漢源地區(qū)花椒揮發(fā)油GC-MS 指紋圖譜的構(gòu)建

摘 要：【目的】為漢源地區(qū)花椒的產(chǎn)地鑒定和品質(zhì)分級(jí)提供參考?！痉椒ā窟x取漢源縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的20 個(gè)花椒材料作為樣品，采用水蒸氣蒸餾法制備漢源花椒揮發(fā)油，運(yùn)用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行揮發(fā)油成分的分析和鑒定，采用峰面積歸一法計(jì)算組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用聚類分析和主成分分析進(jìn)行分類，再運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件構(gòu)建指紋圖譜并計(jì)算相似度?！窘Y(jié)果】從漢源地區(qū)花椒揮發(fā)性物質(zhì)中分離出60 多種成分，20 份樣品的揮發(fā)性成分相近且種類差別較小，包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類等，其中前3 類的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。分類分析結(jié)果表明20 份花椒樣品不存在差異較大的樣品，滿足建立指紋圖譜的條件。通過構(gòu)建漢源地區(qū)花椒揮發(fā)性成分指紋圖譜，標(biāo)定出19 個(gè)共有峰為漢源花椒揮發(fā)性物質(zhì)特征峰，分別為α- 蒎烯、檜烯、β- 水芹烯、β- 蒎烯、β- 月桂烯、D- 檸檬烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、芳樟醇、香茅醛、α-松油醇、香芹酮、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯、橙花醇乙酸酯、乙酸香葉酯、石竹烯、γ- 楓香脂、大根香葉烯D，各樣品的圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.9 以上，表明建立的指紋圖譜可靠?！窘Y(jié)論】完成了揮發(fā)油GC-MS 指紋圖譜的構(gòu)建，該指紋圖譜可用于漢源地區(qū)花椒的產(chǎn)地鑒定、品質(zhì)評(píng)價(jià)及種質(zhì)資源研究。

關(guān)鍵詞：漢源；花椒；揮發(fā)油；GC-MS 指紋圖譜；聚類分析

中圖分類號(hào)：S602 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2025）01—0223—09

花椒Zanthoxylum bungeanum 種質(zhì)資源類型豐富且種植區(qū)域廣泛，不同種質(zhì)資源間表觀形態(tài)相似，加之各地命名方式不同，導(dǎo)致“同名不同物”等現(xiàn)象頻發(fā)，為花椒產(chǎn)地辨別帶來困難。四川省是我國花椒主產(chǎn)區(qū)，特別是漢源縣所產(chǎn)的漢源花椒，種植歷史悠久，自唐代起就被譽(yù)為“貢椒”，其品質(zhì)優(yōu)良、香氣濃郁，先后被列入《國家地理標(biāo)志產(chǎn)品名錄》和《中歐地理標(biāo)志合作和保護(hù)協(xié)定產(chǎn)品保護(hù)名錄》[1]。然而，由于缺乏有效的產(chǎn)地識(shí)別技術(shù)和質(zhì)量控制手段，漢源花椒在市場(chǎng)上屢遭假冒，嚴(yán)重影響其品牌信譽(yù)和產(chǎn)業(yè)效益?，F(xiàn)行評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要依賴?yán)砘笜?biāo)和感官評(píng)定[2-4]，難以客觀、全面地區(qū)分漢源花椒的真?zhèn)魏推焚|(zhì)。因此，建立一種科學(xué)、精準(zhǔn)的產(chǎn)地鑒定方法和品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，對(duì)保護(hù)漢源花椒品牌至關(guān)重要。

指紋圖譜技術(shù)以其專屬性強(qiáng)、可量化分析等特點(diǎn)，在中藥質(zhì)量控制與鑒別、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物化工及電子技術(shù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5]。其中，基于香氣特征的指紋圖譜被廣泛用于“道地藥材”的鑒別。GC-MS 聯(lián)用技術(shù)能夠高效解析花椒揮發(fā)油的化學(xué)成分[6-7]，為構(gòu)建花椒揮發(fā)油指紋圖譜提供了可靠手段。目前，國內(nèi)外研究者已對(duì)青花椒與紅花椒、不同產(chǎn)區(qū)花椒的揮發(fā)性成分進(jìn)行了指紋圖譜研究[8-11]，并探討了不同加工工藝對(duì)花椒揮發(fā)油的影響[12]?；ń返钠焚|(zhì)受產(chǎn)地環(huán)境（如氣候、海拔、土壤）、品種及加工方式等因素影響顯著，已有研究結(jié)果顯示，甘肅武都花椒[13] 和貴州頂壇花椒[14] 的指紋圖譜特征成分存在明顯差異。目前，鮮見關(guān)于漢源花椒的指紋圖譜研究，無法滿足其產(chǎn)地鑒別與品質(zhì)控制的需求。本研究中以漢源花椒揮發(fā)油為研究對(duì)象，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，結(jié)合聚類分析和主成分分析分析，構(gòu)建漢源花椒的特征指紋圖譜，旨在為其產(chǎn)地溯源和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

漢源縣位于四川省雅安市西南部，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，冬暖夏涼，四季分明。雨量偏少且不均，氣候垂直變化大。年均氣溫22 ℃，日照時(shí)長1 450 h，年活動(dòng)積溫5 844.7 ℃，氣候溫暖，光照充足。

1.2 主要材料與試劑

以正常生長發(fā)育的成熟花椒果實(shí)為樣品。20份花椒果實(shí)樣品采自漢源縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的種植園，采摘地點(diǎn)和采摘時(shí)間如表1 所示。S1 ～ S14 品種為漢源花椒，S15 ～ S17 為四川省農(nóng)業(yè)特色植物研究院自有花椒品種（自漢源花椒的芽變材料中選育出來的新品種），S18 ～ S20 為四川省農(nóng)業(yè)特色植物研究院選育的花椒優(yōu)良種質(zhì)資源（自漢源花椒中選育的新材料），S1 ～ S20 號(hào)花椒的培育管理方式相同。

石油醚、無水硫酸鈉均為分析純，購自東莞市勛業(yè)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

JJ-2B粉碎機(jī)，購自上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；1 L 揮發(fā)油提取器，購自睢縣泳洋玻璃儀器有限公司；AB-L 分析天平，購自梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；單四極桿Trace1300/ISQ7000氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，購自美國賽默飛世爾科技公司；BCD-215TD GA 電冰箱，購自青島海爾股份有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 供試液制備

把干燥、去雜、除籽的花椒果實(shí)樣品粉碎，過篩（孔徑0.25 mm），混合均勻后稱取10.000 0 g，置于揮發(fā)油提取器中，加數(shù)粒玻璃珠，加入400 mL蒸餾水進(jìn)行蒸餾，控制油滴從冷凝管緩慢滴下，持續(xù)回流3 ～ 4 h，將收集到的揮發(fā)油以適量無水乙醚溶解，加入適量無水硫酸鈉吸水，置于-20 ℃冰箱中保存過夜。在GC-MS 進(jìn)樣前，經(jīng)濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，即得樣品供試液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為熱電氣相色譜柱TG-5SILMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫：初始柱溫50 ℃，維持1 min；以3 ℃ /min 的速度升至75 ℃，維持5 min；再以3 ℃ /min 的速度升至100 ℃，維持5 min；最后以5 ℃ /min 的速度升至230 ℃，維持5 min。載氣為高純度氦氣，進(jìn)樣量為2 μL，進(jìn)樣溫度為230 ℃，檢測(cè)器溫度為260 ℃，分流比為40∶1，溶劑延遲時(shí)間為4 min。

1.4.3 MS 條件

選用EI 離子源，離子源溫度為250 ℃，傳輸線溫度為240 ℃，四極桿溫度為150 ℃，掃描范圍（質(zhì)量與電荷之比，m/z）50 ～ 300 amu，利用NIST17 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)各揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。所有樣品在相同條件下檢測(cè)，供試液平行進(jìn)樣3 次，并記錄樣品的GC-MS 總離子流圖等信息。采用檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST 17）對(duì)花椒揮發(fā)油色譜圖中的共有峰進(jìn)行定性，1.5 數(shù)據(jù)處理與分析。指紋圖譜建立和相似度分析采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）軟件，作圖采用Origin 2022 軟件，顯著性、聚類、主成分分析采用IBM SPSS 26.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察[15]

2.1.1 精密度

制備S7 號(hào)樣品揮發(fā)油供試液，在相同GC 色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。設(shè)參照峰為分離度較好且穩(wěn)定的D- 檸檬烯，計(jì)算其余共有峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明該儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性

制備S7 號(hào)樣品揮發(fā)油供試液，在相同GC 色譜條件下進(jìn)樣，每份供試液重復(fù)測(cè)定3 次，記錄色譜圖。設(shè)D- 檸檬烯為參照峰，計(jì)算其余共有峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

制備S7 號(hào)樣品揮發(fā)油供試液，分別在室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h 后進(jìn)樣，記錄色譜圖。設(shè)D- 檸檬烯為參照峰，計(jì)算其余共有峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明供試液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 漢源地區(qū)花椒的揮發(fā)性成分分析

2.2.1 揮發(fā)性成分的鑒定

S1 ～ S20 漢源地區(qū)花椒揮發(fā)油GC-MS 總離子流見圖1。從圖1 可見，各樣品的色譜峰分離較好，總體相似，表明20 份花椒樣品的揮發(fā)性成分較為相近。采用標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索的結(jié)果表明，漢源地區(qū)花椒揮發(fā)性成分包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類（圖2），其中烯烴類、醇類、酯類物質(zhì)種類較多。這些揮發(fā)性成分具有明顯的呈香特性，共同構(gòu)成了漢源地區(qū)花椒的特殊香氣特征。

將共有峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索時(shí)，選擇匹配度大于95% 的組分，用峰面積歸一法計(jì)算組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，記錄相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.1% 的組分，結(jié)果見表2，由表2 可知，漢源地區(qū)花椒共有的主要揮發(fā)性成分為D- 檸檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯、β- 蒎烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、大根香葉烯D、L-α-松油醇、檜烯、γ- 楓香脂。與侯瑩瑩等[13] 所測(cè)的武都花椒相比，漢源地區(qū)花椒的酯類物質(zhì)相對(duì)含量高，漢源地區(qū)花椒具有β- 蒎烯、D- 檸檬烯、芳樟醇、紫蘇烯相對(duì)含量較高的特點(diǎn)，武都花椒具有α- 蒎烯、桉葉醇、水芹烯的相對(duì)含量較高的特點(diǎn)。與邊甜甜等[12] 所測(cè)的甘肅隴南花椒相比，漢源地區(qū)花椒的β- 蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、紫蘇烯、γ- 楓香脂等相對(duì)含量較高，隴南花椒的乙酸芳樟酯、β- 胡椒烯等的相對(duì)含量較高。有8 種物質(zhì)與課凈璇等[8] 測(cè)定的漢源紅花椒中11 種特征物質(zhì)保持一致，但物質(zhì)的相對(duì)含量存在差異，可能與品種或成熟時(shí)間不同有關(guān)，也可能是土壤條件不同[16] 或花粉傳播促進(jìn)了種質(zhì)資源之間基因交流造成的[17-18]。

2.2.2 揮發(fā)性成分的聚類分析和主成分分析

為了排除差異較大的樣品，建立穩(wěn)定的指紋圖譜，將20 份樣品的共有峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)平方歐氏距離大于13 時(shí)，20 個(gè)樣品可被聚為2 類，S8 為單獨(dú)一類，可能與該樣品中L-α- 松油醇相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（9.3843%）有關(guān)，其余樣品歸為一類；當(dāng)平方歐氏距離不大于13 時(shí)，后一類又可聚為2 類，其中S2、S7、S13、S5、S20、S10、S6、S11、S1、S3、S9、S14 為一類，S17、S18、S12、S15、S16、S4、S19 為一類，可能與前者中醛類、酮類物質(zhì)相對(duì)含量顯著高于后者，且烯烴類的相對(duì)含量顯著低于后者有關(guān)。聚類分析結(jié)果顯示，不同的漢源地區(qū)花椒在揮發(fā)性成分上存在差異，但從整體上不存在差異性較大的樣品，表明樣品滿足指紋圖譜的構(gòu)建要求。這可能與花椒生長在相同的地理環(huán)境和采用相同的栽培管理方式有關(guān)。

將20 份花椒樣品的共有峰面積進(jìn)行主成分分析，并對(duì)特征值進(jìn)行降維處理，得出降維后的特征值和方差貢獻(xiàn)率，特征值大于1 的主成分有4 個(gè)，累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.06%，表明這4 個(gè)主成分能夠較好地代表漢源花椒揮發(fā)性成分的基本特征值和主要信息。由圖4 中空間散點(diǎn)的距離可知，S8 為單獨(dú)一類，其他樣品聚為一類，這與聚類分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說明所采樣品滿足構(gòu)建指紋圖譜的要求。

2.3 漢源地區(qū)花椒揮發(fā)性成分GC-MS 指紋圖譜構(gòu)建

在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入20 份漢源花椒樣品的色譜信息，經(jīng)參照峰選擇、多點(diǎn)校正、Mark 峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（圖5），并進(jìn)行相似度分析。由圖5 可知，樣品在38 min 內(nèi)出峰較為集中，根據(jù)GC-MS 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（R）篩選出19 個(gè)特征峰為漢源花椒揮發(fā)性成分的指紋峰，各樣品的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.933 0 ～ 0.982 5，表明20 份花椒樣品具有較好的相似性，所構(gòu)建的指紋圖譜對(duì)漢源花椒GC-MS 圖譜中的有效成分信息表達(dá)得比較全面，構(gòu)建的特征指紋圖譜信息具有可靠性。

圖5 中標(biāo)注的1 ～ 19 號(hào)指紋峰分別代表的化學(xué)物質(zhì)為10 種烯烴類、5 種酯類、2 種醇類、1 種醛類和1 種酮類（表3）。由表3 可知，漢源花椒的特征揮發(fā)性成分按出峰先后依次為α- 蒎烯、檜烯、β- 水芹烯、β- 蒎烯、β- 月桂烯、D- 檸檬烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、芳樟醇、香茅醛、α- 松油醇、香芹酮、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯、橙花醇乙酸酯、乙酸香葉酯、石竹烯、γ- 楓香脂、大根香葉烯D。不同于課凈璇等[8]、葉洵等[11]、侯瑩瑩等[13] 所測(cè)特征峰物質(zhì)，這19 種物質(zhì)可作為漢源花椒的特征性物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)20 份漢源花椒樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性成分組成相近，差異較小。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要成分包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類，其中烯烴類、醇類和酯類成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。本研究中構(gòu)建的GC-MS 指紋圖譜共標(biāo)定19 種特征性物質(zhì)：α- 蒎烯、檜烯、β- 水芹烯、β- 蒎烯、β-月桂烯、D- 檸檬烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、芳樟醇、香茅醛、α- 松油醇、香芹酮、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯、橙花醇乙酸酯、乙酸香葉酯、石竹烯、γ-楓香脂、大根香葉烯D。指紋圖譜相似度均在0.9以上，表明所建指紋圖譜方法可靠，可用于漢源花椒的產(chǎn)地鑒定、品質(zhì)評(píng)價(jià)及種質(zhì)資源研究。

本研究中首先明確了漢源花椒揮發(fā)性物質(zhì)的GC 分離方法，確定了出峰數(shù)量多、分離度好、峰形理想的氣相色譜參數(shù)。通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫比對(duì)定性，采用峰面積歸一化法計(jì)算主要組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其次對(duì)20 份漢源花椒揮發(fā)物質(zhì)樣品進(jìn)行了成分分析鑒定，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性成分相近，組間差異較小。該結(jié)論與葉洵等[11]、朱琳[19]、劉振平等[20] 的研究成果一致，采用GC-MS 和電子鼻等手段進(jìn)行測(cè)定分析的結(jié)果均表明漢源花椒具有獨(dú)特的風(fēng)味特征，在聚類分析和主成分分析結(jié)果中被單獨(dú)歸為一類，證實(shí)花椒風(fēng)味受產(chǎn)地因素影響較大。但這些研究中建立的指紋圖譜和所標(biāo)記的紅花椒共有峰物質(zhì)與本研究均存在差異，可能與采收時(shí)間、保存條件或提取方法不同有關(guān)。

從20 份樣品中共鑒定出60 多種揮發(fā)性成分，共同構(gòu)成了漢源花椒的香氣特征。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，揮發(fā)性成分包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類等，其中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的物質(zhì)為烯烴類，然后依次是醇類、酯類。聚類分析和主成分分析結(jié)果表明，產(chǎn)區(qū)為漢源縣的20 個(gè)花椒樣品揮發(fā)性物質(zhì)組分相似性較大，根據(jù)指紋圖譜標(biāo)定出20 份漢源花椒樣品的19種共有組分。該結(jié)論和課凈璇等[8] 的部分研究結(jié)果吻合，均檢測(cè)到乙酸松油酯、乙酸橙花酯和乙酸香葉酯等特征酯類物質(zhì)，這些成分對(duì)漢源花椒的優(yōu)質(zhì)香氣具有重要貢獻(xiàn)。但在本研究中未檢測(cè)出崖柏烯和1- 石竹烯，可能與檢測(cè)條件、品種差異或成熟度有關(guān)。

漢源縣獨(dú)有的亞熱帶季風(fēng)氣候和黃棕壤等條件共同塑造了漢源花椒獨(dú)有的香氣特征[21]。這種地理標(biāo)志性特征的形成機(jī)制有待深入研究。漢源花椒作為一種高級(jí)食用香料，其揮發(fā)性物質(zhì)不但可被作為原料的重要品質(zhì)指標(biāo)，而且對(duì)其深加工產(chǎn)品的風(fēng)味特性具有決定性影響。本研究中僅以當(dāng)季鮮品花椒為材料，未涉及漢源花椒的不同加工產(chǎn)品和貯藏不同時(shí)間后的材料，所以僅適合用于當(dāng)季原料的鑒定。對(duì)不同加工工藝下漢源花椒制品和長期貯藏花椒原料中的揮發(fā)物質(zhì)成分分析及產(chǎn)地鑒定尚待研究。

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[ 本文編校：聞 麗]

基金項(xiàng)目：四川省科技廳基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（23JDKY06）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川花椒創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SCCXTD-2024-23）；雅安市創(chuàng)建國家現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中心“揭榜掛帥”項(xiàng)目（kczx2023-2025-20）。