6 醬油混合菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1.1發(fā)酵溫度的確定由圖14可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為 29～41 （20 ^°C 時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量升高，在 41°C 時(shí)達(dá)到最大值，為 0.125g/100mL ，之后發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，氨基酸態(tài)氮含量下降。因此，應(yīng)將發(fā)酵溫度控制在 38～44^°C 之間。

由圖15可知，當(dāng)接種量為 2%～6% 時(shí)，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量隨著接種量的增加而升高，當(dāng)接種量為 6% 時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高值 0.117g/100mL ，當(dāng)接種量超過 6% 后，氨基酸態(tài)氮含量隨著接種量的增加而下降。因此，應(yīng)將接種量控制在 4%～8% 之間。

2.6.1.3 鹽濃度的確定

由圖16可知，當(dāng)鹽濃度為 7.5% 和 8.0% 時(shí)，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量基本一致，達(dá)到最高值 0.125g/100mL 因此，應(yīng)將鹽濃度控制在 7.5%～8.5% 之間。

2.6.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度 （A ）、接種量 （B） 、鹽濃度 （C） 為實(shí)驗(yàn)因素，經(jīng)查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定以發(fā)酵第55天時(shí)發(fā)酵體系中氨基酸態(tài)氮含量和感官評分為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，確定醬油發(fā)酵最佳工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

采用響應(yīng)面法分析后，得到氨基酸態(tài)氮 （Y₁ ）和感官評價(jià) （Y₂ ）與發(fā)酵溫度（A）、接種量 （B） 、鹽濃度 （C） 的二次回歸方程： Y₁=0.94+0. 011 25A-0.01B-0. 011 25C+ 0.025AB+0.0375AC+0.005BC-0.05375A²-0.05125B²- 0.08875C² ;Y₂=74.56-0.50A+0.4125B-2.5625C+ 0.525AB+1.025AC-1.705A²-0.23B²-4.33C² 。

2.6.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

表7以氨基酸態(tài)氮為評價(jià)指標(biāo)回歸模型方差分析

Table7Analysis ofvariance ofregression modelwith amino acid nitrogen as the evaluation index

由表7可知，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)的回歸模型極顯著（ Plt;0. 01 且失擬項(xiàng)不顯著（ Pgt;0.05 ，回歸模型相關(guān)系數(shù) 表明模型的擬合度較好，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際情況有較高的擬合度，能夠準(zhǔn)確反映因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。通過比較 F 值可知影響醬醪氨基酸態(tài)氮含量的因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度 （A）= 鹽濃度 （C）gt; 接種量 （B） 。

表8以感官評分為評價(jià)指標(biāo)回歸模型方差分析

由表8可知，以感官評分為指標(biāo)的回歸模型極顯著 （Plt;0.01） 且失擬項(xiàng)不顯著 （Pgt;0.05） ，回歸模型相關(guān)系數(shù) ，表明模型的擬合度較好，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際情況有較高的擬合度，能夠準(zhǔn)確反映因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。通過比較 F 值可知影響醬醪感官評分的因素主次順序?yàn)辂}濃度 （C）gt; 發(fā)酵溫度 （A）gt; 接種量 （B） 。

由圖17和圖18可知，3個(gè)因素在對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)都有響應(yīng)極值，通過觀察曲面圖的傾斜程度和等高線的形狀，可得出各因素之間的交互作用明顯，說明這幾組因素的交互作用對醬油發(fā)酵的影響較大。

2.6.4最佳工藝條件實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

采用Design-Expert10.O.3軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化，得到醬油發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度 40.824^°C 、接種量 5.9% 、鹽濃度 7.9% ，氨基酸態(tài)氮含量預(yù)測值為0.939g/100g ，感官評分預(yù)測值為74.9分。為了滿足實(shí)際操作的可行性，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵溫度41^°C 、接種量 6% 、鹽濃度 8% ，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到醬醪中氨基酸態(tài)氮含量為 0.936g/100g 感官評分為78.4分，與預(yù)測值較接近，說明響應(yīng)面分析得到的工藝參數(shù)較可靠，具有一定的可行性。

3結(jié)論

從妥甸醬油不同發(fā)酵階段的醬醪中分離篩選出6株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，分別為2株芽孢桿菌、2株乳酸菌和2株酵母菌，經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定，確定XT3-7-1為Bacillus pumilus，XT6-5為Bacillus amyloliquefaciens，RT15-6-1為Pediococcusacidilactici，RT5-3為Pediococcuspentosaceus，JT7-1為Torulasporadelbrueckii，JT7-3為Pichiakudriauzeuii。對6株菌的產(chǎn)酶能力、生長特性和感官評價(jià)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)JT7-3產(chǎn)氣能力最強(qiáng)，RT5-3生長活性最強(qiáng)，XT6-5產(chǎn)脂肪酶、 α -淀粉酶能力最強(qiáng)、感官評分最高，因此選擇XT6-5、RT5-3、JT7-3作為后續(xù)混菌發(fā)酵的目標(biāo)菌株。

對篩選得到的3株菌驗(yàn)證無拮抗作用后確認(rèn)最佳配比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：XT6-5、RT5-3和JT7-3的比例為3：3：2 時(shí)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量最高，按照該比例制備混合菌泥并按 1：2 的比例與保護(hù)劑混合后于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，以菌株存活情況為指標(biāo)，確定脫脂乳粉 17% 、海藻糖 9% 、谷氨酸鈉 11% 為最適的保護(hù)劑，凍干存活率為 79.5% 。

將制備的發(fā)酵劑應(yīng)用于醬油發(fā)酵，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化醬油后發(fā)酵階段工藝，以發(fā)酵體系中氨基酸態(tài)氮含量和感官評分為指標(biāo)，確定最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度 41°C 、接種量 6% 、鹽濃度8% ，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵完成時(shí)醬醪的氨基酸態(tài)氮含量為 0.936g/100g ，感官評分為78.4分。

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