蕎麥種間雜交群體基因定位解析

關(guān)鍵詞：蕎麥（FagopyrumesculentumMoench.）;種間雜交群體;基因組測(cè)序;基因定位中圖分類號(hào)：S334 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2025）05-0167-06DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.026

Genetic mapping analysis of interspecific hybrid population in buckwheat

{INGui-fang1，LUWen-jiel，LONG Wen-jie'，SUNDao-wang1，HUANGChun-yan2，ZHAIBing-xin2，WANGLi-ua’ （1.BiotechnologndGeneticGemplasmResourcesResearchIsituteYunanProvincialKeyLaboratoryofgiculturaloteologKey LaboratoryofSouthwesteCropGeneResouresandGermplasmInnovation，MinistryofAgricultureandRuralAfairs，YunnanAcademyof AgriculturalSciences，Kunming 650205，China;2.Instituteof Resource Plants，Yunnan University，Kunming6505oo，China）

Abstract ： An F₂ population was constructed by crossng the cultivated buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench.）variety Yunqiao 1 （YQ1）withthelodging-resistantanddisease-resistantwildbuckwheatYZ56，extremephenotypicindividualsfortraitsincludingplantheight，rainweightperplant，ndleafblightresistancewerescreenedbasedonagronomictraitinvestigationdataadDA wasextractedfrombuckwheatleavesusing theCTABmethodtoconstruct extremephenotypicDNApools.Theresultsdemonstrated that plant height and grain weight per plant in the F₂ population showed normal distributions，with individuals exhibiting lowerleaf blightincidenceoccupyingahigherproportioninthedistribution.Theaverage grainweightperplantoftheF2populationwas7.8g， higherthnthatof heparentalinesYZ56（13.1g）andYQ1（16.7g），indicatingsignificantheterosis.Rationalutilizationofdistant germplasmesourcesforhybridizationcouldimproveprogenyyield.Pearsoncorelationaalysisrevealedhighlysignificantcoelations amongplantheight，grainweightperplant，andleafblightincidencerate.Poledsequencingcombinedwithbulkedsegregantanalysis （BSA）successfully identified 1O QTL regions associated with plant height at a 95% confidence interval，7 candidate QTL regions related to grain weight per plant，and 6 candidate QTL regions linked to leaf blight resistance.

Key words：buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench.）；interspecific hybrid population;genome sequencing;genemapping

蕎麥（FagopyrumesculentumMoench.）是蓼科蕎麥屬1年生或多年生草本或半灌木植物，其中苦蕎和甜蕎是2種廣泛栽培的重要亞種[1-3]。蕎麥?zhǔn)羌癄I(yíng)養(yǎng)、保健、藥用為一體的食藥同源作物，廣泛種植于亞洲、歐洲、美洲的多個(gè)國(guó)家。中國(guó)蕎麥的種質(zhì)資源豐富，“七五\"和“八五\"期間全國(guó)共收集到3338份蕎麥種質(zhì)資源。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)2795份蕎麥資源的10余個(gè)性狀進(jìn)行鑒定[4.5]。1998—2001年云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院收集到10個(gè)種（包括2個(gè)變種）的野生蕎麥種質(zhì)資源100余份，明確了云南野生蕎麥的特征特性及地理分布，其中YZ56（地方野生種）具有早熟、矮稈（抗倒伏）抗病等優(yōu)異特性。

中國(guó)有近20個(gè)省份種植蕎麥，2019年中國(guó)蕎麥播種面積38.8萬(wàn) hm² ，產(chǎn)量54.3萬(wàn)t；2020年中國(guó)蕎麥播種面積37萬(wàn) hm² ，產(chǎn)量53.3萬(wàn)t。截至2015年底，中國(guó)育成并通過(guò)全國(guó)審定（鑒定）的蕎麥品種28個(gè)，通過(guò)各省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審（認(rèn)）定的蕎麥品種44個(gè)[6。其中云蕎1號(hào)（國(guó)品鑒雜2010012）為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所選育的品種，具有早熟、高產(chǎn)等優(yōu)異特性，但易感葉枯病和葉脈病，株高較高，易倒伏[7]

混合分組分析（Bulksegregateanalysis，BSA）是基于表型分離群體的基因定位方法。該方法首先選擇目標(biāo)表型性狀差異顯著的2個(gè)親本進(jìn)行雜交，構(gòu)建表型分離群體；隨后對(duì)分離群體進(jìn)行表型鑒定，篩選出極端表型的個(gè)體，分別混合構(gòu)建DNA池并進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序；通過(guò)比較不同表型DNA池之間的基因突變頻率差異，定位目標(biāo)基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）所在的染色體候選區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)性狀相關(guān)基因的快速定位。BSA可以高效、快速、準(zhǔn)確定位目標(biāo)性狀相關(guān)基因位點(diǎn)，顯著降低檢測(cè)成本，已被廣泛應(yīng)用于多物種的基因挖掘與功能研究。

基于蕎麥分離群體的BSA分析，已成功定位到多個(gè)與收獲前發(fā)芽相關(guān)的主效和微效QTL[8]。此外，通過(guò)對(duì)苦蕎 F₂ 群體的BSA分析，研究者定位到與脫殼難易相關(guān)的QTL位點(diǎn)Ftes1，并通過(guò)精細(xì)定位鑒定出3個(gè)候選基因[9]。然而，目前關(guān)于蕎麥株高、產(chǎn)量及抗病性等重要農(nóng)藝性狀的QTL或基因定位研究鮮見報(bào)道。

為了挖掘利用野生蕎麥種質(zhì)資源的優(yōu)異基因，本研究利用野生蕎麥YZ56和栽培苦蕎品種云蕎1號(hào)（YQ1）的雜交F群體，針對(duì)株高、單株粒重、葉枯病抗性進(jìn)行BSA研究，定位相關(guān)性狀的基因位點(diǎn)，為后續(xù)的基因解析與育種應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

采用云蕎1號(hào)（YQ1）和地方野生種蕎麥YZ56進(jìn)行雜交。母本云蕎1號(hào)為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所功能食品作物產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)選育的高產(chǎn)品種，其特點(diǎn)為早熟、中稈、大粒，生育期為95d左右。父本YZ56為云南滇西北地區(qū)地方野生種，其特點(diǎn)為矮稈、超早熟、種子棱上有刺、不易倒伏，主要分枝集中在植株的下部，平均株高為52.1cm ，生育期為65d左右。

1.2 方法

1.2.1群體構(gòu)建2020年年初親本分批播種于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，5月底開始做人工去雄雜交，6月底收獲雜交種；7月底將雜交種 F₁ 代播種于安寧基地大棚，10月中旬調(diào)查農(nóng)藝性狀并收獲 F₂ 代種子。

1.2.2表型鑒定2021年5月初， F₂ 代被播種于安寧基地大棚，采用 28cm×30cm 規(guī)格的育苗盆，共播種580盆，每盆1苗，播種1個(gè)月后取葉片樣品冷凍保存。于8月初（約 80% 的子粒成熟）調(diào)查和記載生育期、株高（主莖高）3個(gè)最高分枝長(zhǎng)、一級(jí)分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、莖粗、果刺、葉枯病和葉脈病抗性等性狀，用紙袋收取單株全部種子，帶回室內(nèi)調(diào)查果刺、單株粒數(shù)、單株粒重、千粒重等性狀。其中葉枯病率 Ψ=Ψ （發(fā)病葉片數(shù)/單株總?cè)~片數(shù)） ×100% 。

1.2.3混池測(cè)序基于農(nóng)藝性狀調(diào)查數(shù)據(jù)篩選出株高、單株粒重及葉枯病抗性等性狀的極端表型個(gè)體，采用CTAB法從樣本葉片中提取DNA，構(gòu)建極端表型DNA混池。按照華大基因的DNA建庫(kù)流程，對(duì)親本DNA及子代DNA池進(jìn)行片段化、接頭連接及PCR擴(kuò)增等步驟，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，并在華大DNBSEQ-T7平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序（PE150）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先用FastQCV0.11.4對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除污染序列及測(cè)序接頭序列，獲得干凈測(cè)序數(shù)據(jù)（Cleandata），然后用BWAV0.7.13軟件將所得片段序列與苦蕎參考基因組（http：//mb-kbase.org/Pinku1/）進(jìn)行比對(duì)。對(duì)其結(jié)果中的重復(fù)項(xiàng)使用SAMTOOLS的rmdup命令刪除。用GATKV4軟件的UnifedGenotyper模塊檢測(cè)樣本的SNPs和Indel標(biāo)記。用以下篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì) SNPs/Indel 進(jìn)行過(guò)濾： ① 刪除具有多種基因型的SNP/Indel位點(diǎn)； ② 刪除測(cè)序深度低的SNP/Indel位點(diǎn)； ③ 刪除親本間無(wú)多態(tài)或親本間有多態(tài)但2個(gè)混池間純合卻多態(tài)的SNP/Indel位點(diǎn)。用QTLseqr程序?qū)颖具M(jìn)行BSA分析。分別計(jì)算每個(gè)混池的SNP指數(shù)及SNP指數(shù)差，并與顯著性閾值進(jìn)行比較獲得關(guān)聯(lián)標(biāo)記及染色體區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀統(tǒng)計(jì)

由表1可知， F₂ 群體的單株粒重平均值為 17.8g 高于親本YZ56（ 13.1g） 和YQ1（ 16.7g ，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)。由圖1、圖2可知， F₂ 群體的株高和單株粒重呈正態(tài)分布，且葉枯病率較低的個(gè)體在分布中占比較高。從Pearson相關(guān)分析來(lái)看，株高和單株粒重的相關(guān)系數(shù) （r） 為0.558（ Plt;0.000 1） ，株高和葉枯病率的相關(guān)系數(shù) （r） 為0.235 Plt;0.000 1 ，單株粒重和葉枯病率的相關(guān)系數(shù) （r） 為0.201（ P=0.002） ，3個(gè)性狀間存在極顯著相關(guān)性。分別從 F₂ 群體中篩選出株高極端單株42株、單株粒重極端單株45株、葉枯病抗性極端單株48株進(jìn)行混池測(cè)序分析。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及基因定位

每個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后，獲得約5000萬(wàn)條有效片段，產(chǎn)出約 15.00Gbp 的 Clean bas-es，測(cè)序深度（Depth）約為33X，質(zhì)控Q20大于97.00% ，序列GC含量大于 38.00% ，超 99.00% 的片段能比對(duì)到苦蕎參考基因組，覆蓋度（Coverage）大于 95.00% （表2）。利用親本間SNP開展基因定位分析，計(jì)算每個(gè)混池的SNP指數(shù)及SNP指數(shù)差（△SNP-index），在 95% 置信區(qū)間內(nèi)成功定位到與株高相關(guān)的10個(gè)QTL區(qū)域、與單株粒重相關(guān)的7個(gè)候選QTL區(qū)域以及與葉枯病抗性相關(guān)的6個(gè)候選QTL區(qū)域（表3，圖3）。

3 討論

蕎麥的株高與抗倒伏能力直接相關(guān)，株高越高，植株重心越高，倒伏風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加。在一定范圍內(nèi)，莖稈重心較低的甜蕎品種，其莖稈抗折力參數(shù)值大，倒伏指數(shù)小，抗倒伏能力強(qiáng)[10.1]。對(duì)甜蕎的株高和莖粗的遺傳分析發(fā)現(xiàn)，株高和莖粗的遺傳由2對(duì)主基因主導(dǎo)，同時(shí)存在加性-顯性多基因的修飾效應(yīng)，株高的主基因和多基因遺傳率高達(dá) 80% 以上，適合在低世代進(jìn)行選擇[12]。甜蕎株高和抗折力的遺傳以加性效應(yīng)為主，受主效基因控制，遺傳力較高，可以在早期世代進(jìn)行篩選[13]。本研究利用混池測(cè)序和BSA分析定位到10個(gè)與苦蕎株高相關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中第2和第4染色體上的QTL顯著性較高，達(dá)到 99% 置信區(qū)間，可能為主效基因位點(diǎn)，與上述基于表型遺傳分析的結(jié)果一致。

已明確病原的蕎麥病害超過(guò)10種，大多為真菌性病害，其中黑孢霉葉斑病由木穉黑孢霉引起，鏈格孢葉斑病由互格鏈格孢引起[14]，蕎麥葉枯病由鏈格孢屬病菌感染引起[15]。本研究發(fā)現(xiàn)蕎麥株高與葉枯病有極顯著相關(guān)性，后續(xù)的混池測(cè)序分析也在第2染色體同一區(qū)間定位到控制株高（ Π_qPH2.4） 和葉枯病抗性（qLB2.3）的基因位點(diǎn)，說(shuō)明該株高的基因與葉枯病抗性基因連鎖。此外，在第1染色體（qPH1.1，qGW1.1）和第8染色體（qPH8.2，qGW8.4）的相近區(qū)間定位到控制株高和單株粒重的基因位點(diǎn)。在后續(xù)的研究中，需要在定位到QTL的目標(biāo)區(qū)間開發(fā)SNP標(biāo)記，通過(guò)構(gòu)建分離群體進(jìn)行標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證QTL的遺傳效應(yīng)，篩選表型效應(yīng)值大且在不同環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)的QTL位點(diǎn)，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行功能解析。

蕎麥的單位面積產(chǎn)量與多個(gè)性狀相關(guān)?？嗍w的單位面積產(chǎn)量與株高（ 和單株產(chǎn)量（ 0.259）呈顯著相關(guān)[16]。而且苦蕎的單位面積產(chǎn)量與果殼厚度有極顯著的相關(guān)性[17]。甜蕎的單株粒重與單株粒數(shù)、單位面積產(chǎn)量均呈正相關(guān)關(guān)系[18]

4小結(jié)

本研究中蕎麥YQ1和YZ56的雜交后代株高與單株粒重存在極顯著相關(guān)性，育種中應(yīng)平衡株高、產(chǎn)量和抗倒伏性的關(guān)系，在維持高產(chǎn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)適度降低株高和增加莖粗來(lái)提高抗倒伏性。 F₂ 群體的單株粒重平均值為 17.8g ，高于親本 YZ56（13.1g） 和YQ1（16.7g） ，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。在實(shí)際育種中，適當(dāng)利用遠(yuǎn)緣種質(zhì)資源進(jìn)行雜交，整合高質(zhì)量蕎麥參考基因組[19.20]和本研究定位的QTL區(qū)間SNP位點(diǎn)信息，開發(fā)KASP標(biāo)記進(jìn)行QTL效應(yīng)驗(yàn)證，同時(shí)開展分子標(biāo)記輔助選擇育種，篩選兼具高產(chǎn)、抗倒伏和抗病特性的蕎麥新品系。

致謝

華智生物技術(shù)有限公司的葉昌榮、黃剛、李為國(guó)、陳哲紅等協(xié)助完成了試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析工作，在此表示感謝。

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（責(zé)任編輯雷霄飛）