瑪卡總皂苷促人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞凋亡作用研究

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 1007-7731（2025）09-0111-05

DOI號(hào) 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.09.024

AbstractTo investigate the effct and mechanism of Lepidium meyenii Walp.saponin （LMS） in promoting apoptosis ofhumanretinoblastoma Y79cels，Lepidium meyenii Walp.wasusedas theexperimentalmaterial to extract its saponins.Y79 cells were treated with different concentrations of LMS （O，10O，2OO，400，and 8 0 0 μ g / m L ），and the effcts ofLMSonY79cellproliferationandapoptosisatdiffrent treatmenttimes （24，48，and72h）weredetected.The expression levels of pro-apoptotic factors， including Caspase ， Caspase-8， and Caspase genes and proteins， were measured.The results showed that 2.58 g of total saponins were extracted from 5O g of maca dry powder，with an extraction yield of 5 . 1 6 % . LMS treatment inhibited the proliferation of Y79 cells and induced their apoptosis，with the optimal effect observed at 4 0 0 μ g / m L for 48 h，resulting in a cell viability rate of 5 4 . 0 5 % and an apoptosis rate of 2 1 . 8 7 % .Under these conditions，LMS promoted the expression of Caspase-3，Caspase ，and Caspase-9 genes and upregulated the expression of Cleaved caspase ， Cleaved caspase-8，and Cleaved caspase proteins.In conclusion， LMS can inhibit theproliferation of Y79cellsand induce their apoptosis，and its mechanism maybe related to the upregulation of pro-apoptotic factors Caspase ，Caspase-8， and Caspase

Keywords retinoblastoma; Lepidium meyenii Walp.saponin; cell proliferation; cell apoptosis

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤也稱視網(wǎng)膜惡性膠質(zhì)瘤（Retinoblastoma，RB），是由于抑癌基因RB1突變或缺少引發(fā)的嬰幼兒眼內(nèi)惡性腫瘤之一[]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤隨著病情的惡化，可能會(huì)導(dǎo)致失明，甚至危及生命[2-3]?，斂ǎ↙epidiummeyeniiWalp.）是一種十字花科一年生草本藥食同源植物，其具有緩解疲勞、抗氧化、抗衰老等多種作用[4-5]。楊采霞等研究表明，瑪卡復(fù)方提取物不會(huì)損傷小鼠的肝腎組織且對(duì)游泳力竭小鼠具有抗疲勞作用。史俊友等從瑪卡中提取出了較多的抗氧化成分。

皂昔作為一種天然活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。祝明濤等研究指出，植物皂苷具抗腫瘤活性。李月等利用乙醇回流法成功提取了瑪卡總皂苷（LepidiummeyeniiWalp.saponin，LMS）。目前，關(guān)于LMS抗腫瘤活性的研究有待深入，本研究以LMS為試驗(yàn)藥物，處理人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞，探究LMS對(duì)其凋亡的誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)皂苷類抗人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤天然藥物提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞株（貨號(hào)SNL-532），購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司?，斂?，購(gòu)自云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為十字花科植物瑪卡的干燥根莖。

1.2試驗(yàn)試劑與儀器

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、蛋白質(zhì)免疫印跡發(fā)光試劑，均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清，均購(gòu)自Thermoscientific公司；增強(qiáng)型CCK-8試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、HiScrip ⅡIQ RT SuperMiX for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQTMSYBR qPCRMaster MiX試劑盒，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司； β - 肌動(dòng)蛋白（β-actin）單抗、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleavedcaspase ）單抗（14220S）、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8（Cleavedcaspase-8）單抗、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Cleavedcaspase-9）單抗，均購(gòu)自CST公司;羊抗兔二抗，購(gòu)自武漢ABclonaltechnology公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)公司；其他試劑均為

國(guó)產(chǎn)分析純。

GelDocXR型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）;Trans-BlotSDcellWestern轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）;MB-530型酶標(biāo)儀（深圳匯松科技公司）;SW-CJ-2F型潔凈操作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；HF212型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海申力儀器公司）；CKX53型顯微鏡（OlympusCorporation）；ND2000微量分光光度儀（ThermoFisher）；Stepone Real-Time PCR System（ThermoFisher）;MiniChemiK4型化學(xué)發(fā)光儀（北京賽智科技公司）；ACEA NotoCyteTM Flow cytometer（ACEABiosciences Inc.）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1LMS的提取 參照文獻(xiàn)[9]的方法提取LMS，取一定質(zhì)量的瑪卡粉末（80目），3倍體積石油醚脫脂，離心，濾渣4 0℃烘干，采用 5 0 % 乙醇，料液比 ）， ，提取 ，離心收集上清液，旋蒸濃縮，冷凍真空干燥，得LMS。采用人參皂苷Rb1作為標(biāo)準(zhǔn)品，以吸光度為 x ，總皂苷質(zhì)量濃度為 y ，參考文獻(xiàn)[10]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同法制作LMS檢測(cè)液，以去離子水作參照，測(cè)定 5 5 0 n m 波長(zhǎng)處LMS的吸光度值，代入人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算LMS質(zhì)量濃度 （ ρ ） ，LMS的得率 （ Y ） 計(jì)算如式（1）。

式（1）中， Y 為L(zhǎng)MS得率， %：ρ 為L(zhǎng)MS質(zhì)量濃度， 0 V 為L(zhǎng)MS提取液總體積， m L; m 為瑪卡原料質(zhì)量， g; N 為L(zhǎng)MS的稀釋倍數(shù)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及LMS溶液配制 采用RPMI1640完全培養(yǎng)基， 培養(yǎng)Y79細(xì)胞，細(xì)胞密度 8 0 % 左右進(jìn)行傳代及實(shí)驗(yàn)。采用RPMI1640完全培養(yǎng)基作為溶劑，配制初始濃度為 8 0 0 μ g / m L 的LMS溶液，除菌過(guò)濾后備用。

1.3.3細(xì)胞增殖檢測(cè) 將 1 0 0 μ L 的 個(gè) / m L Y79細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，采用細(xì)胞存活率反映LMS（LMS）對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響。試驗(yàn)分為正常培養(yǎng)的Y79細(xì)胞組（對(duì)照組），不同濃度LMS試驗(yàn)組，以及只有完全培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組每孔加入 9 0 μ L RPMI1640完全培養(yǎng)基，試驗(yàn)組每孔加入 9 0 μ L LMS溶液，濃度分別為

1 0 0 ， 2 0 0 ， 4 0 0 ， 8 0 0 μ g / m L ，分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入 CCK-8試劑，于 （2 培養(yǎng)箱中孵育 ，冷卻至室溫后，酶標(biāo)儀檢測(cè) 波長(zhǎng)處的吸光度值。細(xì)胞存活率 R 計(jì)算如式（2）。

式（2）中， R 為細(xì)胞存活率， 為實(shí)驗(yàn)組吸光度值； 為對(duì)照組吸光度值； 為空白組吸光度值。1.3.4細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取六孔板，每孔接入 1 × 個(gè)Y79細(xì)胞，培養(yǎng) ，棄培養(yǎng)液。試驗(yàn)組加入LMS培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等體積的RPMI1640完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)分別培養(yǎng) $2 4 、 4 8 、 7 2 h ， 1" 0 0 0m i n 離心 5 m i n 收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，每孔加入

1 0 0 μ L 1 × Bindingbuffer重懸細(xì)胞，加人 AnnexinV-FITC和PI混勻，避光室溫反應(yīng) 1 0 m i n ，加入 4 0 0 μ L 1 × Bindingbuffer混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5基因表達(dá)量檢測(cè) 取六孔板，每孔接入 1 × 個(gè)Y79細(xì)胞，培養(yǎng) 離心 5 m i n 收集細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法提取RNA和合成cDNA。選取β -actin基因作為內(nèi)參，采用熒光定量PCR檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 m i n ；隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（95℃變性 退火 1 5 s 延伸60s；反應(yīng)結(jié)束后采集各樣本的Ct值。 計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。采用NCBIPrimer-BLAST工具進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，各基因引物序列見(jiàn)表1。

1.3.6蛋白表達(dá)量檢測(cè) 取六孔板，每孔接入 1 × 個(gè)Y79細(xì)胞，培養(yǎng) 后，每孔加入適量的蛋白裂解液， 裂解 3 0 m i n ， 離心1 0 m i n ，收集上清，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜， 5 % 脫脂牛奶封閉PVDF膜2小時(shí)， 一抗 孵育過(guò)夜，TBST（Tris-borate-sodiumtween-20）緩沖液洗PVDF膜3次，每次 3 m i n 1：2000二抗室溫孵育 ，置于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫化學(xué)發(fā)光顯影。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LMS的提取得率

按照參考文獻(xiàn)[10]繪制人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程 表明在 范圍內(nèi)，人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度與吸光度值呈線性關(guān)系。準(zhǔn)確稱取 瑪卡干粉，按照試驗(yàn)方法提取LMS，可獲得 精制LMS，提取得率為 5 . 1 6 % 。

2.2LMS對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，LMS處理Y79細(xì)胞 2 4 h 后，100、2 0 0 μ g / m L 組的細(xì)胞存活率分別為 9 3 . 3 7 % . 8 9 . 1 3 % ，與對(duì)照組相比 （ 0 μ g / m L） ，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P gt; 0.05）; 4 0 0 ， 8 0 0 μ g / m L 組的細(xì)胞存活率分別為7 8 . 2 7 % . 3 1 . 9 3 % ，明顯低于對(duì)照，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ）。LMS處理Y79細(xì)胞48和 后，不同濃度LMS均能降低Y79細(xì)胞的存活率，且與對(duì)照差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ ，以 4 0 0 ， 8 0 0 μ g / m L 的降低作用更明顯（ P lt; 0 . 0 1 ）。綜合考慮，后續(xù)選取濃度 4 0 0 μ g / m L 的LMS開(kāi)展試驗(yàn)。

2.3LMS對(duì)Y79細(xì)胞凋亡的影響

由圖1可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細(xì)胞，與對(duì)照組相比，LMS組細(xì)胞的凋亡、壞死明顯增多。隨著LMS干預(yù)時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。由表3可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細(xì)胞24、48和 后，細(xì)胞凋亡率分別為 1 5 . 5 9 % . 2 1 . 8 7 % 和2 9 . 0 0 % ，與對(duì)照差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ （ P lt; 0 . 0 1 ） 。表明LMS可促進(jìn)Y79細(xì)胞凋亡。

2.4LMS對(duì)Y79細(xì)胞基因表達(dá)量的影響

由圖2可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細(xì)胞 后，LMS組細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0 . 0 5 ） 。表明LMS可上調(diào)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表達(dá)。

2.5LMS對(duì)Y79細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知， 4 0 0 μ g / m L 的LMS處理Y79細(xì)胞 后，LMS組Y79細(xì)胞Cleavedcaspase 、Cleavedcaspase 和Cleavedcaspase 蛋白的表達(dá)量高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （ P lt; 0 . 0 5 ） 。該結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果相符，表明LMS可能通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase 和Caspase-9的表達(dá)，誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡。

3結(jié)論與討論

目前對(duì)RB的治療主要采用激光光凝術(shù)及眼動(dòng)脈化療、玻璃體腔內(nèi)化療等]。大多化療藥物具有較大的副作用，中藥治療具有療效好、副作用小和價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)[12]。本研究探討了LMS對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)LMS可抑制Y79細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，表明LMS可能具有開(kāi)發(fā)抗RB治療藥物的潛力。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要家族之一[13]，其中Caspase-8是啟動(dòng)凋亡的重要因子，活化的Caspase-8（Cleavedcaspase-8）可引起Caspase成員的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)蛋白及相關(guān)功能蛋白，從而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。活化的Caspase-9（Cleavedcaspase-9）可裂解細(xì)胞生長(zhǎng)蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。Caspase-3幾乎參與了所有的調(diào)亡過(guò)程，活化的Caspase-8 和Caspase-9 能夠激活Caspase-3（Cleaved caspase ）從而加速細(xì)胞凋亡[]。本研究結(jié)果顯示，LMS可促進(jìn)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表達(dá)，上調(diào)Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-8和Cleavedcaspase-9蛋白的表達(dá)，表明LMS可能通過(guò)促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究探討了LMS對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，LMS可抑制Y79細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因和蛋白表達(dá)量上調(diào)有關(guān)。研究結(jié)果為L(zhǎng)MS作為臨床上治療RB的新型藥物的開(kāi)發(fā)提供參考。

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（責(zé)任編輯.坦立菜）