煙草根黑腐病菌生防菌BM-03的防效及其發(fā)酵特性分析

Screening and fermentation characteristics of biocontrol bacterium BM-O3 antagonistic to Fusariumsolani

LI Xiang1HAO Haohao1WU Junlin1XU Xiaojing1ZHAO Jiajia1SUNHuizhong2 （1Zhumadian Branch of Henan Provincial Tobacco Company，Zhumadian 463ooo， China； 2College of Agriculture，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471OO3， China）

AbstractUsing plate isolation and antagonism assay techniques，a strain （designated as BM-O3）antagonistic to Fusarium solani （causalagent of tobacco root blackrot）was isolated fromtobacco rhizosphere soil.Its biocontrol effcacy wasvalidatedthrough potexperiments，and its fermentationcharacteristics weredetermined.ResultsshowedthatBM-03 exhibited an inhibition rate of 52.78% against F .solani in plate antagonism tests，while pot experiments demonstrated a biocontrol efficacy of 78.03% against root black rot. Further fermentation characterization revealed that inorganic salts had minimal impact onBM-O3’s fermentation，whereas soluble starch，yeast extract powder，and soybean meal were identified as optimal nutrients for itsgrowthand fermentation.The optimized fermentation medium wereas follws： soluble starch 30g ， soybean meal 6 g， yeast extract powder 4 g， NaCl 0.5g MgSO ·7H 2 0 0.5 g， FeSO ： ，finally adjusted to 1L with pH 8.0， 7% inoculation volume， 100mL medium per flask，and cultivation at This study provides foundational data forthe development and application of BM-O3 asa biocontrol agent.

Keywordstobacco；biocontrol bacteria； screening； control efciency；fermentation characteristics

煙草根黑腐病是一種煙草真菌病害，在煙草種植區(qū)域發(fā)生較普遍，且發(fā)生程度不一。因其具有土壤傳播特性，該病害的侵染源較為復雜，導致其防治相對困難。尤其是隨著各種植煙區(qū)煙糧間作套種模式的推廣應用，使得煙草真菌病害的防治面臨更加復雜的情況。

在煙草原料生產領域，生態(tài)煙草和綠色煙草的生產理念被普遍認同并付諸實踐。生產上，根黑腐病等煙草真菌病害的防治已從化學防治轉變?yōu)橐陨锓乐螢橹鲗У姆乐文Ｊ?。生物防治因其環(huán)境友好和安全性而具有明顯優(yōu)勢，然而，其防治效果的緩慢性、實施條件的嚴格性以及功能菌株防效的衰減性，是當前普遍面臨的現(xiàn)實問題。如宋玉娟等研究發(fā)現(xiàn)，在溫室盆栽試驗條件下，棘孢木霉T-6對煙草根黑腐病的防治效果達 75.14% ；易龍等研究表明，木霉菌TB72菌株對煙草根黑腐病病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制效果顯著，其在實驗室條件下的防效達 84.5% 。因此，生物防治煙草根黑腐病在理論和實踐上均具備可行性。持續(xù)開展煙草根黑腐病防治研究仍具有重要現(xiàn)實意義，尤其是針對生防微生物資源的篩選更新和生防菌功能條件的優(yōu)化，這方面研究對生防菌劑的開發(fā)和田間應用指導起著關鍵作用。本研究從煙草根際土壤中篩選出一株煙草根黑腐病生防菌BM-03，并對其防效和發(fā)酵特性進行研究，為煙草根黑腐病生防菌劑的開發(fā)提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌株分離土壤樣品采自省確山縣植煙區(qū)煙田；煙草根黑腐病病原菌茄鐮孢菌（Fusariumsolani）由科技大學園藝與植物保護學院提供；供試煙草品種為云煙87。

1.2試驗方法

1.2.1菌株篩選 土壤樣品按照常規(guī)平板稀釋法進行平板培養(yǎng)，于 條件下恒溫培養(yǎng)6d，3次重復，觀察記錄菌落生長情況，并純化保藏；采用平板對崎法進行生防菌篩選[3]。

1.2.2煙草根黑腐病的盆栽防效驗證試驗 設兩個處理組：對照組（CK）僅接種茄鐮孢菌；實驗組接種茄鐮孢菌孢子懸浮液后，在煙草根莖部均勻接種 的驗證菌株發(fā)酵液。每組處理均設置3次重復。接種40d后，依據文獻[4-5]所述方法，統(tǒng)計分析病情指數(shù)及防治效果。

1.2.3發(fā)酵特性分析 種子液的制備參考文獻[6]所述方法，挑取菌餅接入液體培養(yǎng)基，制成種子液，備用。1.2.3.1單因素剔除試驗 在微生物代謝過程中，不同碳源和氮源的利用效率存在差異。為探究不同碳源和氮源對產物產量的影響，設計單因素排除試驗，分別配制排除單一碳源（可溶性淀粉）、氮源（ 和無機鹽 和 的發(fā)酵培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)條件保持不變7。

1.2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 （1）碳源優(yōu)化。分別以相同質量的果糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖和葡萄糖替代可溶性淀粉，配制不同碳源的培養(yǎng)基，其他條件保持不變，于28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng) 7d 隨后測定菌體質量濃度及抑菌活性。菌體質量濃度用質量/體積分數(shù)表示[8-9]。抑菌活性的測定采用牛津杯法進行對峙培養(yǎng)[10]。（2）氮源優(yōu)化。分別以相同質量的蛋白陳、酵母粉、黃豆粉、尿素、 和 替代 配制培養(yǎng)基，其他條件保持不變。（3）氮源比例優(yōu)化。將黃豆粉和酵母粉按 4：1，3：2 、2：3和 的比例配制培養(yǎng)基，其他條件保持不變。（4）正交試驗。利用正交法[8-10設計以碳源、氮源及濃度梯度二因素四水平正交試驗。1.2.3.3發(fā)酵條件優(yōu)化（1）接種量。分別按3%.5%.7%.9%.11%.13%.15% 的接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)基，其他條件保持不變，確定最適接種量。（2）搖床轉速。設置搖床轉速為 120，140，160，180，200 220r/min ，其他條件保持不變，確定最佳培養(yǎng)轉速。 優(yōu)化。調節(jié)培養(yǎng)基pH至 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 和9.0，其他條件保持不變，確定最適 pH（4） 發(fā)酵溫度。將發(fā)酵溫度調節(jié)至 22、25、28、31、34、37℃，其他條件保持不變，確定最佳發(fā)酵溫度。（5）發(fā)酵時間。分別培養(yǎng) ，其他條件保持不變，確定最佳發(fā)酵時間。（6）裝液量。在 250mL 三角瓶中分別裝入 發(fā)酵液，其他條件保持不變，確定最適裝液量。以上處理均設3次重復。

1.3數(shù)據處理

采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析，采用Excel軟件作圖。

2結果與分析

2.1煙草根黑腐病生防菌株的篩選

采用稀釋涂布和平板對崎試驗，從煙草根際土壤中分離得到1株拮抗煙草根黑腐病病原菌的菌株，編號BM-03。其抑菌圈直徑為 13.3mm ，抑菌率為52.78% 。抑菌效果如圖1所示。

2.2 菌株BM-03的生防效果

將煙株進行盆栽培養(yǎng)20d后，先用煙草根黑腐病病原菌孢子懸浮液灌根處理， 24h 后再用BM-03菌懸液處理。煙株生長40d后進行調查，結果顯示，接種BM-03菌株的煙株根系白嫩，根須發(fā)達，分支數(shù)量較多，地上生物量明顯增加，整體生長狀況良好，對根黑腐病的防治效果達 78.03% ；而未接種BM-03菌株的對照組煙株則表現(xiàn)出較嚴重的根黑腐病癥狀（圖2）。

（A）煙株地上情況（上排為接種BM-03的防治煙株；下排為未接種BM-03的對照煙株）；（B）煙株根部癥狀（左側為未接種BM-03的對照株根系；右側為接種BM-03的防治株根系）。

2.3菌株BM-03的發(fā)酵特性

2.3.1剔除試驗 單因素剔除試驗結果表明，剔除氮源 和碳源（可溶性淀粉）對菌株BM-03的菌濃度和抑菌帶寬的影響較大，而單因素剔除無機鹽對菌株BM-03菌濃度和抑菌帶寬的影響較?。▓D3）。

2.3.2碳源篩選 不同碳源培養(yǎng)基中，可溶性淀粉最有利于菌株BM-03的生長（表1），顯著高于其他處理（ 。因此，綜合考慮選用可溶性淀粉作為最佳碳源。

2.3.3氮源篩選 不同氮源處理中，酵母粉和黃豆粉更適合菌株BM-03的發(fā)酵，菌體濃度分別為78.52和 71.06g/L ，抑菌帶寬分別為15.77和 15.29mm （表2），顯著高于其他處理 Plt;0.05） 。綜合考慮，選用酵母粉和黃豆粉作為菌株BM-03發(fā)酵培養(yǎng)的氮源組合。

2.3.4不同氮源比例篩選 由表3可知，菌株BM-03在黃豆粉和酵母粉比例為2：3和3：2時發(fā)酵獲得的菌體較多，分別為83.17和 81.07g/L ，抑菌帶寬分別為15.86和 16.45mm 。其中，3：2比例組合的菌濃度和抑菌帶寬優(yōu)于其他組合 （Plt;0.05） 。綜合考慮，選用黃豆粉和酵母粉比例3：2作為氮源組合進行后續(xù)試驗。

2.3.5正交試驗優(yōu)化結果 綜合單因素試驗結果，設定正交試驗因素水平（表4）。正交試驗結果顯示（表5），編號 組合的菌濃度較高和抑菌帶最大，分別為 115.37g/L 和 17.01mm ，較優(yōu)化前提高 134.59% ，說明菌株生長良好。最終確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方（1L）：可溶性淀粉30g，黃豆粉6g，酵母粉

2.3.6培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化 在發(fā)酵初期，接種量和轉速對菌株BM-03菌體生長和抑菌帶寬的影響不同，當接種量為 7% 時，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為 104.57g/L 和 17.50mm （圖4A）；當轉速為 160r/min 時，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為 109.00g/L 和 17.90mm （圖4B）；當 pH在 4.0～ 9.0時，菌株均能生長且有抑菌活性，當pH為8.0時，菌濃度較高且抑菌帶寬最大，分別為115.01g/L 和 17.74mm （圖4C）。當培養(yǎng)溫度在 時，菌株BM-03生長最好，當溫度低于 或大于37℃時，菌體生長受到抑制（圖4D）。菌株在發(fā)酵第2～8天時菌體呈持續(xù)生長趨勢，至第8天菌體生長量和抑菌帶寬均達到最大，為124.28g/L 和 18.76mm ，第10天開始下降（圖4E）。在 250mL 的三角瓶中，裝液量為 時菌濃度和抑菌帶寬達到最大，分別為 115.00g/L 和18.50mm （圖4F）。

3結論與討論

煙草作為一種特色經濟作物，對植煙區(qū)煙農及地方經濟具有較大影響。煙草病害的防治是提升煙草栽培管理質量的關鍵環(huán)節(jié)，也是影響煙草原料產量和品質的重要因素之一。在煙草生產中，生物防治煙草病害被廣泛接受并付諸實踐[11-12]。煙草根黑腐病作為一種土傳病害，其發(fā)生及為害程度受多種因素影響，其致病病原菌種類繁多，其中茄鐮孢菌（Fusariumsolani）是較為常見的一種病原菌，其分布廣且危害性大。在實際生產中，常采用生物防治配合栽培措施的方法來控制煙草根黑腐病，目前該病害的生防菌資源尚顯單—[13-14]。本研究篩選得到的BM-03菌株對該病害具有較好的防治效果，盆栽驗證試驗條件下生防效果達 78.03% ，開發(fā)與應用潛力較大。功能菌發(fā)酵特性的研究是微生物資源開發(fā)與利用的關鍵環(huán)節(jié)[15-16]。通過發(fā)酵特性測定，無機鹽對菌株BM-03發(fā)酵特性的影響較小，而可溶性淀粉、酵母粉和黃豆粉是該菌株生長發(fā)酵的適宜營養(yǎng)物質。優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉 30g 黃豆粉6g酵母粉 ，總體積定容至1L，并將pH調節(jié)至8.0，接種量 7% 、裝液量 ，于 恒溫條件下進行培養(yǎng)。本研究對BM-03生防菌劑的開發(fā)及田間應用具有一定指導意義。

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