乳清蛋白負載茶黃素納米顆粒的制備和性能

摘要：為提高茶黃素的利用率，采用反溶劑法制備乳清蛋白-茶黃素（WP/TF）納米顆粒，以包埋率和穩(wěn)定常數(shù)為指標，通過單因素和正交試驗確定最佳制備工藝，采用粒徑、Zeta電位、胃腸模擬消化和貯藏穩(wěn)定性研究其性能。結(jié)果表明，乳清蛋白-茶黃素納米顆粒最佳制備工藝為WP/TF質(zhì)量比10∶1、水合溫度55 ℃、水合時間1.5 h，所得的納米包埋率為85.89%，粒徑為（557.05±32.55）nm，Zeta電位為（-58.83±3.05）mV，復(fù)溶性和水溶解度較好。胃腸模擬消化下，納米顆粒中TF釋放率顯著降低，具有良好的緩釋作用，在4 ℃和25 ℃條件下貯藏30 d后，包埋率下降，但4 ℃條件下包埋率仍保持在70%以上。因此，乳清蛋白-茶黃素納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性和緩釋性能，能提高茶黃素的利用率，對茶黃素的開發(fā)利用具有重要意義。

關(guān)鍵詞：茶黃素；乳清蛋白；納米顆粒；利用率

中圖分類號：TS201.2" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0122-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.020 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Preparation and properties of whey protein-supported theaflavins nanoparticles

ZHOU Zheng-jianga，JIANG Xing-jiaob，LUO Yan-kaic，F(xiàn)ANG Chong-yeb

（a.College of Tea Science；b. College of Food Science and Technology；c.College of Agronomy and Biotechnology，

Yunnan Agricultural University，Kunming" 650201，China）

Abstract： To improve the utilization rate of theaflavins， the reverse-solvent method was used to prepare whey protein-theaflavins（WP/TF） nanoparticles. The embedding rate and stability constant were used as indexes. The optimal preparation process was determined by single factor and orthogonal tests， and the performance of particle size， Zeta potential， gastrointestinal simulated digestion and storage stability were studied. The results showed that the optimum preparation process for whey protein-theaflavins nanoparticles was the WP/TF mass ratio of 10∶1， hydration temperature of 55 ℃， and hydration time of 1.5 h. The resulting nanoembedding rate was 85.89%， particle size was （557.05±32.55） nm， Zeta potential was （-58.83±3.05） mV， and the resolubility and water solubility were good. Under simulated gastrointestinal digestion， the TF release rate of nanoparticles was significantly reduced， and it had a good slow release effect. After 30 days of storage at 4 ℃ and 25 ℃， the inclusion rate decreased， but the inclusion rate remained above 70% at 4 ℃. Therefore， whey protein-theaflavins nanoparticles exhibited good stability and slow release performance and could improve the utilization rate of theaflavins， which was highly important for the development and utilization of theaflavins.

Key words： theaflavins; whey protein; nanoparticles; utilization rate

茶黃素（Theaflavins，TFs）是紅茶發(fā)酵過程中形成的標志性酚類化合物，能有效抑制和減緩多種疾病的發(fā)生，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎癥等多種功能[1]。一項隨機雙盲安慰劑對照試驗中，試受者在接受茶黃素（50 mg/d或100 mg/d），服用10周后顯著改善了體脂率、皮下脂肪和骨骼肌占比，顯著提升了健康個體的肌肉質(zhì)量[2]。目前只能通過服用來攝取茶黃素，研究表明口服茶黃素的生物利用率非常低，進入人體后在后小腸中的吸收較差，大部分將進入大腸；茶黃素在大腸中被腸道微生物群代謝為小分子化合物，少量被機體吸收利用，腸道吸收率極低使其應(yīng)用大大受限制[3]。因此，開發(fā)茶黃素產(chǎn)品，提高其生物利用率成為當(dāng)今國內(nèi)外研究的熱點。Fang等[4]報道了醇溶蛋白-羧甲基殼聚糖復(fù)合納米顆粒中包埋茶黃素能改善殼聚糖的光學(xué)性能、力學(xué)性能、阻水性能以及抗真菌和抗氧化活性。李藝等[5]制備了茶黃素-3，3′-雙沒食子酸酯-殼聚糖納米乳液，提高了茶黃素的生物利用率。

納米顆粒（Nano-Particles，NPs）是指具有內(nèi)部結(jié)構(gòu)或表面結(jié)構(gòu)的材料，能夠包埋親水和親油功能性營養(yǎng)物質(zhì)，具有載量高以及易于構(gòu)建和應(yīng)用方便等特性，在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6]。乳清蛋白（Whey protein，WP）是牛奶中重要的蛋白質(zhì)，其價格低廉，易于獲得，安全性高，具有較好的凝膠形成性和成膜性，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[7]。乳清蛋白分子中有親水基團和疏水基團，兩親的結(jié)構(gòu)賦予其優(yōu)異的穩(wěn)定性，可以與活性物質(zhì)通過組裝形成納米復(fù)合物并改善穩(wěn)定性、包埋率、生物活性[8]。Raei等[9]制備了乳清蛋白-果膠納米顆粒，具有良好的穩(wěn)定性和水溶性。袁麒等[10]通過制備乳清蛋白-桑椹多酚納米顆粒，顯著提高了其溶解性和抗氧化性。Hu等[11]證明乳清蛋白能通過疏水相互作用或氫鍵將柑橘皮中的類黃酮物質(zhì)包裹起來，包埋后的納米顆粒在體外模擬消化釋放穩(wěn)定性顯著提升，大大提高其生物利用率。上述研究證明乳清蛋白可作為一種極具潛力的多酚類物質(zhì)的負載載體，提高多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性，大幅度提高其生物利用率。

目前乳清蛋白對茶黃素穩(wěn)定性和釋放性的研究鮮有報道，因此本研究采用反溶劑法制備了乳清蛋白負載茶黃素WP/TF納米顆粒，對其包埋率、穩(wěn)定常數(shù)進行評估，并考察納米顆粒的水溶解度、濁度、貯藏穩(wěn)定性及胃腸模擬消化，為茶黃素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

材料：乳清蛋白（WP，純度≥80%）、胃蛋白酶（分析純）、胰蛋白酶（分析純）、茶黃素（TF，純度≥95%），上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸氫二鉀、濃鹽酸（分析純），天津致遠化學(xué)試劑有限公司。

儀器：R1001-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機，上海比郎儀器制造有限公司；Synergy H1型酶標儀，美國Biotek公司；Zetasizer Nano ZS90 型粒度電位儀，英國馬爾文公司；TD5型低速離心機，上海盧湘儀儀器有限公司；HZP-L502型 pH計，福建賽西節(jié)電子科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳清蛋白負載茶黃素納米顆粒的制備 參考Yang等[12]的方法，并稍作修改。取30 mg TF樣品溶于30 mL體積分數(shù)為80%的乙醇中，取300 mg乳清蛋白置于燒杯中，加120 mL體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，將二者混合后進行超聲處理，并進行攪拌水合。將水合后的分散液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡無水乙醇，加入去離子水使納米顆粒液終體積與分散液初體積一致，得到乳清蛋白負載茶黃素的納米液。

1.2.2 茶黃素標準曲線的制作及含量的測定 制備茶黃素標準溶液，利用酶標儀法進行標準曲線的制作。準確稱取50 mg TF，溶于無水乙醇中，定容至50 mL，TF含量為1 mg/mL，按照一定比例稀釋分別配制成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的TF標準液，在380 nm處檢測其吸光度，以TF濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并測定樣品TF的含量。

1.2.3 包埋率和離心穩(wěn)定性的測定 參考房美含[13]的方法，并稍作修改。取納米液2 mL于10 mL試管中，在3 000 r/min下離心3 min，按照“1.2.2”方法測定上清液的吸光度。每個樣品平行測3次。根據(jù)已得到的標準曲線公式計算上清液中TF含量，再根據(jù)以下公式計算藥物包埋率（EE）。

[EE=W1W]×100% " " " " " " （1）

式中，W1為納米液樣品中包埋茶黃素的含量；W為納米液樣品中茶黃素總含量。

取2 mL納米液于3 000 r/min下離心3 min，測定上清液的吸光度，每個樣品平行3次。通過以下公式計算離心穩(wěn)定常數(shù)（K）。

K=[A1A0]×100%" " " （2）

式中，A0為納米液樣品離心前吸光度；A1為納米液樣品離心后上清液的吸光度。

1.2.4 單因素試驗 以WP/TF質(zhì)量比、水合溫度、水合時間為因素，考察每個單因素對其包埋率的影響，可得最佳制備工藝。研究不同的WP/TF質(zhì)量比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1）、水合溫度（45、50、55、60、65 ℃）、水合時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對納米顆粒包埋率的影響。測定每個單因素時，其他因素固定為WP/TF質(zhì)量比10∶1，水合溫度55 ℃，水合時間1.5 h。

1.2.5 正交試驗 采用3因素3水平正交試驗確定納米復(fù)合物的最佳工藝，WP/TF質(zhì)量比為A因素、水合時間為B因素、水合溫度為C因素，正交試驗設(shè)計如表1所示。

1.2.6 WP/TF納米顆粒的特性研究

1）粒徑和Zeta電位測定。取納米液并稀釋，于25 ℃室溫下測定顆粒粒徑、多分散指數(shù)（PDI）及電位，每個平行測定3次。

2）WP/TF復(fù)溶穩(wěn)定性。取一定量的凍干粉溶解于去離子水中，振蕩使其完全分散均勻。將復(fù)溶后的樣品靜置12、24、36、48、60、72 h，取不同時間點上清液，采用酶標儀在380 nm下測定樣品上清液的吸光度，對凍干粉的復(fù)溶特性進行考察。若吸光度隨時間的變化越小，表明復(fù)溶穩(wěn)定性越好；若吸光度顯著下降或出現(xiàn)沉淀，表明復(fù)溶穩(wěn)定性較差。

3）WP/TF水溶解度的測定。使用飽和搖瓶法測定，將凍干粉溶解于水中，使得樣品達到過飽和狀態(tài)，37 ℃搖床振蕩24 h后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，測定吸光度，根據(jù)繪制的濃度-吸光度標準曲線測定其茶黃素含量。

1.2.7 WP/TF納米顆粒穩(wěn)定性的測定

1）WP/TF緩釋研究。參考楊婷婷等[14]的方法，將0.2 g NaCl、0.32 g胃蛋白酶溶于100 mL去離子水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 2.0，制備模擬胃液。將0.68 g K2HPO4、0.061 6 g NaOH、1.0 g胰蛋白酶溶于100 mL去離子水中，調(diào)至pH 7.0，得到模擬腸液。取10 mL新制備的納米液加20 mL模擬胃液，使用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2，37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩孵育2 h，胃消化結(jié)束后，取20 mL胃消化混合物加入20 mL模擬腸液，37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩孵育2 h。每隔30 min收集1 mL消化液，使用離心機在5 000 r/min條件下離心10 min。采用未包埋的TF作為對照，按“1.2.2”的方法測定消化液中TF的釋放率。

TF釋放率=[WtW0]×100%" " " （3）

式中，Wt為TF在消化液中的釋放量（mg/mL）；W0為初始TF總添加量（mg/mL）。

2）WP/TF納米顆粒的貯藏穩(wěn)定性。將制備好的納米液于4 ℃和25 ℃下放置30 d 后，測定納米液的包埋率，測試方法參考“1.2.3”。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均做3次平行試驗。采用GraphPad Prism 8和Design-expert 12.0軟件制作圖表，使用SPSS 26.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析和方差分析，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 WP/TF納米顆粒的單因素試驗

2.1.1 WP/TF質(zhì)量比對納米顆粒性能的影響 由圖1可知，隨著乳清蛋白添加量的增加，納米顆粒的包埋率波動變化，當(dāng)WP/TF的質(zhì)量比為10∶1時，包埋率為85.89%。當(dāng)WP/TF質(zhì)量比超過10∶1時，包埋率顯著降低，可能是由于過量的乳清蛋白在溶液中聚集，使WP和TF之間的相互作用減弱，而影響納米顆粒的包埋率[15]。納米顆粒的穩(wěn)定性隨著WP/TF質(zhì)量比的增加整體上先增大后減小，WP/TF質(zhì)量比為10∶1條件下K值達52.55%，高于其他WP/TF質(zhì)量比。說明比例過高或過低會影響WP與TF之間作用力。因此，選擇WP/TF質(zhì)量比為10∶1。

2.1.2 水合溫度對納米顆粒性能的影響 由圖2可知，隨著水合溫度的上升，WP/TF納米顆粒的包埋率逐漸增大，在溫度達到55 ℃時包埋率達84.99%，而溫度超過55 ℃后，包埋率顯著下降，因為當(dāng)溫度超過55 ℃后蛋白質(zhì)變性聚集使其包埋率顯著降低。穩(wěn)定常數(shù)值也呈相同的變化趨勢，這是因為溫度過高會破壞納米顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使其茶黃素發(fā)生損失[14]。因此，選定55 ℃為最佳水合溫度。

2.1.3 水合時間對納米顆粒性能的影響 由圖3可知，在水合時間為1.0～1.5 h時，WP和TF的結(jié)合效果好，水合1.5 h時的納米顆粒對茶黃素包埋率達到最大值，為84.24%，且K值也達到最大值。隨著水合時間的增加包埋率和K值出現(xiàn)顯著降低，這是因為在水合反應(yīng)過程中，WP和TF間結(jié)合的非共價作用力被影響，使其穩(wěn)定性降低[16]。因此最佳水合時間為1.5 h。

2.2 WP/TF納米顆粒性能的正交試驗

由表2所示，以包埋率為考察指標，通過極差分析可知，影響WP/TF納米顆粒性能的主次因素為WP/TF質(zhì)量比gt;水合時間gt;水合溫度，即WP/TF質(zhì)量比對納米顆粒的包埋率影響最大，水合溫度最小。在正交試驗中所得到的最佳工藝條件為A2B2C3，由極差分析得到的最佳工藝條件為A2B2C2。

方差分析結(jié)果見表3，可知A對納米顆粒包埋率影響最為顯著。通過F值可知，各因素對納米顆粒包埋率的影響表現(xiàn)為WP/TF質(zhì)量比gt;水合時間gt;水合溫度。分別按照正交試驗A2B2C3和極差分析A2B2C2得到的最佳工藝制備納米顆粒，發(fā)現(xiàn)A2B2C2（85.89%）制備的納米顆粒包埋率比A2B2C3（83.43%）高。綜合考慮得到最佳的WP/TF納米顆粒制備工藝為WP/TF質(zhì)量比10∶1，水合時間1.5 h，水合溫度55 ℃。

2.3 WP/TF納米顆粒特性分析

2.3.1 粒徑和Zeta電位分析 粒徑大小和Zeta電位是反映納米顆粒穩(wěn)定性的重要指標，粒徑越小與Zeta電位的絕對值越大，其穩(wěn)定性越高。由圖4a可知，隨著WP/TF質(zhì)量比的增加，納米顆粒的粒徑總體呈波動變化，證明WP加入影響了TF的粒徑分布情況，WP是一種具有親水性和疏水性的蛋白，具有良好的穩(wěn)定性，WP可以與TF親水基團結(jié)合，疏水基團部分可以嵌入TF內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形成穩(wěn)定的納米顆粒結(jié)構(gòu)[17]。當(dāng)Zeta電位低于-30 mV或高于30 mV時，該納米液體系較為穩(wěn)定。由圖4b可知，TF納米液Zeta電位的絕對值低于WP，隨著WP/TF質(zhì)量比的增加，Zeta電位的絕對值呈先升高后降低的趨勢，在WP/TF質(zhì)量比10∶1時電位為（-58.83±3.05）mV，遠低于-30 mV，證明所制備納米液穩(wěn)定性高。由圖4c可知，相較于WP、TF納米液，除WP/TF質(zhì)量比20∶1，隨著WP/TF質(zhì)量比添加，PDI呈降低趨勢，表明WP/TF納米液的分子分布更均勻，結(jié)合更緊密，穩(wěn)定性更高。

2.3.2 復(fù)溶穩(wěn)定性 圖5為TF、WP、WP/TF凍干粉復(fù)溶放置72 h的濁度變化，可知3個樣品在36 h后吸光度下降較慢，TF在0～36 h吸光度下降趨勢顯著，而WP和WP/TF的吸光度變化緩慢，證明WP和WP/TF凍干粉復(fù)溶穩(wěn)定性較好，TF最差，表明WP成功包埋了TF。

2.3.3 水溶解度 圖6為不同WP/TF質(zhì)量比凍干粉水溶解度變化，可知隨著WP/TF質(zhì)量比的增加，水溶解度呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)WP/TF質(zhì)量比為10∶1時，水溶解度最高，為0.15 mg/mL。水溶解度趨勢與包埋率和K值結(jié)果一致，說明過高的WP/TF質(zhì)量比會使WP/TF的作用力減弱，使其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致包埋率、K值、水溶解度降低。

2.4 WP/TF納米顆粒的穩(wěn)定性分析

2.4.1 WP/TF納米顆粒在胃腸模擬液中的釋放 圖7為TF和WP/TF納米顆粒在胃腸模擬液中的釋放曲線。由圖7可知，在胃液中模擬90 min，TF的釋放率為68.15%，而包埋后的WP/TF納米顆粒中的TF釋放率為58.41%，相較TF顯著降低。這說明WP和TF之間通過相互作用形成的納米顆粒對于WP/TF包埋具有較好的緩釋作用。在腸液模擬消化120～180 min后，TF釋放率從66.52%顯著下降為34.23%，而WP/TF納米顆粒TF釋放率由52.50%下降為38.86%，表明WP作為納米顆粒的外殼能夠提供一層物理屏障，限制WP/TF納米顆粒TF釋放，提高其穩(wěn)定性，實現(xiàn)更好的緩釋效果。

2.4.2 儲藏穩(wěn)定性 表4為WP/TF納米顆粒在4 ℃和25 ℃條件下貯藏30 d的包埋率變化結(jié)果。由表4可知，在4 ℃和25 ℃條件下納米顆粒的包埋率隨貯藏時間延長均出現(xiàn)下降。在25 ℃條件下包埋率變化幅度超過4 ℃，在儲藏第30天分別下降為（56.86±1.43）%和（71.28±0.89）%。這說明在較高溫度條件下納米顆粒之間的相互作用力會發(fā)生變化，使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，穩(wěn)定性下降。

3 小結(jié)與討論

本研究以WP和TF為原料，采用反溶劑法，比較不同的WP/TF質(zhì)量比、水合溫度、水合時間對納米顆粒包埋率和穩(wěn)定常數(shù)的影響，其中水合溫度與孫麗君等[18]的研究結(jié)果較為一致，即溫度上升有利于增加包埋率，促進納米顆粒的穩(wěn)定性；水合時間與陳珂等[19]的研究結(jié)果較為接近，水合時間能夠使TF和WP均勻分散形成納米顆粒，促進包埋效果。正交試驗設(shè)計是一種常用的試驗方法，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域，正交試驗結(jié)果確定WP/TF納米顆粒制備的最佳工藝為WP/TF質(zhì)量比10∶1、水合時間1.5 h、水合溫度55 ℃，所制備的納米顆粒包埋率為85.89%。

當(dāng)前，對納米顆粒特性研究集中在粒徑、Zeta電位、復(fù)溶穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等方面。結(jié)果表明，質(zhì)量比10∶1條件下所制得的納米液粒徑為（557.05±32.55） nm，Zeta電位為（-58.83±3.05） mV，PDI為0.21±0.10，WP和TF之間存在較強靜電斥力，減小粒徑，通過靜電相互作用力形成均相，促進分布均勻、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[20]。凍干過程中的溫度變化會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白發(fā)生聚集[21]，濁度和水溶解度試驗結(jié)果證明WP/TF復(fù)溶穩(wěn)定性結(jié)果良好，沒有引起顆粒聚集。

體外胃腸模擬消化可以模擬體內(nèi)消化條件，評估生物利用率和消化特性之間的關(guān)系，具有重現(xiàn)性、簡便性、通用性等優(yōu)點[22]。試驗比較TF和WP/TF納米顆粒在胃液和腸液模擬液中的釋放率，結(jié)果表明胃液模擬條件中WP/TF納米顆粒TF釋放率顯著降低，這可能是因為WP與TF之間相互作用能阻礙胃蛋白酶對納米顆粒表面結(jié)構(gòu)的破壞，增加納米顆粒的穩(wěn)定性，減少TF釋放；在腸液模擬1 h后，WP/TF釋放率高于TF，這可能是因為蛋白質(zhì)在高于其等電點的高pH條件下會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)被破壞釋放出TF[23]。后期研究可以測定WP/TF在不同pH條件下穩(wěn)定性的變化，更好地提高其利用價值。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是食品生產(chǎn)中重要的參考指標，通過比較不同的貯藏溫度，發(fā)現(xiàn)25 ℃條件下WP/TF納米顆粒包埋率下降速度更顯著，這與李素云等[24]的研究結(jié)果一致，可能由于溫度過高會破壞結(jié)構(gòu)之間的作用力，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降，且溫度過高會促進微生物活動和提高酶的活性，破壞納米顆粒的表面結(jié)構(gòu)。綜上，WP能夠很好地負載TF，所制備的WP/TF納米顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，復(fù)溶和水溶性效果良好，延緩納米顆粒的釋放率，提高利用率，為TF的開發(fā)利用提供新思路，促進其開發(fā)利用。

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