高分辨質(zhì)譜結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在魚體恩諾沙星及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析中的應(yīng)用

摘要：為了識(shí)別養(yǎng)殖行業(yè)中常用抗生素恩諾沙星在復(fù)雜生物介質(zhì)環(huán)境中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，本研究通過結(jié)合恩諾沙星的質(zhì)譜裂解規(guī)律以及高分辨率的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)并對(duì)其中具有相似結(jié)構(gòu)的分子簇及主要化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，從而識(shí)別并鑒定了羅非魚不同組織部位的恩諾沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并進(jìn)一步探討了恩諾沙星生物轉(zhuǎn)化的活性位點(diǎn)。結(jié)果表明：采用分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，在羅非魚不同組織中成功識(shí)別出10種可能的恩諾沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中所有組織中均發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星的存在。恩諾沙星的喹諾酮環(huán)和哌嗪環(huán)是潛在的轉(zhuǎn)化位點(diǎn)，因此羅非魚的生物轉(zhuǎn)化過程主要是發(fā)生在喹諾酮環(huán)（4種）與哌嗪環(huán)（6種）上的反應(yīng)。研究表明，高分辨率質(zhì)譜結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為恩諾沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的識(shí)別提供了一種有效的方法，能夠?yàn)榭股仡愋挛廴疚镌诙嘟橘|(zhì)環(huán)境中的識(shí)別與溯源提供重要支持。

關(guān)鍵詞：分子網(wǎng)絡(luò)；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；恩諾沙星；羅非魚；產(chǎn)物鑒定

中圖分類號(hào)：X502 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2025）03-0741-09 doi：10.11654/jaes.2024-1127

目前，新污染物主要包括具有持久性和生物毒性的抗生素、內(nèi)分泌干擾物、微塑料和全氟化合物等[1]。環(huán)境污染物可以通過土壤、水體、空氣等環(huán)境要素遷移至農(nóng)作物、動(dòng)物等體內(nèi)，新污染物也存在類似的遷移途徑[2]。此外，新污染物在環(huán)境中會(huì)轉(zhuǎn)化為未知產(chǎn)物，而且在不同的環(huán)境介質(zhì)中，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也可能有所不同[3]。研究表明，這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相比母體化合物可能具有更高的生物毒性[4-5]，且在特定條件下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物甚至可能重新轉(zhuǎn)化為母體化合物[6]，這為新污染物的識(shí)別和鑒定帶來了很大挑戰(zhàn)。因此，如何識(shí)別不同環(huán)境介質(zhì)中的新污染物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，已成為新污染物防治中的一個(gè)關(guān)鍵問題。

抗生素是一類使用廣泛的化合物，在養(yǎng)殖行業(yè)中普遍用于預(yù)防和控制病害的侵襲[7-8]。因此，在各類食品（肉、蛋、奶、魚以及蔬菜[9-11]）中不同程度地檢出抗生素，其中尤以水產(chǎn)品的污染最為嚴(yán)重。在水產(chǎn)品中，喹諾酮類抗生素的檢出率較高，為30%～80%[12]，其中恩諾沙星和環(huán)丙沙星是主要的殘留成分[13]，而且環(huán)丙沙星是恩諾沙星的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其殘留主要來源于恩諾沙星在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化[14]。此外，恩諾沙星在不同種類的生物體內(nèi)會(huì)生成不同的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，甚至在同一種生物的不同組織中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)也存在差異[15]。鑒于這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，識(shí)別復(fù)雜介質(zhì)環(huán)境中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物需要依賴更精密的儀器和高通量的分析方法。

近年來，高分辨質(zhì)譜由于其高效率、高靈敏度和特異性，被廣泛用于抗生素及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析[16]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展提高了MS二級(jí)質(zhì)譜的采集速率[17]，但基于有限質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)檢索方法已無法滿足快速鑒定大量物質(zhì)的需求[18]。目前主要分析方法包括產(chǎn)物離子過濾、分子網(wǎng)絡(luò)、質(zhì)量缺陷以及穩(wěn)定同位素等[19]。2007年，Bandeira等[20]提出了“譜圖對(duì)”（Spectral Pairs）的概念，這一概念使得在沒有數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下仍能實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的檢索和鑒定，為基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)識(shí)別未知物質(zhì)開辟了新的方向，即分子網(wǎng)絡(luò)的雛形。Watrous等[21]將質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)引入代謝組學(xué)，以監(jiān)測(cè)微生物群落中的小分子變化，深入了解細(xì)菌的發(fā)育過程。2013 年，Yang 等[22]正式總結(jié)了分子網(wǎng)絡(luò)的概念，隨后構(gòu)建了開源的全球天然產(chǎn)物社會(huì)分子網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，使得分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)能夠廣泛應(yīng)用于基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)研究。每個(gè)分子均被視為網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的邊則表示分子之間的相似性。通過計(jì)算分子間的結(jié)構(gòu)相似性，可以有效地識(shí)別和分類新污染物。Yu等[23]開發(fā)了一種基于分子網(wǎng)絡(luò)的非靶向篩選策略，使用該策略，研究人員從污水處理廠排放的廢水中檢測(cè)到了52種抗菌藥物和49種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中30種新型抗生素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在環(huán)境相關(guān)研究中尚未有報(bào)道。Wu等[24]則選擇了5種結(jié)構(gòu)相似的磺胺類藥物作為靶向新污染物，運(yùn)用基于分子網(wǎng)絡(luò)的非靶向篩選方法探索其在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模廢水生物處理實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)化模式，最終鑒定出45種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中包括14種新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，通過比較轉(zhuǎn)化途徑、分析反應(yīng)頻率和顯性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，歸納了磺胺類藥物的5種具體轉(zhuǎn)化模式。Robin等[25]首次基于分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)與飲用水相關(guān)的季節(jié)性化合物進(jìn)行了優(yōu)先級(jí)排序和分子間連接。隨后，在所獲得的分子網(wǎng)絡(luò)中，對(duì)43種化合物進(jìn)行了注釋，其中包括卡馬西平和沙坦類藥物的4種新轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。用于分析小分子串聯(lián)質(zhì)譜的分子網(wǎng)絡(luò)于2012 年被引入[26]，在進(jìn)行成對(duì)光譜相似性比對(duì)時(shí)，給定數(shù)據(jù)集中的每個(gè)MS二級(jí)質(zhì)譜都會(huì)被相互比較，從而得到一個(gè)MS二級(jí)光譜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并由此創(chuàng)建分子網(wǎng)絡(luò)來鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。母體化合物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以看作具有某類結(jié)構(gòu)特征的分子家族，因此，將分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究具有十分廣闊的發(fā)展前景。

本研究主要采用構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)的方法，鑒定養(yǎng)殖羅非魚過程中施用恩諾沙星（ENR）所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并進(jìn)一步探討這些產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化的活性位點(diǎn)。該研究為識(shí)別和追溯生物體復(fù)雜介質(zhì)環(huán)境中的抗生素提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩諾沙星（ENR，純度≥99%，0.1 g）和環(huán)丙沙星（CIP，純度≥95%，0.1 g）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehren?storfer GmbH。ENR原料藥（純度≥98.0%，100 g）和肝素鈉購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。甲酸（FA）、甲醇（MeOH，色譜級(jí)）和乙腈（MeCN，色譜級(jí)）由德國(guó)Merck 公司提供。HLB 固相萃取柱購(gòu)自上海安譜科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚恩諾沙星暴露實(shí)驗(yàn)及取樣

將50條羅非魚混養(yǎng)于用高錳酸鉀清洗和消毒過的養(yǎng)殖桶中。參照水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 1083—2007[27]，以20 mg·kg-1的劑量給藥。將ENR充分溶解并混合加入空白飼料中，制備ENR 陽性飼料。試驗(yàn)池每天投喂ENR陽性飼料，連續(xù)投喂7 d，每天兩次，間隔8～12 h。在口服給藥后12、24、48、72 h 采集樣本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取6個(gè)樣本進(jìn)行采集。每條魚經(jīng)尾靜脈采集約1.5 mL 血液，置于1% 肝素鈉離心管，血樣以4 000 r·min-1 離心10 min 獲得血漿，然后在-20 ℃保存。最后，收集肝臟、腎臟、肌肉和皮膚組織。根據(jù)采樣時(shí)間和地點(diǎn)，將樣品編號(hào)并冷凍在準(zhǔn)備好的塑封袋中，-20 ℃保存。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g（±0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL提取劑（0.1%甲酸乙腈），2 000 r·min-1渦旋振蕩15 min，超聲10 min，8 000 r·min-1離心5 min，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。5 mL甲醇活化HLB固相萃取小柱，取5 mL上述提取液過固相萃取柱，收集流出液；用5 mL甲醇分兩次洗脫（第一次3 mL，第二次2 mL），收集合并兩次流出液。將合并后的流出液置于45 ℃水浴、真空度為0.07 MPa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL 初始流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22μm有機(jī)相濾膜，待上機(jī)分析。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及檢出限的確證

準(zhǔn)確稱取恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，此即為濃度1 000 mg·L-1的恩諾沙星與環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用所選的干凈樣品基質(zhì)做溶液，分別配制1、5、10、20、50、100 μg·L-1濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制完成后待后續(xù)檢測(cè)儀器穩(wěn)定性與檢出限。恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢出限約在0.2 μg·L-1（表1）。

1.3 儀器條件

本研究使用儀器為安捷倫1290高效液相色譜儀和6545 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Aglient 公司）。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm），進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL ·min-1，柱溫40 ℃。流動(dòng)相A為5%乙腈水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸甲醇。采用20 min 液相梯度洗脫：0 min，100% A；2min，100% A；7 min，50% A；12 min，0% A；16 min，0%A；20 min，100% A。

采用電噴霧電離源（ESI），干燥氣體溫度320 ℃，流速5 L·min-1；鞘氣體溫度和流速設(shè)置為350 ℃、11L·min-1，霧化器氣體壓力為241.31 kPa。離子源溫度為350 ℃，離子噴霧電壓為4 000 V。在MS模式下自動(dòng)獲取MS/MS 數(shù)據(jù)，前體質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 000，產(chǎn)物離子掃描范圍為m/z 50～800。

1.4 分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

1.4.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理

將得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，通過MS Con?vert工具將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成.mzXML文件格式。將轉(zhuǎn)化格式后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MS-DIAL4.9 中進(jìn)行預(yù)處理，主要步驟包括峰拾取、保留時(shí)間（RT）對(duì)齊、組分化（將同位素和加合物分組）以及將所有樣品中的峰分組以形成特征。提取其中峰響應(yīng)值高于1 000、信噪比（S/N）大于3的特征峰，在樣品中檢測(cè)到的強(qiáng)度小于溶劑空白或程序空白的3倍的特征標(biāo)記為背景并刪除。將保留的特征峰導(dǎo)出為特征定量表（TXT格式）和MS/MS光譜總結(jié)（MGF格式）上傳至全球天然產(chǎn)物社交分子網(wǎng)絡(luò)（GNPS，https：//gnps.ucsd.edu）。

1.4.2 分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的參數(shù)設(shè)置

利用基于特征的分子網(wǎng)絡(luò)（FBMN）工作流在GNPS上創(chuàng)建了分子網(wǎng)絡(luò)。將MS-DIAL處理過的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)出到GNPS進(jìn)行FBMN分析。通過去除前級(jí)離子m/z ±17 Da內(nèi)的所有MS/MS片段離子來過濾數(shù)據(jù)。對(duì)MS/MS光譜進(jìn)行窗口過濾，在整個(gè)光譜中只選擇m/z ±50 Da窗口的前6個(gè)片段離子。前級(jí)離子m/z tolerance 設(shè)置為0.02 Da，MS/MS片段離子m/ztolerance設(shè)置為0.02 Da。然后創(chuàng)建一個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)，其中邊緣經(jīng)過過濾，使余弦值高于0.7，并且超過2個(gè)匹配的峰值。此外，當(dāng)且僅當(dāng)兩個(gè)節(jié)點(diǎn)在彼此最相似的前10個(gè)節(jié)點(diǎn)中出現(xiàn)時(shí)，兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的邊才保留在網(wǎng)絡(luò)中。最后，將分子簇的最大值設(shè)置為300，并從分子簇中去除得分最低的邊，直到分子簇大小低于該閾值。使用DEREPLICATOR對(duì)輸入的MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，使用Cytoscape軟件對(duì)分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.4.3 恩諾沙星及其產(chǎn)物的識(shí)別

在分子網(wǎng)絡(luò)給出的網(wǎng)絡(luò)簇中進(jìn)行分子量的篩選，以前級(jí)離子恩諾沙星的m/z 360.17進(jìn)行篩選，找到有DEREPLICATOR 注釋的恩諾沙星網(wǎng)絡(luò)簇，進(jìn)而確認(rèn)恩諾沙星及可能產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。同時(shí)分析恩諾沙星網(wǎng)絡(luò)簇中的特征離子碎片，并以此特征碎片進(jìn)一步在MS-DIAL篩選前體離子，設(shè)置參數(shù)m/z tolerance為0.01 Da，離子豐度為50%。分子網(wǎng)絡(luò)篩查產(chǎn)物的流程見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 恩諾沙星及環(huán)丙沙星的二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律

在高分辨質(zhì)譜的正離子模式下，測(cè)得各相關(guān)物質(zhì)母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量和碎片離子組成。恩諾沙星與環(huán)丙沙星的基本裂解途徑如圖2所示。這兩種化合物在軟電離狀態(tài)下普遍經(jīng)歷中性丟失，包括CO2、H2O、HF和CO。恩諾沙星通過丟失一分子的H2O形成m/z為342.16的碎片，或通過丟失一分子的CO2形成m/z為316.18的碎片，并進(jìn)一步丟失一分子的乙胺和乙基形成m/z 為245.10的碎片。環(huán)丙沙星則展現(xiàn)出類似的裂解規(guī)律，它可以通過丟失一分子的H2O形成m/z為314.13的碎片，或通過丟失一分子的CO2形成m/z為288.15 的碎片，并進(jìn)一步丟失一分子的乙胺形成m/z 為245.10的碎片。上述裂解規(guī)律與喹諾酮類抗生素的特征裂解模式相一致[28]，同時(shí)與前人研究中關(guān)于真實(shí)水產(chǎn)品中恩諾沙星及其代謝物殘留的篩選與分析結(jié)果具有良好的一致性[29]。

2.2 分子網(wǎng)絡(luò)識(shí)別恩諾沙星及其產(chǎn)物

2.2.1 分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

恩諾沙星在羅非魚各組織中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)高分辨質(zhì)譜測(cè)試后，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分子網(wǎng)絡(luò)可視化分析，在皮膚組織（圖3a）中共檢測(cè)到3 510個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有2個(gè)及以上節(jié)點(diǎn)的分子簇共有129個(gè)。在肌肉組織（圖3b）中共檢測(cè)到3 742個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有2個(gè)及以上節(jié)點(diǎn)的分子簇共有79個(gè)。在肝臟組織（圖3c）中共檢測(cè)到3 703個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有2個(gè)及以上節(jié)點(diǎn)的分子簇共有88個(gè)。在腎臟組織（圖3d）中共檢測(cè)到7 394個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有2個(gè)及以上節(jié)點(diǎn)的分子簇共有151個(gè)。在血漿基質(zhì)（圖3e）中共檢測(cè)到4 390個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有2個(gè)及以上節(jié)點(diǎn)的分子簇共有163個(gè)。恩諾沙星對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)m/z為360.17[M+H]+，是恩諾沙星分子與氫離子形成的加和離子。首先在各組織的分子網(wǎng)絡(luò)中確定以恩諾沙星節(jié)點(diǎn)為核心的分子簇（紅圈標(biāo)出），這些分子簇所包含的質(zhì)譜特征及其拓?fù)潢P(guān)系信息，將作為恩諾沙星潛在代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的篩選與結(jié)構(gòu)鑒定的主要研究對(duì)象。

2.2.2 恩諾沙星在羅非魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物識(shí)別

對(duì)于存在標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的靶向驗(yàn)證[3]，而除環(huán)丙沙星外的大多數(shù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物都沒有可供確證的標(biāo)準(zhǔn)品，因此非靶向的篩選方法更適合此類物質(zhì)。通過構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的篩選也屬于非靶向分析中的一種[21]。結(jié)果表明分子網(wǎng)絡(luò)共識(shí)別出5種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，結(jié)合特征碎片離子過濾的方式進(jìn)一步對(duì)扣除空白后剩余物質(zhì)的特征二級(jí)片段進(jìn)行匹配，最終共識(shí)別出可能的10 種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（P1～P10，表2）。其中P1、P3、P4、P9和P10是通過特征碎片確定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

通過構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)分析，在羅非魚的皮膚組織（圖4a）中檢測(cè)到m/z 為332.14的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P6，即環(huán)丙沙星。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了m/z 為358.15的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P2以及m/z 為316.18的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P8。在羅非魚的肌肉組織（圖4b）中同樣檢測(cè)到環(huán)丙沙星P6（m/z 為332.14）和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P8（m /z 為316.18）。在肝臟組織中（圖4c），應(yīng)用分子網(wǎng)絡(luò)方法檢測(cè)到了與前述相同的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，包括環(huán)丙沙星（P6）以及m/z 分別為330.12 和316.18的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P7和P8。在腎臟組織中（圖4d），通過分子網(wǎng)絡(luò)方法也發(fā)現(xiàn)了環(huán)丙沙星（P6），以及m/z分別為358.15和316.18的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P2和P8。在羅非魚的血漿基質(zhì)（圖4e）中，分子網(wǎng)絡(luò)方法檢測(cè)到了環(huán)丙沙星（P6）及另外三個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P2（m/z 358.15）、P5（m/z 332.17）和P8（m/z 316.18）。在羅非魚各組織中均發(fā)現(xiàn)有環(huán)丙沙星的存在，這與斑點(diǎn)叉尾鮰[30]、大黃魚[31]以及俄羅斯鱘[32]多組織中恩諾沙星代謝物均存在環(huán)丙沙星的結(jié)論類似。

2.3 恩諾沙星生物轉(zhuǎn)化的活性位點(diǎn)

由于生物反應(yīng)引起的恩諾沙星的主要生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)涉及哌嗪環(huán)和喹諾酮環(huán)（圖5）的核心結(jié)構(gòu)[33]。哌嗪環(huán)的轉(zhuǎn)化主要通過在環(huán)的1～4位置添加不同的官能團(tuán)（如氧化、羥基化、甲酰化、乙酰化、N-去甲基化和N-脫乙基化）實(shí)現(xiàn)[34]。此過程中部分或全部的哌嗪環(huán)可能會(huì)裂解，一旦環(huán)裂解，所得化合物會(huì)在哌嗪環(huán)的1位和4位進(jìn)一步添加官能團(tuán)（如乙?；图柞；35]。另一方面，喹諾酮環(huán)的主要轉(zhuǎn)化步驟涉及在芳香環(huán)的兩個(gè)可用位置之一進(jìn)行羥基化，以及將氟取代基替換為羥基[36]。

在本次實(shí)驗(yàn)中，許多轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在微生物的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中[37]、動(dòng)物組織的殘留轉(zhuǎn)化中[35]以及在恩諾沙星的高級(jí)氧化過程中[36]都已被發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的原因主要是恩諾沙星的喹諾酮環(huán)和哌嗪環(huán)均為潛在的轉(zhuǎn)化位點(diǎn)，尤其是喹諾酮環(huán)3號(hào)位上的羧基、6號(hào)位上的氟取代基以及7號(hào)位上的哌嗪環(huán)易發(fā)生氧化或裂解[34]。恩諾沙星及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基，而羧基作為這種化合物的活性基團(tuán)，容易發(fā)生取代反應(yīng)[28]。此外，在碰撞誘導(dǎo)解離后，生成CO2和H2O 的中性丟失現(xiàn)象也相對(duì)常見[33]。在本次鑒定的可能轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，P1、P3、P5和P8為喹諾酮環(huán)上反應(yīng)生成的，P2、P4、P6、P7、P9和P10則是由喹諾酮環(huán)7號(hào)位的哌嗪環(huán)裂解產(chǎn)生的。

3 結(jié)論

（1）本研究中建立了一種基于高分辨質(zhì)譜的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行高通量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物識(shí)別方法，可用于不同基質(zhì)中抗生素恩諾沙星轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的識(shí)別鑒定，且其通用性特征使其可擴(kuò)展至其他抗生素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究，有助于抗生素類新污染物在多介質(zhì)環(huán)境中的識(shí)別與溯源。

（2）在養(yǎng)殖羅非魚的過程中，使用抗生素恩諾沙星后魚體不同組織部位會(huì)產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，但均有環(huán)丙沙星的存在。

（3）恩諾沙星的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物存在特定的發(fā)生過程，本次研究中羅非魚的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要發(fā)生在喹諾酮環(huán)與哌嗪環(huán)上。這為研究其他喹諾酮類藥物的生物轉(zhuǎn)化過程提供了重要參考依據(jù)，同時(shí)能夠深化對(duì)多介質(zhì)環(huán)境中喹諾酮類藥物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的識(shí)別。

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（責(zé)任編輯：宋瀟）