農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及優(yōu)化

摘要：以稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）為試驗(yàn)材料，通過PCR獲得GFP基因，構(gòu)建pBarg-GFP-BAR-Amp重組載體，使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得能夠穩(wěn)定遺傳的含GFP基因的稻瘟病菌菌株，采用單因素與響應(yīng)面法優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件。稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的最佳轉(zhuǎn)化條件：OD600 nm為 0.38（農(nóng)桿菌菌液濃度）、共培養(yǎng)溫度為28.2 ℃、共培養(yǎng)時間為2.12 d，轉(zhuǎn)化效率為280.00×10-5。PCR鑒定和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌GFP基因能夠正常表達(dá)，和野生型稻瘟病菌的致病性無顯著差異。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化；GFP基因；建立；優(yōu)化

中圖分類號：S432.4" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0182-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.029 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Establishment and optimization of Agrobacterium mediated genetic transformation system for Magnaporthe oryzae

LI Shuang1，ZHANG Shu-mei1，TIAN Yuan1，2，PAN Yu1，3，LIU Wei1，YAN Geng-xuan1

（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin" 150010，China；2. College of Food Science，Northeast Agricultural University， Harbin" 150030，China；3. School of Life Sciences， Heilongjiang University，Harbin" 150006，China）

Abstract： Magnaporthe oryzae was used as the experimental material. The GFP gene was obtained through PCR， and a pBarg-GFP-BAR-Amp recombinant vector was constructed. The Magnaporthe oryzae strain containing the GFP gene with stable inheritance was obtained using Agrobacterium-mediated transformation. The transformation conditions were optimized using single factor and response surface methodology. The optimal transformation conditions for the Magnaporthe oryzae genetic transformation system were an OD600 nm of 0.38 （Agrobacterium concentration）， a co-culture temperature of 28.2 ℃， a co-culture time of 2.12 days， and a transformation efficiency of 280.00×10-5. PCR identification and fluorescence microscopy observation revealed that the GFP gene of the transformant Magnaporthe oryzae could be expressed normally， with no significant difference in pathogenicity compared to the wild-type Magnaporthe oryzae.

Key words： Magnaporthe oryzae； Agrobacterium mediated； genetic transformation； GFP gene； establish； optimization

水稻是全球五大糧食作物之一，水稻產(chǎn)量的不穩(wěn)定是導(dǎo)致糧食危機(jī)的重要原因［1］，近年來以真菌為主的病害頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。水稻稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的真菌性病害，稻瘟病菌侵染水稻時可通過分生孢子接觸侵入水稻葉片并擴(kuò)散到細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)大面積的病害［2］，稻瘟病發(fā)病時會導(dǎo)致水稻減產(chǎn)，部分區(qū)域甚至顆粒無收［3］。稻瘟病菌生理小種變異速度快，流行性強(qiáng)，培育抗病品種難以一勞永逸地滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求［4］，為促進(jìn)優(yōu)良抗病品種的選育，建立高效、便捷的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化體系對致病及預(yù)防機(jī)理的研究具有重要意義。

稻瘟病菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化難度較大。常規(guī)方法是通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將外源DNA引入受體細(xì)胞［5］，但原生質(zhì)體制備以及共培養(yǎng)等過程的不穩(wěn)定性直接影響轉(zhuǎn)化效率［6］。本研究將綠色熒光蛋白GFP基因?qū)刖哂胁蒌@膦抗性的質(zhì)粒pBarg中，以農(nóng)桿菌EHA105為介導(dǎo)，通過凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，并將表達(dá)GFP基因的農(nóng)桿菌菌液與稻瘟病菌孢子液混合共培養(yǎng)獲得能夠穩(wěn)定遺傳GFP基因的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化株，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，為進(jìn)一步研究稻瘟病菌的致病機(jī)制以及防治措施提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Magnaporthe oryzae菌株由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒pCamb-GFP、質(zhì)粒pBarg-BAR-Amp（草銨膦-氨芐青霉素抗性）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）PDA培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 2 g，蛋白胨 2 g，瓊脂粉20 g等。

2）LB培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g等。

3）YM培養(yǎng)基（1 L）：酵母膏0.4 g，D-甘露醇10 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g等。

4）IM培養(yǎng)基（1 L）：磷酸氫鉀緩沖液 10 mL（K-Buffer： 200 g/L K2HPO4，145 g/L KH2PO4，pH 7.0），硫酸鎂-氯化鈉溶液20 mL（M-N Buffer：30 g/L MgSO4·7H2O，15 g/L NaCl），1% CaCl2·2H2O 1 mL，20%葡萄糖10 mL，20%（NH4）2SO4 2.5 mL，50%甘油10 mL，0.01% FeSO4 10 mL，1 mg/mL 2-（N-嗎啉基）乙磺酸鈉（MES） 10 mL。

1.1.3 抗生素及其他試劑 氨芐青霉素、利福平、二甲亞砜均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，草銨膦購于上海圣鼎生物科技有限公司，乙酰丁香酮購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，瓊脂粉購于蘭杰柯科技有限公司，Loading Buffer、DNA marker購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GFP基因序列設(shè)計(jì)上下游特異性引物，上游引物GFP-F1（5′-GTTGTCGACGGATGGTGAGCAAGG-3′），下游引物GFP-R1（5′-CGCGGATCCGCTTGTACAGCTCGTC-3′），通過PCR擴(kuò)增GFP基因片段，PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板1 μL（來源于pCamb-GFP質(zhì)粒），上游引物1 μL，下游引物" 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 循環(huán)體系：94 ℃預(yù)變性" 5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸" " " "1 min（30 個循環(huán)）；72 ℃延伸10 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用DNA回收試劑盒純化回收GFP基因片段［7］。將回收的GFP基因片段連接至pBarg質(zhì)粒，得到載體pBarg-GFP-BAR-Amp，將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，在含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取轉(zhuǎn)化子在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)12 h。將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.2.2 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng) 將pBarg-GFP-BAR質(zhì)粒通過液氮凍融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105中［8］，涂布在含50 μg/mL氨芐青霉素、100 μg/mL利福平的YM平板上，30 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取轉(zhuǎn)化子接種于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的YM液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 160 r/min培養(yǎng)24 h，加入無抗生素的YM液體培養(yǎng)基（含200 mmol/L乙酰丁香酮，AS）至OD600 nm為0.15［9］，搖床上繼續(xù)培養(yǎng)12 h，至 OD600 nm為0.4時備用。

1.2.3 稻瘟病菌對草銨膦敏感性測定 配置含有不同濃度（0、50、100、150、200、250 μg/mL）草銨膦的 PDA 平板，將稻瘟病菌打成5 mm的菌餅接種在PDA平板中央，30 ℃培養(yǎng) 5 d，觀察菌落生長狀態(tài)并測量菌落直徑，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化 將活化的稻瘟病菌制成濃度為1×105個/mL的分生孢子懸浮液，取200 μL培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液（OD600 nm為0.4）和100 μL分生孢子懸浮液混勻，將300 μL混合液涂布在IM平板的硝酸纖維素膜上［10］，28 ℃共培養(yǎng)" " " 2 d［11］后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含草銨膦的IM平板上［12］，28 ℃培養(yǎng)2～5 d獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化 影響稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化的因素主要包括農(nóng)桿菌菌液濃度（用OD600 nm表示）、稻瘟病菌分生孢子液濃度、共培養(yǎng)溫度［13］、共培養(yǎng)時間［14］，通過單因素試驗(yàn)，篩選影響產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的主要因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析［15］。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以農(nóng)桿菌菌液濃度（A）、共培養(yǎng)溫度（B）和共培養(yǎng)時間（C）為因素設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)［16］，優(yōu)化稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化的條件，因素與水平如表 2 所示。

采用SPSS Statistics 26.0軟件處理數(shù)據(jù)，Origin 2021軟件繪圖，Design Expert 13軟件進(jìn)行響應(yīng)面相關(guān)結(jié)果分析。

1.2.7 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性和致病性測定 為檢測稻瘟病菌重組轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，隨機(jī)挑選3個轉(zhuǎn)化子，接種到不含草銨膦的PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)5 d，挑取平板邊緣新長出的菌絲轉(zhuǎn)接新的不含草銨膦PDA平板上［17］，重復(fù)4次，將第5代轉(zhuǎn)化子接種到含草銨膦（250 μg/mL）的 PDA平板上，觀察生長狀況［18］。采用水稻離體葉片接種進(jìn)行致病性測定［19］。在平板中鋪2層吸水紙，用水浸濕，將長至3～4葉的水稻葉片剪成長約5 cm小段放在吸水紙上，每個平板放4片葉片，取3個轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌和野生型稻瘟病菌的分生孢子分別配成1×105個/mL 的懸浮液，取10 μL菌液滴在葉片上，28 ℃下光照培養(yǎng) 5 d，對比轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌和野生型稻瘟病菌的致病性。

1.2.8 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

1）轉(zhuǎn)化子 PCR 驗(yàn)證。使用真菌DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化子的DNA。以質(zhì)粒DNA為陽性對照，野生型稻瘟病菌的基因組DNA為陰性對照，采用 GFP基因特異性引物 GFP-F2（5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTCATCTTATACTGTCGGAGAATG-3′）和GFP-R2（5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATTTGTAGAGCTCA? TCCATG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中觀察凝膠是否有單一的明亮條帶。

2）轉(zhuǎn)化子熒光顯微鏡觀察鑒定。將轉(zhuǎn)化子打成5 mm菌餅并接種在含草銨膦的PDA平板上，將滅菌的載玻片斜放至PDA平板上，待菌絲長至載玻片后取出，在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察、拍照［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

參照“1.2”方法擴(kuò)增GFP基因片段（圖1），構(gòu)建并獲得了重組表達(dá)載體pBarg-GFP-BAR-Amp（圖2）。

2.2 不同濃度草銨膦對稻瘟病菌菌絲生長的影響

將稻瘟病菌接種到含不同濃度（0、50、100、150、200、250 μg/mL）草銨膦的 PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)" 5 d，測量菌落直徑，當(dāng)PDA平板中草銨膦濃度為50～200 μg/mL時，菌絲生長受到不同程度抑制；當(dāng)草銨膦濃度為250 μg/mL時菌絲被抑制程度最大（圖3）。因此選擇250 μg/mL草銨膦進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子篩選。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

1）農(nóng)桿菌菌液濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響。不同農(nóng)桿菌菌液濃度影響稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化效率（圖4）。隨著農(nóng)桿菌菌液濃度的升高轉(zhuǎn)化效率先升高后降低，當(dāng)OD600 nm為0.4時，轉(zhuǎn)化效率最高，當(dāng)OD600 nm大于0.4時轉(zhuǎn)化效率反而降低。因此農(nóng)桿菌菌液OD600 nm為0.4時將農(nóng)桿菌菌液與稻瘟病菌分生孢子液共培養(yǎng)。

2）稻瘟病菌分生孢子液濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響。不同稻瘟病菌分生孢子液濃度影響稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化效率（圖5）。隨著分生孢子液濃度的提高轉(zhuǎn)化效率先升高后降低，當(dāng)分生孢子液濃度為1×105個/mL時，轉(zhuǎn)化效率最大，為253.00×10-5。但當(dāng)孢子液濃度繼續(xù)增加獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量明顯下降。因此稻瘟病菌分生孢子液最佳濃度為1×105個/mL。

3）共培養(yǎng)溫度和時間對轉(zhuǎn)化效率的影響。由圖6、圖7可知，隨著稻瘟病菌分生孢子液與農(nóng)桿菌菌液共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間的升高轉(zhuǎn)化效率均呈先上升后下降趨勢，最佳共培養(yǎng)溫度為28 ℃、共培養(yǎng)時間為2 d。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果選出影響重組轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化效率較大的3個因素，分別為農(nóng)桿菌菌液濃度（A）、共培養(yǎng)溫度（B）、共培養(yǎng)時間（C），設(shè)計(jì)3個水平，共設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)（表3）。以農(nóng)桿菌菌液濃度、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間為自變量，以轉(zhuǎn)化效率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合分析，得到回歸模型方程：Y=280.4-13.5A+9.63B+11.63C+4.75AB-12.25AC-6.0BC-76.7A2-32.95B2-50.95C2。

對回歸模型進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，如表4所示，回歸模型F為75.82，Plt;0.000 1，說明模型具有極顯著性；失擬項(xiàng)F為2.06，P=0.248 1gt;0.05，表明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響較小；相關(guān)系數(shù)（R2）=0.965 5，表明響應(yīng)值的變化有96.55%來源于所選的自變量，試驗(yàn)值和預(yù)測值具有高度相關(guān)性。農(nóng)桿菌菌液濃度（A）、共培養(yǎng)時間（C）對轉(zhuǎn)化效率影響極顯著（Plt;0.01），共培養(yǎng)溫度（B）對轉(zhuǎn)化效率影響顯著（Plt;0.05）。二次項(xiàng)A2、B2、C2對轉(zhuǎn)化效率影響極顯著（Plt;0.01），交互項(xiàng)AB（農(nóng)桿菌菌液濃度和共培養(yǎng)溫度）、BC（共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時間）對轉(zhuǎn)化效率影響不顯著（Pgt;0.05），AC（農(nóng)桿菌菌液濃度和共培養(yǎng)時間）對轉(zhuǎn)化效率的影響顯著（Plt;0.05）。

響應(yīng)面三維曲面圖能體現(xiàn)農(nóng)桿菌菌液濃度（A）、共培養(yǎng)溫度（B）、共培養(yǎng)時間（C）3 個單因素之間的交互作用對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果（圖8）顯示，3個因素對轉(zhuǎn)化效率影響的顯著性順序?yàn)檗r(nóng)桿菌菌液濃度（A）gt;共培養(yǎng)時間（C）gt;共培養(yǎng)溫度（B）。根據(jù)回歸模型得到最佳轉(zhuǎn)化條件：OD600 nm為0.38（農(nóng)桿菌菌液濃度）、共培養(yǎng)溫度為28.2 ℃、共培養(yǎng)時間為2.12 d，轉(zhuǎn)化效率為282.33×10-5。采用最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)［21］，轉(zhuǎn)化效率為280.00×10-5，與預(yù)測值接近，顯示該模型的擬合度較好，具有參考價值。

2.4 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性檢測和致病性檢測

隨機(jī)選取 3個轉(zhuǎn)化子接種到 PDA平板上培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)到第5 代后再轉(zhuǎn)接到含草銨膦的 PDA平板上培養(yǎng)48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個轉(zhuǎn)化子生長正常，表明重組表達(dá)載體pBarg-GFP-BAR-Amp已轉(zhuǎn)入稻瘟病菌基因組，可以穩(wěn)定遺傳。

將3個轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌與野生型稻瘟病菌分別接種到水稻葉片，由圖9a可知，轉(zhuǎn)入的 GFP 基因?qū)Φ疚敛【虏×缀鯚o影響。使用雙波長熒光蛋白激發(fā)光源照射被轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌侵染的水稻葉片，葉片的病斑處發(fā)出綠色熒光，如圖9b所示。

2.5 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

根據(jù)GFP基因設(shè)計(jì)特異性引物，以重組質(zhì)粒pBarg-GFP-BAR-Amp DNA為陽性對照，野生型稻瘟病菌DNA為陰性對照，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶回收后送至公司測序。由圖10可知，轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增出約750 bp的片段，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站與GFP基因比對，同源性為99.5%，表明GFP基因已成功轉(zhuǎn)入稻瘟病菌。據(jù)轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌與野生型稻瘟病菌在日光和熒光顯微鏡下的觀察（圖11），野生型稻瘟病菌菌絲未觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌平板有明顯綠色，熒光顯微鏡下可以觀察到菌絲發(fā)綠色熒光，證明GFP基因已轉(zhuǎn)入稻瘟病菌基因組。

3 討論

傳統(tǒng)稻瘟病菌防治技術(shù)的弊端較多，建立能夠穩(wěn)定遺傳稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化體系，采用直觀準(zhǔn)確的檢查方法對了解稻瘟病菌致病機(jī)制及侵染過程具有重要意義［22］。GFP基因作為標(biāo)記基因在顯微鏡下易觀察，熒光穩(wěn)定，受外界因素影響較小，易于載體構(gòu)建，可以動態(tài)觀察活體真菌內(nèi)部生物過程，是研究植物病害發(fā)生和發(fā)展過程的重要工具［23］。孫振琪等［24］通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體pMDC32-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，注射菌液到煙草葉片觀察熒光，為GFP基因作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)告基因提供基礎(chǔ)。本研究同樣選擇GFP基因?yàn)闃?biāo)記基因，用于后續(xù)dsRNA防治稻瘟病害的研究。將目的基因?qū)爰?xì)胞的方法主要有電擊轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。電擊轉(zhuǎn)化法效率高，但大約有70%的菌體被電擊死亡；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法不需制備原生質(zhì)體，受體廣泛，農(nóng)桿菌的T-DNA可以隨機(jī)插入基因組并且穩(wěn)定遺傳［25］，在轉(zhuǎn)化過程中加入適宜濃度的乙酰丁香酮可以提高轉(zhuǎn)化效率［26］，為正向遺傳篩選提供資源［27］，但該方法試驗(yàn)時間較長，可能會引起染色體重排［28］。張小蕊等［29］采用電擊轉(zhuǎn)化法成功獲得含GFP基因的解淀粉芽孢桿菌，該轉(zhuǎn)化子菌株與野生型稻瘟病菌生物學(xué)特性一致。嚴(yán)亞琴等［30］將GFP基因作為報(bào)告基因?qū)r(nóng)桿菌介導(dǎo)的茄子枯萎病菌的遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，建立穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)化體系。為保證轉(zhuǎn)化菌體的存活率，本研究采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得GFP基因標(biāo)記的稻瘟病菌，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率。

4 小結(jié)

本研究通過PCR獲得GFP基因片段，構(gòu)建pBarg-GFP-BAR-Amp重組載體，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得穩(wěn)定遺傳表達(dá)GFP基因的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化株系，用單因素與響應(yīng)面法優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的最佳轉(zhuǎn)化條件：OD600 nm為 0.38（農(nóng)桿菌菌液濃度）、共培養(yǎng)溫度為28.2 ℃、共培養(yǎng)時間為2.12 d，轉(zhuǎn)化效率為280.00×10-5。PCR檢測和熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，GFP基因成功轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌基因組，遺傳穩(wěn)定，與野生型稻瘟病菌的致病性無顯著差異。本研究為其他受體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化提供依據(jù)，為研究稻瘟病菌與水稻的互作機(jī)制提供技術(shù)支撐。

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