七葉皂苷對RAW264.7巨噬細胞炎癥模型的作用研究

[摘要]"目的"研究七葉皂苷（Escin）對巨噬細胞極化因子、炎癥因子和炎癥相關(guān)通路的調(diào)控作用。方法"分別使用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μmol/L的Escin處理RAW264.7巨噬細胞，MTT法測定不同濃度Escin對細胞活性的影響；采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，根據(jù)處理方式將細胞分為6組：空白組、模型組（500ng/ml"LPS）、治療1組（500ng/ml"LPS+0.5μmol/L"Escin）、治療2組（500ng/ml"LPS+1.0μmol/L"Escin）、治療3組（500ng/ml"LPS+2.0μmol/L"Escin）、治療4組（500ng/ml"LPS+4.0μmol/L"Escin）。蛋白質(zhì)印跡法檢測Escin對LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated"protein"kinase，MAPK）信號通路的蛋白表達及巨噬細胞相關(guān)分子表達的影響。結(jié)果"0.5～5.0μmol/L"Escin對RAW264.7巨噬細胞沒有毒性。蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，4.0μmol/L"Escin顯著下調(diào)腫瘤壞死因子-α表達（Plt;0.05），0.5～4.0μmol/L"Escin顯著上調(diào)CD206和CD163的表達（Plt;0.05）；0.5～4.0μmol/L"Escin顯著下調(diào)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的表達（Plt;0.05），4.0μmol/L"Escin顯著下調(diào)c-Jun氨基端激酶的表達（Plt;0.05）。結(jié)論"Escin在體外可一定程度抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞M1型極化，促進M2型極化，并通過調(diào)控MAPK信號通路，發(fā)揮Escin對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用。

[關(guān)鍵詞]"七葉皂苷；抗炎；作用機制；RAW264.7巨噬細胞

[中圖分類號]"R967""""""[文獻標(biāo)識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.16.016

Study"on"the"effect"of"Escin"in"RAW"264.7"macrophage"inflammatory"model

HU"Yang，"SUN"Guangchen

College"of"Pharmacy，"Guilin"Medical"University，"Guilin"541199，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"study"the"regulatory"effects"of"Escin"on"macrophage"polarization"factors，"inflammatory"factors"and"inflammation-related"pathways."Methods"RAW"264.7"macrophages"were"treated"with"Escin"at"concentrations"of"0"，"0.5，"1.0，"2.0，"5.0，"10.0，"and"20.0"μmol/L"respectively."The"effects"of"different"concentrations"of"Escin"on"cell"viability"were"determined"by"the"MTT"assay."The"inflammation"model"of"RAW264.7"macrophages"was"induced"by"lipopolysaccharide"（LPS）."The"cells"were"divided"into"6"groups"according"to"treatment"methods："Blank"group，"model"group"（500ng/ml"LPS），"treatment"group"1"（500ng/ml"LPS+0.5μmol/L"Escin），"treatment"group"2"（500ng/ml"LPS+1.0μmol/L"Escin），"treatment"groupnbsp;3"（500ng/ml"LPS+2.0μmol/L），"and"treatment"group"4"（500ng/ml"LPS+4.0μmol/L"Escin）."Western"blotting"was"used"to"detect"the"effect"of"Escin"on"the"expression"of"mitogen-activated"protein"kinase"（MAPK）"signaling"pathway"proteins"and"the"expression"of"macrophagy-related"molecules"in"the"LPS-induced"RAW264.7"macrophage"inflammation"model."Results"0.5-5.0μmol/L"Escin"had"no"toxicity"to"RAW264.7"macrophages."The"results"of"the"Western"blotting"experiment"showed"that"4.0μmol/L"Escin"significantly"downregulated"the"expression"of"tumor"necrosis"factor–α"（Plt;0.05），"and"0.5-4.0μmol/L"Escin"significantly"upregulated"the"expressions"of"CD206"and"CD163"（Plt;0.05）."0.5-4.0μmol/L"Escin"significantly"downregulated"the"expression"of"extracellular"signal-regulated"kinase"（Plt;0.05），"and"4.0μmol/L"Escin"significantly"downregulated"the"expression"of"c-Jun"N-terminal"kinase"（Plt;0.05）."Conclusion"In"vitro，"Escin"can"to"a"certain"extent"inhibit"LPS-induced"M1-type"polarization"of"RAW264.7"macrophages，"promote"M2-type"polarization，"and"exert"the"therapeutic"effect"of"Escin"on"rheumatoid"arthritis"by"regulating"the"MAPK"signaling"pathway.

[Key"words]"Escin;"Anti-inflammatory;"Action"mechanism;"RAW"264.7"macrophage

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid"arthritis，RA）是一種病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病，可伴隨多系統(tǒng)損害。研究表明RA的發(fā)病與多種細胞表型和炎癥相關(guān)信號通路有關(guān)[1-2]。涉及的細胞主要包括巨噬細胞、滑膜細胞、成骨細胞和破骨細胞等[3-5]；涉及的分子機制包括Toll樣受體（Toll-like"receptor，TLR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated"protein"kinase，MAPK）信號通路和JAK-STAT信號通路等[6]。七葉皂苷（Escin）是由七葉樹干燥成熟的種子即傳統(tǒng)中藥娑羅子中提取的一類三萜皂苷化合物[7]。娑羅子具有寬中、理氣、殺蟲之功效，臨床多用于胸腹脹悶、胃脘疼痛等治療[8]。Escin作為其主要活性成分，具有抗炎、抗?jié)B出、抗腦水腫、抗腫瘤、增加靜脈張力、保護胃腸道等多種作用，亦可用于治療各類術(shù)后軟組織腫脹[9]。研究表明Escin可通過影響糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)信號分子、核因子κB信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor"alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β等炎癥因子的表達，在炎癥治療中發(fā)揮重要作用[10-12]。根據(jù)RA的發(fā)病機制與Escin的藥理作用，推斷Escin對RA有潛在治療作用，但目前國內(nèi)外并無報道Escin是否對巨噬細胞極化產(chǎn)生影響。本實驗通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞，在體外條件下研究Escin對巨噬細胞極化因子和MAPK信號通路的調(diào)控作用，探討Escin對RA的潛在治療機制。

1""材料與方法

1.1""實驗材料

1.1.1""實驗細胞""小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自武漢梓杉生物技術(shù)有限公司。

1.1.2""實驗試劑""Escin（貨號：wkq23021606）購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度97%。LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。噻唑藍、二甲基亞砜購自Solarbio公司。TNF-α（貨號：AF7014）購自江蘇親科生物研究中心有限公司。胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular"signal-regulated"kinase，ERK）1+ERK2（貨號：ab184699）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun"N-terminal"kinase，JNK）1+JNK2+JNK3（貨號：ab208035）、CD206（貨號：ab64693）、CD163（貨號：ab182422）、IL-10（貨號：ab189392）購自Abcam公司。p38（貨號：9212）購自Cell"Signaling"Technology公司。內(nèi)參GAPDH（貨號：6004-1-Ig）購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.1.3""實驗儀器設(shè)備""氣套式CO2培養(yǎng)箱購自Thermo"Fisher公司。光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司。光柵型連續(xù)波長酶標(biāo)儀購自NanoQuant公司。超聲波細胞破碎儀購自SONICS公司。

1.2""實驗方法

1.2.1""RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)""取處于對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞，采用臺盼藍法對活細胞進行計數(shù)，計算細胞數(shù)量。將細胞按照5×103/孔接種至96孔板中，貼壁培養(yǎng)過夜。分別使用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μmol/L的Escin處理細胞，培養(yǎng)24h。

1.2.2""MTT法檢測不同濃度Escin對細胞活性的""影響""按1.2.1方法接種細胞于96孔板并給藥后檢測細胞活性。每孔加入20μl"MTT（5mg/ml）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)基，每孔加入200μl二甲基亞砜，搖床避光室溫孵育15min，酶標(biāo)儀測定490nm處各組的光密度值，并計算細胞活力。

1.2.3""蛋白印跡實驗檢測炎癥因子及MAPK信號通路相關(guān)因子表達""將RAW264.7巨噬細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)過夜，使用不同濃度的Escin預(yù)處理2h后加入500ng/ml"LPS處理24h。根據(jù)處理方式將細胞分為6組：空白組、模型組（500ng/ml"LPS）、治療1組（500ng/ml"LPS+0.5μmol/L"Escin）、治療2組（500ng/ml"LPS+1.0μmol/L"Escin）、治療3組（500ng/ml"LPS+2.0μmol/L"Escin）、治療4組（500ng/ml"LPS+4.0μmol/L"Escin）。細胞冰浴裂解后低溫離心，提取細胞總蛋白，使用BCA試劑盒對細胞總蛋白進行蛋白定量，加入上樣緩沖液，100℃加熱10min；采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；加入封閉液室溫封閉2h；洗滌后，孵育一抗過夜（TNF-α稀釋比例1∶500，ERK稀釋比例1∶10"000，JNK稀釋比例1∶2000，CD206稀釋比例1∶1000，CD163稀釋比例1∶1000，IL-10稀釋比例1∶1000，p38稀釋比例1∶1000，GAPDH稀釋比例1∶50"000）；洗滌后，室溫孵育二抗1h；洗滌后，涂抹發(fā)光液成像儀顯影得到蛋白影像。通過Image"Lab軟件計算條帶灰度值。目標(biāo)蛋白表達水平以蛋白/內(nèi)參GAPDH的比值表示。

1.3""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"Statistics"20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad"Prism"8軟件進行作圖分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""Escin對RAW264.7巨噬細胞活性的影響

0、0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L的Escin并未對RAW264.7巨噬細胞的活性產(chǎn)生抑制作用，且0.5、1.0、2.0μmol/L的Escin可促進細胞增殖，10.0μmol/L的Escin造成細胞大量死亡，20.0μmol/L的Escin幾乎沒有細胞存活，見圖1。以上結(jié)果表明0.5～5.0μmol/L的Escin對RAW264.7巨噬細胞不具備細胞毒性。但5.0μmol/L"Escin給藥后，部分實驗孔中觀察到Escin對細胞造成輕微損傷，故選擇0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L的Escin進行后續(xù)實驗。

2.2""Escin對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞極化相關(guān)蛋白及炎癥因子表達的影響

與空白組相比，模型組的CD206、CD163、TNF-α、IL-10表達均顯著上調(diào)（Plt;0.05）。與模型組相比，4.0μmol/L"Escin顯著下調(diào)TNF-α表達（Plt;0.05），其他濃度Escin處理后，TNF-α表達未見顯著變化；0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L"Escin均顯著上調(diào)CD206和CD163表達（Plt;0.05）；經(jīng)Escin處理后，IL-10表達未見顯著變化，見圖2。

2.3""Escin抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達

模型組的ERK和JNK表達水平顯著高于空白組（Plt;0.05）。與模型組比較，0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L"Escin顯著下調(diào)ERK表達（Plt;0.05）；4.0μmol/L"Escin顯著下調(diào)JNK表達（Plt;0.05）；Escin處理對p38的表達沒有影響，見圖3。

3""討論

生物出現(xiàn)組織損傷時，巨噬細胞聚集并向不同的細胞表型和功能狀態(tài)分化，引起炎癥反應(yīng)，同時炎癥因子又可通過反饋機制激活單核細胞、巨噬細胞促進炎癥反應(yīng)[13-15]。巨噬細胞分兩類極化狀態(tài)：M1型巨噬細胞主要產(chǎn)生TNF-α和IL-1等，可造成關(guān)節(jié)損傷；M2型巨噬細胞分泌抗炎細胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等，有助于血管生成、組織重塑和修復(fù)[16-17]。巨噬細胞M1/M2的不平衡影響RA進程，調(diào)節(jié)M1/M2平衡有助于控制RA病情[18]。

為深入研究Escin對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中M1/M2極化的影響，本研究首先評估Escin對RAW264.7巨噬細胞活性的作用。結(jié)果顯示0.5～5.0μmol/L"Escin對RAW264.7巨噬細胞均無顯著細胞毒性效應(yīng)。然而，在5.0μmol/L"Escin處理組中，觀察到Escin對細胞造成輕微損傷。此外，后續(xù)實驗中LPS誘導(dǎo)亦會對細胞產(chǎn)生一定程度的損傷。因此，為防止細胞損傷對實驗結(jié)果造成影響，本研究未采用5.0μmol/L"Escin濃度，而是選擇0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L"Escin進行后續(xù)實驗。

TNF-α是重要的炎癥因子，TNF-α升高誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化。本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞后促炎因子TNF-α表達升高，表明LPS刺激后使巨噬細胞向M1型極化；Escin處理后TNF-α表達降低，表明Escin可抑制巨噬細胞向M1型極化。CD206和CD163是M2型巨噬細胞標(biāo)志物，其表達在巨噬細胞受到LPS刺激后向M1型極化時理應(yīng)呈現(xiàn)下降趨勢。然而，現(xiàn)有研究指出在LPS刺激作用下，細胞內(nèi)IL-10表達量增加，促進巨噬細胞向M2型極化，增加M2型巨噬細胞標(biāo)志物分泌[19]。本研究中，LPS刺激巨噬細胞后IL-10表達升高，進而導(dǎo)致CD206與CD163表達量增加。經(jīng)Escin處理后CD206和CD163表達進一步升高，而IL-10表達未顯示出明顯變化。表明巨噬細胞向M2型極化的趨勢得到加強。Escin能抑制巨噬細胞向M1型極化，促進巨噬細胞向M2型極化，減輕炎癥癥狀。

研究表明RA發(fā)病的分子機制包括多種信號通路，其中MAPK信號通路的激活可導(dǎo)致炎癥，MAPK信號通路可激活包括p38、ERK、JNK等在內(nèi)的多種信號通路[20]。MAPK信號通路激活可活化轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白家族成員c-Fos和c-Jun，活化后的c-Fos和c-Jun可促進M1型巨噬細胞炎癥因子的合成釋放，在激活MAPK信號通路時，還可激活核因子κB信號通路。因此，抑制MAPK信號通路可起到雙重抗炎效果，有效治療RA[21]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激RAW264.7巨噬細胞后，ERK和JNK表達均上調(diào)，表明MAPK信號通路激活；經(jīng)Escin處理后ERK和JNK的表達均顯著下調(diào)，表明Escin可抑制MAPK信號通路的蛋白表達，通過調(diào)控MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Escin在體外可一定程度抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞M1型極化，促進M2型極化，并通過調(diào)控MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用，為Escin應(yīng)用于RA治療提供一定的依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–18）

（修回日期：2025–05–15）