錳礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤HMs-PAHs共存污染特征及土壤微生物的響應(yīng)

摘要：本研究以湖南省花垣縣部分錳礦區(qū)周邊重金屬（HMs）和多環(huán)芳烴（PAHs）共存污染旱地和水田土壤為研究對(duì)象，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法分析了旱地與水田土壤中HMs和PAHs的含量，借助潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)法和污染因子（CF）法對(duì)HMs-PAHs共存污染土壤進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，使用16S rDNA高通量測(cè)序和熒光定量PCR分析了不同共存污染程度土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)特征及其抗性機(jī)制。結(jié)果表明：旱地中Cd、As和PAHs的含量分別是農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值的10.4、1.4倍和1.8倍，而水田Cd和PAHs的含量分別是風(fēng)險(xiǎn)篩選值的3.9倍和1.1倍，旱地Cd生物有效性明顯高于水田。根據(jù)潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)將采樣點(diǎn)所處的旱地和水田劃分為重、中、輕污染區(qū)，污染因子風(fēng)險(xiǎn)排序?yàn)镃dgt;Asgt;Pbgt;PAHs。不同共存污染程度土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著差異，其中重、中污染和輕污染土壤中優(yōu)勢(shì)菌屬分別為酸桿菌Gp6、酸桿菌Gp4 和芽孢桿菌，旱地中的優(yōu)勢(shì)菌屬為酸桿菌和鞘氨醇單胞菌，水田中的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌。Cd和PAHs分別是旱地和水田中優(yōu)勢(shì)菌群的主要影響因子。污染程度與功能菌株的HMs耐受性基因和PAHs降解基因豐度呈顯著正相關(guān)。鞘氨醇單胞菌的相對(duì)豐度與共存污染水平（包括HMs和PAHs）顯著正相關(guān)，提示其可能成為該區(qū)域共存污染特征下的潛在生物標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：錳礦區(qū)；重金屬；多環(huán)芳烴；共存污染；微生物

中圖分類號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2025）03-0696-12 doi：10.11654/jaes.2025-0141

隨著工礦業(yè)快速發(fā)展，重金屬（HMs）與多環(huán)芳烴（PAHs）共存污染已成為威脅農(nóng)田土壤健康的核心問題[1]。錳礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤存在As、Cd、Pb等HMs的持續(xù)輸入，有機(jī)質(zhì)-礦物間的交互作用也使PAHs等持久性有機(jī)污染物（POPs）持續(xù)富集于土壤[2]。土壤中的HMs-PAHs不僅會(huì)影響農(nóng)作物產(chǎn)量，降低作物質(zhì)量，而且能通過食物鏈對(duì)人類健康造成影響。因此，探明錳礦區(qū)周邊農(nóng)田中HMs和PAHs共存污染的賦存形態(tài)及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于未來(lái)開展農(nóng)田生態(tài)修復(fù)和保障土壤健康具有重要意義[3]。

湘西花垣縣錳礦區(qū)周邊土壤、大氣與河流受到了不同程度的污染[4-5]。政府雖多輪整治，但礦區(qū)大規(guī)模開采遺留的污染問題依然無(wú)法短時(shí)間有效解決，導(dǎo)致錳礦區(qū)仍存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。已有研究對(duì)花垣縣部分錳礦區(qū)土壤HMs污染進(jìn)行了相關(guān)調(diào)查[6-8]。礦區(qū)開采過程中需要用到各種化石燃料（如煤、柴油等）進(jìn)行機(jī)械作業(yè)和供暖，同時(shí)研究地塊附近存在大量的礦石冶煉工廠，污染物未經(jīng)達(dá)標(biāo)處理亂排亂放現(xiàn)象普遍存在[9]，這也成為主要的PAHs來(lái)源。PAHs作為典型POPs出現(xiàn)在我國(guó)重點(diǎn)管控新污染物清單中。HMs-PAHs共存污染能通過協(xié)同毒性效應(yīng)顯著改變土壤微環(huán)境，微生物群落作為土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的核心載體[10]，其響應(yīng)機(jī)制與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系仍有待闡明。

為此，本研究聚焦湖南省花垣縣某關(guān)閉錳礦區(qū)周邊HMs和PAHs共存污染的旱地和水田土壤，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測(cè)定土壤中HMs和PAHs含量，借助潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)法、污染因子法對(duì)HMs和PAHs進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，通過16S rDNA高通量測(cè)序、熒光定量PCR等技術(shù)，在微觀尺度上系統(tǒng)解析微生物群落對(duì)土壤共存污染的響應(yīng)及其抗性機(jī)制，以期深化對(duì)共存污染脅迫下土壤微生物生態(tài)適應(yīng)機(jī)制的理解，為礦區(qū)農(nóng)田生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)管控及生態(tài)修復(fù)技術(shù)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

16 種PAHs 的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（500 μg·mL-1）。色譜純正己烷、二氯甲烷和丙酮購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)上海）。土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07409）和PAHs內(nèi)標(biāo)分別購(gòu)自中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院和上海阿拉丁生化科技股份有限公司。土壤總DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 點(diǎn)位布設(shè)和樣品采集

土壤樣本采集于湖南省湘西土家族苗族自治州下轄縣花垣縣東北部和中部（北緯28°10′～28°38′，東經(jīng)109°14′～109°37′），錳礦區(qū)集中分布在該縣東北部河流源頭，中部對(duì)照區(qū)距離錳礦區(qū)直線距離約20km，根據(jù)距離錳礦尾礦礦渣堆積中心點(diǎn)遠(yuǎn)近進(jìn)行布點(diǎn)。通過《土壤重點(diǎn)污染源影響區(qū)布點(diǎn)技術(shù)要求（農(nóng)用地詳查）》中的網(wǎng)格布設(shè)方法中的五點(diǎn)取樣法采集根系土壤，土樣去除殘留根系和小石子后混均，部分土樣保存在干冰中進(jìn)行寄樣，其余土壤樣本冷凍干燥后過100目篩網(wǎng)，用于HMs和PAHs分析。錳礦區(qū)和取樣點(diǎn)如圖1所示。土壤樣本類型分為旱地土壤與水田土壤，以判斷不同土壤條件下的土壤微生物群落對(duì)環(huán)境變化所產(chǎn)生的影響及其響應(yīng)程度。13個(gè)地塊面積在100～200 m2不等，根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018），判斷13個(gè)地塊的HMs和PAHs含量是否超出風(fēng)險(xiǎn)篩選值。

1.3 根系土壤HMs含量

所采集的土壤樣品在水土比為5∶1（V/m）的條件下，使用精密pH計(jì)（PHS-3C，上海INESA科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定土壤pH值。有機(jī)物含量通過重鉻酸鉀氧化法測(cè)定。干燥的土壤樣品用微波消解儀（MDS-6G，SI-NEO 公司）進(jìn)行消解。采用改良的Tessier 五步法測(cè)定土壤中HMs 的化學(xué)形態(tài)，包括可交換態(tài)（EX）、碳酸鹽結(jié)合態(tài)（CB）、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)（FM）、有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)（OM）和殘余態(tài)（RS）。EX、CB和FM部分被認(rèn)為具有生物可利用性[11-12]。所有消解液和提取液中的HMs濃度通過ICP-MS（iCAP RQ，美國(guó)賽默飛公司）測(cè)定[11]，質(zhì)控樣品為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)土壤（GBW07430）。加標(biāo)GBW07409 的HMs（如鎘、鉛、銅、鉻、砷、鋅和鎳）離子的回收率范圍在85%～108%之間。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 根系土壤中PAHs的提取和分析

將20 mL丙酮和氯仿（V/V，3∶1）加入裝有2 g干燥土壤樣品的40 mL玻璃瓶中，超聲波萃取1 h，共萃取3次。合并后的有機(jī)提取物以4 000 r·min-1離心20 min，然后將上清液注入含有硅酸鎂和硫酸鈉的SPE柱（默克公司），每根柱用10 mL正己烷預(yù)洗5 min后，用20mL二氯甲烷和正己烷（V/V，1∶1）以1 mL·min-1的速度洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，氮吹后定容至50 mL[13]。通過GC-MS儀（Agilent 7890B-5977B，美國(guó)安捷倫科技公司）分析根際土壤樣品中PAHs的含量[12]。在未受污染的土壤中加入已知濃度的PAHs 混合溶液（16 種PAHs，使土壤中PAHs的含量為1 mg·kg-1，測(cè)定PAHs的回收率。16種PAHs的回收率為88.8%±7.1%。

1.5 DNA提取、qPCR驗(yàn)證和高通量測(cè)序

土壤總DNA從0.25 g新鮮根系土壤中采用Ezup柱式土壤DNA 純化試劑盒（Sangon Biotech 公司）提取，隨后送上海生工生物技術(shù)有限公司（中國(guó)上海）在Illumina HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行16S高通量測(cè)序。利用細(xì)菌通用引物341F（5′ - CCTACACGACGCTCG?GCATCTTCGGATTTA - 3′ ）和805R（5′ - GACTG?GAGTTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′）構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)。測(cè)序數(shù)據(jù)已存入NCBI 的序列讀取檔案（SRA），生物項(xiàng)目編號(hào)為PRJNA796478。

1.6 基因表達(dá)定量

選取czcA、pbrT、arsB、nccA 和copA 分別編碼Cd、Pb、As、Ni和Cu的結(jié)合蛋白作為重金屬耐受基因，選取GNRHD（編碼革蘭氏陰性菌多環(huán)芳烴環(huán)羥基化雙加氧酶α亞基基因）和GPRHD（編碼革蘭氏陽(yáng)性菌多環(huán)芳烴環(huán)羥基化雙加氧酶α 亞基基因）作為指示PAHs的降解基因[14-15]，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)定量其在土壤中的表達(dá)豐度（Light-cycler 96，瑞士羅氏公司）。每次PCR 運(yùn)行都包括一個(gè)無(wú)模板對(duì)照，即以無(wú)菌水作為每個(gè)基因的陰性對(duì)照，并以16SrRNA基因作為內(nèi)源對(duì)照[16]。每次實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)重復(fù)樣本，以確保qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：正、反引物各0.8 μL，生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR Green Master Mix10 μL，翌圣生物科技（上海）股份有限公司；ddH2O6.4 μL，生工生物工程（上海）股份有限公司；模板DNA 2.0 μL。qPCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、退火溫度下退火5 s、60 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。引物信息和退火溫度見表1。

1.7 土壤HMs及PAHs污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

在本研究中，采用毒性當(dāng)量濃度（TEQ）、苯并[a]芘當(dāng)量濃度（TEC）、污染因子（CF）、單因子潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（Ei）和綜合潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（RI）衡量土壤HMs-PAHs共存污染程度。

PAHs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基于檢測(cè)到的PAHs的總含量和單個(gè)PAH 及其混合物的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)的計(jì)算，通過毒性當(dāng)量因子將PAHs 的毒性歸一化為苯并[a]芘的等效毒性。PAHs 的TEQ 和TEC 通過公式（1）和公式（2）估算[17-18]：

土壤質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等級(jí)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 錳礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤HMs-PAHs 含量變化及HMs賦存形態(tài)特征

花垣縣土壤pH值變化范圍為6.28～7.28，旱地土壤pH均值為6.86，水田土壤均值為6.91，以酸性土壤為主。如圖2（a）所示，錳礦區(qū)根際旱地和水田土壤中Cd含量均超過GB 15618—2018所規(guī)定的Cd風(fēng)險(xiǎn)篩選值（0.6 mg·kg-1），旱地土壤平均Cd 含量為6.25mg·kg-1，是風(fēng)險(xiǎn)篩選值的10.4倍，水田土壤平均Cd含量為2.31 mg·kg-1，是風(fēng)險(xiǎn)篩選值的3.9倍。根際土壤中As含量風(fēng)險(xiǎn)篩選值為30 mg·kg-1，旱地土壤平均As含量為42.81 mg·kg-1，是風(fēng)險(xiǎn)篩選值1.4倍，水田土壤中As 并未超出風(fēng)險(xiǎn)篩選值。根系土壤其他HMs 如Zn、Pb、Cr、Ni、Cu 均未超過風(fēng)險(xiǎn)篩選值。圖2（b）表明，旱地土壤中平均PAHs含量為6.78 mg·kg-1，水田土壤中平均PAHs 含量為4.28 mg·kg-1，TEQ 分別為0.99 mg·kg-1 和0.62 mg·kg-1，旱地土壤和水田土壤PAHs 的TEC 平均值分別為0.99 mg·kg-1 和0.61 mg·kg-1，分別是GB 15618—2018所規(guī)定的苯并[a]芘風(fēng)險(xiǎn)篩選值（0.55）的1.8倍和1.1倍。湖南省土壤中Mn的環(huán)境背景值[29]為613 mg·kg-1，《土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值和管控值》（DB 4403/T 67—2020，深圳市地方標(biāo)準(zhǔn)）規(guī)定Mn的土壤環(huán)境背景值風(fēng)險(xiǎn)篩選值為2 930 mg·kg-1，旱地土壤平均Mn 含量為3 343.1 mg·kg-1，是風(fēng)險(xiǎn)篩選值的1.14 倍，水田土壤平均Mn 含量為948.9mg·kg-1，并未超過風(fēng)險(xiǎn)篩選值，這說(shuō)明錳礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤HMs（尤其是Cd、As，其次是Mn）和PAHs富集特征明顯，呈現(xiàn)共存污染特征。該地區(qū)農(nóng)田土壤中存在HMs-PAHs污染，不僅對(duì)農(nóng)作物和動(dòng)物的生理代謝與生長(zhǎng)發(fā)育形成多重負(fù)面效應(yīng)，還可能通過食物鏈富集嚴(yán)重威脅人群健康，應(yīng)通過污染阻斷與風(fēng)險(xiǎn)管控、靶向修復(fù)技術(shù)應(yīng)用、源頭防控與政策強(qiáng)化等措施進(jìn)行土壤嚴(yán)格管控[30]，防止在此類土壤上進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)。

金屬元素的種類和賦存形態(tài)是影響生物可利用性[31]及植物積累的重要因素，因此本研究更關(guān)注于土壤環(huán)境中具有更高的生物可利用性和毒性的Cd 和As。圖2（c）表明，錳礦區(qū)周邊農(nóng)田根際土壤中生物可利用態(tài)Cd約占總Cd含量的38.8%，旱地土壤中生物可利用態(tài)Cd占比為41.2%，高于水田（33.5%）。旱地與水田生物可利用態(tài)As 均占比約2%，明顯低于Cd。土壤中As 主要以RS 賦存，生物可利用率約為1.6%，研究表明Cd的生物可利用態(tài)組分占比明顯高于As[32]，在水田土壤中Cd遷移到作物中的能力最強(qiáng)。由于研究區(qū)域中土壤普遍呈酸性，Cd和As更容易形成EX組分被農(nóng)作物吸收[33]，進(jìn)而給農(nóng)作物帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。

如圖3（a）所示，在旱地土壤中Cd、Pb 含量與PAHs含量之間呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），As與Pb、Mn、Cu呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。而在水田土壤中Cd、As與大部分HMs相關(guān)性不顯著。為詳細(xì)探究采樣區(qū)土壤HMs的來(lái)源，對(duì)采樣區(qū)HMs和PAHs進(jìn)行主成分分析（PCA），數(shù)據(jù)檢驗(yàn)的KMO值為0.549，Bartlett′s檢驗(yàn)的P 值小于0.001，可以進(jìn)行主成分提取。如圖3（b）所示，存在兩個(gè)特征值大于1的成分，累計(jì)解釋了總方差的74.8%。第一主成分中Pb、As、Cd、PAHs和Mn具有較高荷載，方差貢獻(xiàn)率為51.8%，As、Cd、Pb、PAHs以及Mn的Pearson相關(guān)系數(shù)在0.57～0.96之間，相關(guān)性較強(qiáng)。旱地土壤中Cd與PAHs、Pb呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，說(shuō)明Cd與PAHs、Pb的來(lái)源相似。As與Cu、Cr、Pb和Mn呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，說(shuō)明As與Cu、Cr、Pb和Mn的來(lái)源特征相似，Mn 則與Pb、As 呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。水田土壤中Cd 與Cr、As 與Pb、Mn 與Cu 之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，說(shuō)明Cd與Cr、As與Pb、Mn與Cu的來(lái)源相似。以上分析表明旱地土壤中As、Pb受錳礦影響較大，而水田土壤中Cu受錳礦影響較大。

2.2 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)評(píng)估

通過HMs-PAHs 的RI 與PAHs 的CF，將采樣點(diǎn)所代表的區(qū)域分為重污染區(qū)（RIgt;160，CF≥3）、中污染區(qū)（80As 含量范圍為29.4～90.7 mg·kg-1，PAHs 含量均值為1.29 mg·kg-1。由上述結(jié)果可知，隨著距離錳礦區(qū)越遠(yuǎn)，采樣地區(qū)污染程度越低。由表3可知，PAHs的Ei平均值為9.72，處于輕微污染水平，旱地與水田土壤中Cd的Ei 均達(dá)到了極強(qiáng)等級(jí)，其余HMs和PAHs處于輕度生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)水平，表明Cd在采樣區(qū)存在極大的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。旱地土壤PAHs的CF 平均值為3.85，水田土壤PAHs的CF 平均值為2.43，分別處于嚴(yán)重污染和中度污染水平。

旱地土壤HMs-PAHs共存污染的RI均值為1 575.83，水田土壤HMs-PAHs 共存污染的RI 均值為287.09，旱地與水田采樣點(diǎn)的土壤分別屬于極強(qiáng)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和強(qiáng)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，Cd、As、Pb和PAHs是影響污染指數(shù)上升的重要指標(biāo)。綜上所述，錳礦區(qū)周邊農(nóng)田HMs-PAHs共存污染的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)排序?yàn)镃dgt;Asgt;Pbgt;PAHsgt;Mngt;Cugt;Nigt;Zngt;Cr。值得注意的是，Pb在采樣區(qū)中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)排序較高，這可能是由于自然沉降[34]、車輛尾氣排放和冶煉活動(dòng)[35]產(chǎn)生的含Pb粉塵通過干濕沉積進(jìn)入農(nóng)田土壤造成的。

2.3 錳礦區(qū)周邊土壤不同污染程度下的細(xì)菌群落變化及相關(guān)抗性基因豐度

由圖4（a）可知，隨著旱地HMs-PAHs 共存污染加重，其Chao1 指數(shù)均值由5 801.2 下降到4 583.2，Alpha多樣性顯著下降（Plt;0.05），重污染點(diǎn)間距大于輕、中污染，說(shuō)明重污染區(qū)中種群結(jié)構(gòu)差異性變大。隨著水田污染加重，其Chao1指數(shù)均值由4 544.9上升到8 955.9，Alpha 多樣性顯著升高（Plt;0.05），說(shuō)明種群增大且分布更均勻。這可能是由于土壤微生物應(yīng)對(duì)干濕環(huán)境策略不同，如在旱地土壤，微生物可能會(huì)進(jìn)入休眠或不活躍狀態(tài)，從而導(dǎo)致微生物多樣性降低[36]，而在水田土壤，微生物代謝活動(dòng)可能會(huì)增加[37]。如圖4（b）所示，根際微生物群落相對(duì)豐度在1%以上的優(yōu)勢(shì)菌群共有12個(gè)。在旱地土壤中，相對(duì)豐度排名前5 的細(xì)菌屬依次為酸桿菌Gp6（2%～12%）、芽孢桿菌（Gemmatimonas，2%～6%）、酸桿菌Gp4（1%～7%）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas，1%～5%）和硫桿菌（Thiobacillus，1%～3%）；水田土壤中，相對(duì)豐度排名前5 的細(xì)菌屬為酸桿菌Gp6（2%～12%）、芽孢桿菌（2%～6%）、酸桿菌Gp4（1%～7%）、貝氏線菌（Bellilinea，1%～3%）和鞘氨醇桿菌（Sphingosinicella，1%～2%）。不同的農(nóng)田利用方式和污染水平均影響土壤根際細(xì)菌群落的組成和多樣性。

功能基因豐度變化如圖4（c）所示，旱地的HMs抗性基因和PAHs降解基因豐度明顯高于水田，HMs耐受性基因和PAHs 降解基因的豐度隨污染程度升高而顯著提升。例如，czcA 基因豐度（以干質(zhì)量計(jì)）從9.56×106 copies·g-1增加至1.01×108 copies·g-1，增長(zhǎng)約9.6 倍；copA 基因豐度從1.67×107 copies·g-1 增加至3.20×108 copies·g-1，增長(zhǎng)約18.2倍；GNRHD 基因豐度從2.91×106 copies·g-1增加至1.33×108 copies·g-1，增長(zhǎng)約44.7倍。旱地中czcA、copA 基因豐度最高，而水田中arsB、copA 基因豐度最高。此外，芽孢桿菌和鞘氨醇單胞菌豐度呈現(xiàn)旱地大于水田的趨勢(shì)。已有研究表明芽孢桿菌和鞘氨醇單胞菌能耐受HMs 并降解PAHs[38]，例如能耐受101.6 mg·kg-1 Cu的鞘氨醇單胞菌PHE-1還能降解菲[39]。水田土壤中的酸桿菌含量提高，這可能是由于高污染水平使植物產(chǎn)生次生代謝物進(jìn)而募集酸桿菌[40]，以抵抗土壤HMs上升所帶來(lái)的影響。鑒于本實(shí)驗(yàn)樣本點(diǎn)數(shù)量有限且分布范圍相對(duì)集中，其結(jié)果僅能反映該特定區(qū)域微生物群落以及HMs耐受性基因和PAHs降解抗性基因的變化情況。

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的相關(guān)性分析

根際微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成受HMs、PAHs和環(huán)境變量的顯著影響。通過相關(guān)性熱圖和冗余分析（RDA），研究了不同HMs-PAHs 及環(huán)境因素對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)的影響，并選取具有代表性的優(yōu)勢(shì)菌屬豐度作為典型指標(biāo)。由圖5（a）可知，在水田中，短波單胞菌屬（Brevundimonas）和Gaiella 的豐度與As含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），在旱地土壤中硫桿菌與Cu、Pb呈顯著相關(guān)，而鞘氨醇單胞菌則與Cr、Ni呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，土壤pH值已被證明是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素[41-42]，水田中pH 與大多菌屬豐度呈負(fù)相關(guān)，而旱地土壤中則大多呈現(xiàn)正相關(guān)。

圖5（b）為不同農(nóng)用地利用類型與HMs-PAHs及環(huán)境因子間的RDA分析。結(jié)合圖5（a）可知，As、Pb、Cd和PAHs是顯著影響土壤優(yōu)勢(shì)菌群的因素，其中As對(duì)水田土壤根系優(yōu)勢(shì)菌群影響最為顯著，其次為Pb、Cd及PAHs；OM對(duì)旱地土壤微生物如貝氏線菌、小梨形菌（Pirellula）影響較大。結(jié)果表明錳礦區(qū)旱地與水田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受多種HMs、PAHs和環(huán)境因素協(xié)同選擇。

2.5 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

研究著重分析了位于模塊中心的關(guān)鍵物種，結(jié)果見圖6。隨著污染程度不斷加深，旱地土壤微生物群落聚類系數(shù)從1.00 降為0.66，模塊化程度平均值為0.94，旱地土壤主要菌門由變形菌門（Proteobacteria，43.1%）和放線菌門（Actinobacteria，11.5%）逐漸變?yōu)閮H有變形菌門（48.2%），表明變形菌門在旱地土壤中對(duì)土壤污染變化敏感，如鞘氨醇單胞菌的豐度也隨污染加深逐步增加，并成為新的優(yōu)勢(shì)菌種。這一結(jié)果與前述分析一致，其能夠通過協(xié)同作用與其他菌種共同適應(yīng)環(huán)境壓力[40]，通過參與HMs代謝或產(chǎn)生蛋白，使植物對(duì)HMs和PAHs共存污染物產(chǎn)生抗性，因此能有效對(duì)旱地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)提供指示。水田土壤微生物群落間聯(lián)系性加強(qiáng)，平均模塊化程度為12.82，3種污染程度下，優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門、放線菌門和酸桿菌，結(jié)果與前人研究一致[43]。值得注意的是，隨著污染程度不斷升高，酸桿菌門和變形菌門在水田土壤中的占比不斷提高，分別從6.51% 和41.38% 提高至7.82%和44.03%，放線菌門則下降了0.5個(gè)百分點(diǎn)，酸桿菌門和變形菌門能有效反映水田中的污染風(fēng)險(xiǎn)變化，如鞘氨醇單胞菌、Gp4 和Gp6。總的來(lái)說(shuō)，在結(jié)構(gòu)上水田具有更復(fù)雜、穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這可能是由于HMs-PAHs 共存污染對(duì)旱地影響作用大于水田，Cd和As離子及其化合物對(duì)土壤毒性影響逐步加深導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化。

3 結(jié)論

（1）錳礦區(qū)旱地與水田土壤HMs-PAHs共存污染呈現(xiàn)顯著空間差異。旱地土壤Cd、As及PAHs污染程度顯著高于水田，且旱地Cd生物有效性更高，表明礦區(qū)周邊不同土地類型顯著影響污染物遷移轉(zhuǎn)化。

（2）共存污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)HMs 主導(dǎo)特征。綜合污染指數(shù)分級(jí)顯示，Cd（污染因子最高）與As、Pb構(gòu)成主要生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)源，PAHs次之。風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)排序?yàn)镃dgt;Asgt;Pbgt;PAHs，提示礦區(qū)污染治理需優(yōu)先協(xié)同控制HMs-PAHs。

（3）微生物群落結(jié)構(gòu)響應(yīng)污染梯度呈現(xiàn)規(guī)律性演替，重污染區(qū)以耐受菌屬如重金屬抗性菌Gp6、PAHs降解菌如鞘氨醇單胞菌為優(yōu)勢(shì)類群；中、輕污染區(qū)則以富集功能菌屬如硫桿菌為優(yōu)勢(shì)類群。旱地微生物以Cd為關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，而水田細(xì)菌群落受PAHs影響更顯著，揭示了污染物類型通過改變生境選擇壓力塑造微生物群落組裝模式。

（4）該區(qū)域共存污染程度與czcA 等HMs 耐受基因和PAHs降解基因呈顯著正相關(guān)，鞘氨醇單胞菌可能作為該區(qū)域共存污染特征下的潛在生物標(biāo)志物，其攜帶的多重HMs抗性基因和PAHs降解基因（如重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、PAHs環(huán)羥化酶基因）證實(shí)微生物在共存污染脅迫下實(shí)現(xiàn)了進(jìn)化適應(yīng)。

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（責(zé)任編輯：李丹）