壯藥石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠血壓的影響

[摘要]"目的""探討壯藥石崖茶對N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine"methyl"ester，L-NAME）誘導高血壓大鼠血壓的影響。方法"采用L-NAME誘導高血壓大鼠模型，分為空白組、模型組、卡托普利組及石崖茶高、中、低劑量組。大鼠連續(xù)灌胃給藥4周，每周測量大鼠血壓1次。腹腔注射麻醉，采集血液樣本，取材。采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠胸主動脈組織的病理變化，蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠胸主動脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial"nitric"oxide"synthase，eNOS）蛋白表達水平，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血漿eNOS含量，一步還原法檢測大鼠血漿中一氧化氮（nitric"oxide，NO）含量。結(jié)果"與模型組比較，石崖茶高、中劑量組與卡托普利組大鼠的收縮壓和舒張壓均顯著降低（Plt;0.01），心率變化無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。石崖茶灌胃4周后，高、中劑量組大鼠的血管損傷得到明顯改善，胸主動脈eNOS蛋白表達明顯增加（Plt;0.01），血漿中eNOS、NO含量顯著增加（Plt;0.01）。結(jié)論"壯藥石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠有降壓作用，可能與其對eNOS基因、NO的表達調(diào)節(jié)有關。

[關鍵詞]"石崖茶；N-硝基-L-精氨酸甲酯；高血壓；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；一氧化氮

[中圖分類號]"R285.5；R544.1""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.15.001

Effect"of"Zhuang"medicine"Adinandra"nitida"on"blood"pressure"of"hypertensive"rats"induced"by"L-NAME

LUO"Xuelan1，"ZHOU"Weiqian2，"YANG"Peng3，"MO"Guojun4，"OU"Hesheng3

1.Zhuang"and"Yao"Pharmaceutical"Preparation"Center，"International"Zhuang"Medicine"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Chinese"Medicine，"Nanning"530201，"Guangxi，"China;"2."Key"Laboratory"of"Zhuang"Yao"Medicine，"International"Zhuang"Medicine"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Chinese"Medicine，"Nanning"530201，"Guangxi，"China;"3."Ministry"of"Science"and"Technology，"International"Zhuang"Medicine"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Chinese"Medicine，"Nanning"530201，"Guangxi，"China;"4."Pharmaceutical"Department，"The"Second"Affiliated"Hospital"of"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530007，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effect"of"Zhuang"medicine"Adinandra"nitida"on"blood"pressure"of"hypertensive"rats"induced"by"N-nitro-L-arginine"methyl"ester"（L-NAME）."Methods"L-NAME"was"used"to"induce"hypertension"rats"model，"they"were"divided"into"blank"group，"model"group，"captopril"group，"and"high，"medium，"and"low"dose"groups"of"Adinandra"nitida."The"rats"were"continuous"gavaged"for"4"weeks，"and"the"blood"pressures"were"measured"once"a"week."Rats"were"anesthetized"by"intraperitoneal"injection，"blood"samples"and"tissues"were"collected."Pathological"changes"of"the"rat"thoracic"aortic"tissue"were"observed"by"hematoxylin"eosin"staining，"the"protein"expression"level"of"endothelial"nitric"oxide"synthase"（eNOS）"in"rat"thoracic"aorta"was"detected"by"western"blotting，"the"content"of"eNOS"in"rat"plasma"was"measured"by"enzyme"linked"immunosorbent"assay"and"nitric"oxide"（NO）"content"in"rat"plasma"was"detected"by"one-step"reduction"method."Results"Compared"with"model"group，"high"and"medium"dose"groups"of"Adinandra"nitida"and"captopril"group"of"rats"showed"significant"reductions"in"systolic"blood"pressure"and"diastolic"blood"pressure"（Plt;0.01），"while"there"were"no"statistically"significant"change"in"heart"rate"（Pgt;0.05）."After"4"weeks"of"oral"administration"with"Adinandra"nitida，"the"damage"of"the"vascular"tissues"of"hypertensive"rats"induced"by"L-NAME"had"been"improved，"the"expression"of"eNOS"protein"in"thoracic"aorta"was"significantly"increased"（Plt;0.01），"and"the"contents"of"eNOS"and"NO"in"rat"plasma"were"significantly"increased"（Plt;0.01）."Conclusion"Zhuang"medicine"Adinandra"nitida"has"a"hypotensive"effect"on"L-NAME"induced"hypertensive"rats，"which"may"be"related"to"the"regulation"of"eNOS"and"NO.

[Key"words]"Adinandra"nitida;"N-nitro-L-arginine"methyl"ester;"Hypertension;"Endothelial"nitric"oxide"synthase;"Nitric"oxide

高血壓是一種臨床綜合征，其特征是全身動脈壓和外周小動脈阻力增加，并伴有心臟、大腦、腎臟和其他器官的功能性或器質(zhì)性損傷，同時是心血管疾?。╟ardiovascular"diseases，CVD）發(fā)生發(fā)展的主要危險因素[1]。根據(jù)《中國心血管健康與疾病報告2022》[2]要點解讀，推算目前中國CVD患病人數(shù)約3.3億，其中高血壓患病人數(shù)為2.45億，且人數(shù)仍在增長。預計2025年全球高血壓患者人數(shù)將達15.6億（15.4億～15.8億）[3]。因此，尋找可能的降壓藥物特別是天然的降壓藥物成為研究的重點。

石崖茶學名亮葉黃瑞木Adinandra"nitida"Merr.ex"H.L.Li，系山茶科Theaceae楊桐屬Adinandra"Jack植物的干燥葉[4]。野生石崖茶主要分布在廣西、貴州等地，資源豐富，保健和藥用價值高[5]。石崖茶香氣濃郁，味微苦，后回甘，具有清熱解毒、消炎潤肺、調(diào)脂降壓及健胃消食等作用[6-8]。已有研究者對石崖茶的化學成分進行分析，然而對石崖茶的藥理作用研究甚少，未見其降壓作用和機制的相關研究[9]。本研究初步探討石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠的降壓作用及可能分子機制，以期為石崖茶的深入研究提供理論依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""實驗動物

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量150～180g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK（湘）2021-0002]。大鼠適應性飼養(yǎng)1周，自由飲水和進食，飼養(yǎng)條件和實驗內(nèi)容符合實驗動物的倫理要求，實驗過程嚴格遵守《實驗動物管理條例》。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：DW20220621-131）。

1.2""藥物試劑和儀器

實驗用野生石崖茶（產(chǎn)地廣西金秀）經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院陳松主任藥師鑒定為山茶科楊桐屬植物亮葉黃瑞木的干燥葉。槲皮苷購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈分析純購自西隴科學股份有限公司；卡托普利片購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；L-NAME購自美國APExBIO公司；"eNOS抗體購自武漢三鷹生物有限公司；山羊抗兔二抗購自美國Affinity公司；增強型化學發(fā)光（enhanced"chemiluminescence，ECL）高敏顯影液購自武漢莫納生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic"acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（增強型）購自上海碧云天生物技術股份有限公司；一氧化氮（nitric"oxide，NO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠無創(chuàng)尾動脈血壓計購自美國IITC公司；高效液相色譜儀Agilent"1260"InfinityⅡ購自德國Agilent公司；Multiskan"SkyHigh酶標儀購自美國賽默飛公司；Bio-Rad電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Image"Quant"800超靈敏凝膠成像儀購自美國AMERSHAM公司。

1.3""方法

1.3.1""試藥制備""取石崖茶2.5kg打成粗粉，加入10倍量純化水，浸泡30min，之后回流提取60min，過濾，沉渣再加8倍量純化水，繼續(xù)回流提取60min，過濾，將2次回流提取所得濾液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮烘干，得到石崖茶提取物（得率為48.97%），分裝后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2""高效液相色譜法檢測石崖茶提取物槲皮苷含量""精密稱取槲皮苷1.03mg，置于10ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作為槲皮苷對照品，濃度為0.0963mg/ml。石崖茶提取物粉碎后過2號篩，稱取粗粉2.1073g，加入甲醇20ml，超聲震蕩30min，取上清液，根據(jù)文獻方法測定其槲皮苷含量[10]。

1.3.3""動物造模與分組""60只SD大鼠適應喂養(yǎng)1周后，連續(xù)測試3d基準血壓。隨機選取10只作為正常對照組（空白組），正常飲食、自由飲水；其余50只大鼠參考文獻[11]所述每天腹腔注射L-NAME制作高血壓大鼠模型，注射量為25mg/kg，連續(xù)注射4周，每周測定血壓1次。根據(jù)處理，實驗動物按血壓均值隨機分為模型組、卡托普利組和石崖茶（高、中、低）劑量組。隨后各組按1ml/100g灌胃，每天灌胃1次，其中空白組和模型組灌胃生理鹽水，卡托普利組灌胃5mg/kg卡托普利（生理鹽水配制），石崖茶（高、中、低）劑量組分別以12.0g/kg、6.0g/kg和1.0g/kg的石崖茶水提物灌胃。灌胃處理4周，其間造模成功的高血壓大鼠繼續(xù)注射L-NAME。

1.3.4""大鼠血壓及心率測定""大鼠的血壓及心率采用尾套法無創(chuàng)尾動脈血壓計測定，測試溫度設置為30～35℃，保溫時間約20min，每周測定1次。記錄收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及心率等參數(shù)值，單只大鼠保持穩(wěn)定狀態(tài)下連續(xù)測量3～5次，取平均值。

1.3.5""血樣采集和取材""大鼠灌胃4周后，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹動脈取血注入含肝素鈉的真空采血管中，4℃"3000轉(zhuǎn)/min離心15min，分離血漿保存于–80℃超低溫冰箱。取大鼠胸主動脈血管組織并剪取部分（長度約5mm）浸泡在4%多聚甲醛溶液中，剩余組織保存于–80℃超低溫冰箱。

1.3.6""蘇木精-伊紅染色觀察血管組織形態(tài)變化""將固定于4%多聚甲醛溶液48h以上的胸主動脈血管組織取出，常規(guī)脫水修整，石蠟包埋。選擇靠近主動脈弓一端連續(xù)行5μｍ切片，然后經(jīng)甲苯脫蠟、乙醇脫水及蒸餾水洗滌后，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin"eosin，HE）染色。應用正置顯微鏡觀察胸主動脈血管組織的病理學變化，并用軟件Image"J計算各組大鼠血管中膜厚度和橫截面積。

1.3.7""蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠胸主動脈eNOS蛋白表達水平""取保存的大鼠胸主動脈血管組織，液氮研磨，加入適量裂解液冰上裂解20min，4℃"12"000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，采用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，樣本加入上樣緩沖液后95℃水浴5min變性。根據(jù)BCA結(jié)果計算上樣量，然后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉，加入相應一抗稀釋液（1∶500），4℃孵育過夜。第2天用TBST緩沖液洗3次，5min/次。加入二抗（1∶1000），室溫避光孵育1h，TBST緩沖液洗3次，5min/次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，ECL顯影后成像，并用Image"J軟件分析蛋白的表達量。

1.3.8""酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿eNOS含量""嚴格按酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme"linked"immunosorbent"assay，ELISA）檢測試劑盒說明書操作，制備各組樣品，測定各組血漿樣品的吸光度（optical"density，OD）值，并應用ELISA"calc專用軟件繪制標準曲線和計算劑量。

1.3.9""一步還原法檢測血漿NO含量""嚴格按硝酸還原法試劑盒說明書制備各組樣品，應用酶標儀測定波長550nm處各組血漿樣品的OD值，并按說明書計算各組NO含量。

1.4""統(tǒng)計學方法

采用Excelnbsp;2016版軟件進行數(shù)據(jù)處理，SPSS"20.0軟件進行單因素方差分析，采用GraphPad"Prism"8.0.2軟件作圖。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（"）表示，比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2""結(jié)果

2.1""壯藥石崖茶提取物槲皮苷含量測定

采用高效液相色譜法測定石崖茶的代表性成分槲皮苷含量。色譜條件：色譜柱為TC-C18，流動相為乙腈–0.1%磷酸（20∶80），流速為5.0ml/min，檢測波長254nm，進樣量10μl。樣品中各組分達到基線分離，其他成分對槲皮苷的測定無干擾。結(jié)果槲皮苷平均含量為3.03mg/ml，相對標準偏差為1.6%，見圖1。

2.2""壯藥石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠血壓及心率的影響

結(jié)果顯示在注射L-NAME造模期間，空白組大鼠血壓基本維持穩(wěn)定，其余各組大鼠血壓明顯升高，4周后所有造模大鼠收縮壓均gt;140mmHg"（1mmHg=0.133kPa）或舒張壓gt;100mmHg，造模成功。石崖茶灌胃治療4周后，與空白組比較，模型組大鼠血壓明顯升高；與模型組比較，石崖茶高、中劑量組大鼠收縮壓和舒張壓均顯著降低（Plt;0.01）。實驗過程中各組大鼠的心率均有所波動，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），見表1和表2。

2.3""壯藥石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠胸主動脈血管組織病理學的影響

HE染色結(jié)果顯示空白組大鼠胸主動脈血管壁厚薄均衡，內(nèi)膜光滑、完整，中膜平滑肌細胞無增生，見圖2。模型組大鼠胸主動脈血管壁明顯增厚，內(nèi)膜明顯凸起，內(nèi)皮細胞腫脹有破裂，中膜平滑肌增生明顯?？ㄍ衅绽M胸主動脈血管壁厚薄基本均衡，內(nèi)膜基本光滑，中膜平滑肌細胞未見明顯增生。石崖茶灌胃4周后，與模型組比較，高、中劑量組胸主動脈血管壁增厚、內(nèi)膜凸起損傷及中膜平滑肌增生均得到顯著改善。與石崖茶高、中劑量組比較，低劑量組胸主動脈血管內(nèi)皮細胞雖未見腫脹，但凸起明顯，中膜平滑肌有明顯增生。與空白組比較，模型組大鼠胸主動脈中膜厚度和中膜橫截面積均明顯增加（Plt;0.01）；與模型組比較，石崖茶高、中劑量組大鼠胸主動脈中膜厚度和中膜橫截面積均顯著減少（Plt;0.01），見表3。

2.4""壯藥石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠胸主動脈eNOS表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠的胸主動脈eNOS蛋白表達水平明顯降低（Plt;0.01）；與模型組比較，壯藥石崖茶高、中劑量組及卡托普利組大鼠的胸主動脈eNOS蛋白表達量均顯著增加（Plt;0.01），見圖3。

2.5""壯藥石崖茶對L-NAME誘導高血壓大鼠血漿eNOS和NO含量的影響

大鼠血漿eNOS和NO含量檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的血漿eNOS和NO含量均明顯下降（Plt;0.01）；與模型組比較，石崖茶高、中劑量組及卡托普利組大鼠的血漿eNOS和NO含量顯著升高（Plt;0.01），見圖4。

3""討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①石崖茶高、中劑量可降低由L-NAME誘導高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓，且不影響L-NAME誘導高血壓大鼠的心率；②石崖茶高、中劑量對L-NAME誘導高血壓大鼠的動脈損傷有保護作用；③石崖茶高、中劑量可有效提高由L-NAME誘導高血壓大鼠的胸主動脈eNOS蛋白表達及血漿eNOS和NO含量。

石崖茶的化學成分有黃酮類、酚類及多糖等，其中黃酮類成分含量最高，包括山茶苷A、槲皮苷等。皮振宇等[12]通過HPLC指紋圖譜和網(wǎng)絡藥理學對石崖茶質(zhì)量標志物（Q-Marker）預測分析，顯示槲皮苷是其5個主要差異性成分之一，可作為石崖茶的潛在Q-Marker。因此，本研究以槲皮苷為對照品，對石崖茶水提物樣品進行高效液相色譜分析。

高血壓是多種心血管疾病的重要致病因素，長期處于高血壓狀態(tài)，可導致心臟、血管損傷，引起心肌肥厚、血管壁增厚等[13-14]。本研究連續(xù)4周腹腔注射L-NAME，大鼠血壓升高，達到高血壓水平。繼續(xù)注射L-NAME至第8周，模型組大鼠血壓維持高血壓狀態(tài)，血管壁明顯增厚，內(nèi)膜明顯凸起，內(nèi)皮細胞腫脹有破裂，中膜平滑肌明顯增生，結(jié)果基本與已有研究一致[11]。灌胃石崖茶后，大鼠血壓逐漸下降，血管損傷得到一定恢復，說明石崖茶具有一定的降壓作用和保護靶組織的功能。

L-NAME是一種非特異性NO合成酶抑制劑，使用后可顯著降低血漿eNOS、NO含量，進而引起血壓升高和心臟重構[15]。此外，L-NAME誘導的高血壓使處于血管壁內(nèi)層的內(nèi)皮細胞受損，進一步影響eNOS基因的表達。本研究中模型組大鼠eNOS蛋白表達下降，血漿eNOS、NO含量也降低，高、中劑量石崖茶灌胃后，大鼠血管eNOS蛋白表達、血漿eNOS、NO含量明顯增加。石崖茶可通過保護血管內(nèi)皮的完整性提高eNOS基因表達，增加血漿eNOS和NO含量，有效改善大鼠的高血壓狀態(tài)。然而，石崖茶的降壓作用是何種成分在發(fā)揮作用及可能分子機制尚需進一步探討。

綜上，壯藥石崖茶可有效降低L-NAME誘導高血壓大鼠的血壓，保護血管的完整性，其分子機制可能與血管eNOS基因的表達及血漿eNOS、NO作用相關。本研究可為壯藥石崖茶抗高血壓的藥用價值提供一定理論基礎，同時也為壯藥石崖茶有效成分進一步臨床應用提供實驗依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–02–15）

（修回日期：2025–05–12）