江漢雞J亞群禽白血病病毒分離鑒定及致病性分析

摘要：為了解禽白血病病毒（ALV）在江漢雞中的遺傳進化方向和致病性，對來自湖北省武漢市疑似感染ALV的江漢雞進行病理剖檢、病毒分離鑒定，并對分離毒株進行env基因遺傳進化分析以及致病力評估。結(jié)果表明，病雞脾臟腫大，肝臟表面肉眼可見腫瘤；勻漿組織接種DF-1細(xì)胞后，經(jīng)ELISA和IFA檢測發(fā)現(xiàn)P27抗原均呈陽性，PCR亞型鑒定僅擴增出J亞群特異性條帶，成功分離出1株ALV-J毒株，命名為HB18449株；分離株env基因的遺傳進化分析顯示分離株與山東商品蛋雞分離株SD13QJ03遺傳關(guān)系最近，且和多數(shù)地方雞分離株一樣與英國原型株HPRS103處于同一大分支。此外，致病性試驗結(jié)果表明，HB18449感染雛雞會抑制其生長、免疫器官發(fā)育、引起病毒血癥、降低血液中CD4+/CD8+ T淋巴細(xì)胞比例以及體液免疫應(yīng)答水平。

關(guān)鍵詞：禽白血病病毒；江漢雞；遺傳進化；致病性

中圖分類號：S831" " " " "文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0112-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.018 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Identification and pathogenicity analysis of subgroup J Avian leukosis virus

from Jianghan chicken

XU Yun-peng1，2， WANG Zui2，3， DOU Jun-feng2，3， LI Li2，3， LU Qin2，3， JIN Xin-xin2，3，

LING Xiao-chun2，3， WANG Hong-cai2，3， ZHAI Xin-guo1， LUO Qing-ping2，3， LI Yun-xuan4

（1. School of Life Sciences and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan" 056038， Hebei， China;

2. Key Laboratory of Animal Disease Control and Prevention Formulation of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Wuhan" 430064， China;

3. Hongshan Laboratory， Wuhan" 430070， China；4.Hubei Center for Animal Disease Control and Prevention，Wuhan" 430070， China）

Abstract： In order to understand the genetic evolution direction and pathogenicity of Avian leukosis virus （ALV） isolated from Jianghan chickens， pathological dissection， virus isolation and identification on Jianghan chicken suspected of ALV infection in Wuhan， Hubei were conducted. The isolated viral strains underwent genetic evolution analysis of the env gene and pathogenicity evaluation. The post-mortem results revealed splenomegaly in diseased chickens， with visible tumors on the liver surface. Following inoculation of homogeneous tissue onto DF-1 cells， ELISA and IFA assays showed positive P27 antigen findings. Subsequent PCR subtype identification only amplified specific bands for the J subgroup， indicating the successful isolation of an ALV-J strain named HB18449. Genetic evolution analysis of the isolated strain’s env gene demonstrated the closest genetic relationship to the Shandong commercial egg chicken strain SD13QJ03 and clustered with most local chicken isolates in the same major branch as the UK prototype strain HPRS103. Furthermore， pathogenicity experiments revealed that infection with HB18449 inhibited chick growth， impaired immune organ development， induced viremia， decreased the CD4+/CD8+ T lymphocyte ratio in blood， and reduced humoral immune response levels.

Key words： avian leukosis virus; Jianghan chicken; genetic evolution; pathogenicity

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的各種禽類腫瘤性疾病的總稱[1]，也是家禽主要種源性疫病之一[2]。除了引起腫瘤外，ALV還可以導(dǎo)致感染雞只生長遲緩、產(chǎn)蛋減少和免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。ALV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科禽C型逆轉(zhuǎn)錄病毒屬[3]。ALV為單股正鏈RNA病毒，全長7.2～7.8 kb，包含一個單股、正鏈、不分段的二倍體核糖核酸基因組[4]。其基因組具有3個開放閱讀框，從5′端到3′端依次為gag-pol-env，分別編碼病毒粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白、依賴RNA的DNA聚合酶和囊膜糖蛋白[5]。目前，根據(jù)囊膜糖蛋白抗原性、宿主范圍和抗體中和特性，ALV可被劃分為A～K共11個亞群，其中A、B、C、D、E、J、K共7個亞群可感染雞群，且E亞群為內(nèi)源性病毒。1999年ALV-J在中國首次被分離[6]，由于其高頻率的突變和遺傳重組特性，目前已經(jīng)成為中國流行范圍最廣、危害性最大的禽白血病病毒[7，8]。由于缺乏有效的疫苗和藥物，種群凈化是根除ALV的惟一有效途徑。

近年來，隨著ALV根除計劃的嚴(yán)格執(zhí)行，中國禽白血病凈化工作已取得較大進展，國內(nèi)大型種雞場已基本完成ALV的凈化工作。然而，部分地方品種雞ALV的陽性率仍然居高不下，給禽白血病的防控、地方品種雞的保種繁育帶來了巨大困難。因此，有必要繼續(xù)推進地方種雞ALV的流行病學(xué)調(diào)查和種群凈化工作。本研究從地方品種江漢雞組織中成功分離得到1株ALV-J毒株，并對其遺傳進化方向和致病性進行分析，以期為江漢雞ALV的分子流行病學(xué)特點和診斷防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與細(xì)胞 病料組織采集于武漢市某雞場送檢的疑似禽白血病病雞。雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。SPF雞胚購自北京勃林格公司。

1.1.2 主要試劑 高糖培養(yǎng)基（DMEM）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素和胰酶均購自Gibco公司；DL2000 Plus DNA Marker、pMD18-T Vector Cloning Kit均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；2×Rapid Taq Master Mix和Tissue Total RNA/DNA Isolation Kit提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；禽白血病病毒ELISA抗原檢測試劑盒購自IDEXX公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自默克公司；脫脂乳購自BD公司；禽白血病病毒P27單克隆抗體1F8由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室保存；雞外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 取少量病料、800 μL PBS溶液和3顆鋼珠加入無菌的EP管中，機械振蕩破碎后，" " 12 000 r/min離心5 min后收集上清，經(jīng)0.22 μm濾器過濾備用。待DF-1細(xì)胞密度達到80%，接種上清樣品100 μL，同時接種100 μL PBS溶液作為陰性對照，于37 ℃下5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中感作2 h，PBS溶液洗滌3次，加入含1% FBS的DMEM 維持液繼續(xù)培養(yǎng)7～9 d，盲傳3代，將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，" " " "12 000 r/min離心5 min，收集上清用于ALV群特異性抗原檢測、前病毒基因組提取以及間接免疫熒光測定。

1.2.2 間接免疫熒光試驗（IFA） 將細(xì)胞上清接種于6孔板培養(yǎng)的DF-1細(xì)胞板中，陰性對照加入等體積的DMEM，感作2 h后，PBS溶液洗滌3次，加入維持液在37 ℃下5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，棄上清，PBS溶液洗滌3次，使用4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液洗滌3次，再用0.5% Triton X-100透化30 min，PBS溶液洗滌3次后加入5%脫脂乳封閉1 h，PBST洗滌3次后加入1F8單抗（1∶500），孵育2 h，PBST洗滌3次，最后加入FITC-羊抗鼠（1∶150）避光孵育" " 1 h，PBST洗滌后用倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)光情況。

1.2.3 病毒亞型的鑒定 按照Tissue Total RNA Isolation Kit說明書提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中前病毒基因組，以前病毒基因組為模板，用參考文獻[9]中ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K特異性引物進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌去離子水8.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸" " " "3 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。使用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.4 病毒env基因的擴增及遺傳進化分析 以前基因組為模板，用env基因全長擴增引物env-F/R[9]進行PCR擴增，擴增體系和程序同“1.2.3”。所得PCR產(chǎn)物回收純化，克隆至pMD-18T載體，經(jīng)PCR鑒定后提取質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果通過DNA STAR軟件與NCBI中其他ALV毒株env基因進行核苷酸序列相似性比對，并利用MEGA 10.1.7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參考毒株序列信息見表1。

1.2.5 分離株致病性評估 將60只1日齡SPF雞隨機分為兩組（每組30只）。感染組于1日齡肌肉注射HB18449各200 μL（104.5TCID50），對照組注射等量的DMEM，7日齡時，各組進行新城疫活苗（LaSota株）滴鼻和AIV三聯(lián)滅苗（H5N6-Re13株+H5N8-Re14株+H7N9-Re4株）腿部肌肉注射免疫。感染后第 1、7、14、28天從各組隨機取10只雛雞進行稱重，同時靜脈采血收集血漿測定血液中的P27抗原。感染后28日從各組隨機取5只雞進行剖檢，采集脾臟、法氏囊和胸腺，測定各組免疫器官指數(shù)（免疫器官重量/體重）；在無菌條件下取血液進行淋巴細(xì)胞分離，并制備淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液，然后按照PE標(biāo)記的鼠抗雞CD8α抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗雞CD4抗體的使用說明對淋巴細(xì)胞懸液進行染色，再使用流式細(xì)胞儀對CD4+及CD8+ T淋巴細(xì)胞進行分類計數(shù)檢測，并計算CD4+/CD8+比值。在疫苗接種后第7、14、28天收集血清測定各組疫苗免疫抗體水平（血凝抑制效價測定）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病雞剖檢結(jié)果

送檢病雞為江漢雞，處于剛開產(chǎn)階段，體型消瘦，精神沉郁，產(chǎn)蛋能力較差，剖檢后發(fā)現(xiàn)脾臟腫大，肝臟上肉眼可見腫瘤（圖1），疑似禽白血病病毒感染。

2.2 病毒分離鑒定結(jié)果

將組織懸液接種DF-1細(xì)胞并盲傳3代后，使用商品化ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中的ALV P27抗原，結(jié)果顯示上清液的S/P值為1.35（S/P 值≥0.2判定為陽性），呈P27陽性，而對照組為陰性。為了進一步確定ALV的分離情況，使用P27單克隆抗體1F8進行IFA檢測，結(jié)果顯示感染的DF-1細(xì)胞呈現(xiàn)特異性綠色熒光，而對照組無熒光信號（圖2）。以提取前病毒基因組為模板，用ALV-A/B/J/K特異性檢測引物進行ALV亞群鑒定，結(jié)果顯示僅ALV-J鑒定引物擴增出545 bp特異性條帶，而其他鑒定引物和陰性對照均無特異性條帶擴增（圖3），表明從江漢雞組織中成功分離得到1株ALV-J毒株，將其命名為HB18449株。

2.3 env基因遺傳演化分析

將該分離株env基因核苷酸序列與黃羽肉雞分離株、白羽肉雞分離株、商品蛋雞分離株、英國原型株和美國原型株相關(guān)參考序列進行相似性分析并構(gòu)建遺傳進化樹（圖4和圖5）。結(jié)果表明，分離株HB18449與英國原型株HRPS103相似性為93.6%，與美國原型株ADOL-7501相似性為90.7%，與黃羽肉雞分離株相似性為93.8%～95.4%，與白羽肉雞分離株相似性為93.9%～94.7%，與商品蛋雞分離株相似性為92.5%～95.5%。分離株與山東商品蛋雞分離株SD13QJ03相似性最高。此外，遺傳進化樹分析顯示分離株HB18449與SD13QJ03株遺傳關(guān)系最近，且和多數(shù)地方雞分離株一樣均與英國原型株HPRS103處于一個大分支。

2.4 HB18449毒株感染致病性分析

2.4.1 HB18449感染對雛雞體重影響 在HB18449感染后第 1、7、14和28天，每組隨機抽取10只雛雞進行稱重，結(jié)果如圖6所示，感染組于第7天至第 28天的體重均顯著低于對照組（Plt;0.05），表明該毒株感染對雛雞的生長具有顯著抑制作用。

2.4.2 HB18449感染對雛雞免疫器官發(fā)育影響 在HB18449感染后第28天，每組隨機抽取5只雛雞進行解剖，取其免疫器官（脾臟、法氏囊和胸腺）測定免疫器官指數(shù)，結(jié)果如圖7所示。感染組脾臟、胸腺和法氏囊發(fā)育指數(shù)均顯著低于對照組（Plt;0.05），表明該毒株感染對雛雞免疫器官生長發(fā)育具有顯著抑制作用。

2.4.3 HB18449感染雛雞病毒血癥的檢測 在HB18449感染后第7、14、28天，每組隨機抽取10只雛雞進行翅下靜脈采血，使用商品化ELISA試劑盒檢測全血中的P27抗原，結(jié)果如表2所示。分離株感染后14日可檢測到病毒血癥且檢出率為100%，感染后28 d病毒血癥檢出率下降為80%，對照組在整個檢測期間均未檢出病毒血癥。

2.4.4 HB18449感染對雛雞T淋巴細(xì)胞的影響 對感染后28日收集的全血進行淋巴細(xì)胞分離并對CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞進行標(biāo)記，再利用流式細(xì)胞儀對CD4+及CD8+ T淋巴細(xì)胞進行分類計數(shù)，并計算CD4+/CD8+比值。結(jié)果如圖8所示，感染組外周血中CD4+ T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組（Plt;0.05），CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)無顯差異。此外，感染組CD4+/CD8+的比值也顯著低于對照組（Plt;0.05）。

2.4.5 HB18449感染對雛雞免疫應(yīng)答的影響 為探究HB18449感染雛雞對疫苗免疫應(yīng)答的影響，對感染組和對照組同時接種新城疫活疫苗（LaSota）和禽流感三價滅活疫苗（H5-13/14，H7），并在不同時間點測定新城疫和禽流感的抗體滴度。結(jié)果表明，免疫后第7天，感染組和對照組新城疫和禽流感抗體滴度均無明顯差異（圖9）。在免疫后第14和21天，感染組的新城疫和禽流感抗體滴度均顯著低于對照組（Plt;0.05）。HB18449感染雛雞對活疫苗和滅活苗抗體的產(chǎn)生均有一定抑制作用。

3 討論

湖北省是地方雞養(yǎng)殖大省，擁有豐富的品種資源，其中包括江漢雞、麻城綠殼蛋雞、景陽雞、松滋雞和雙蓮雞等優(yōu)良的本地品種。然而，地方品種雞檢測凈化頻率低、范圍小，地方品種雞群不斷出現(xiàn)感染ALV的報道。有研究調(diào)查顯示綠殼蛋雞ALV陽性率6.11%，景陽雞ALV陽性率8.64%、而江漢雞ALV陽性率甚至高達30.14%[10]。因此，有必要加強湖北省地方品種雞ALV的檢測凈化工作，以保障特有的地方雞品種資源。

本研究對疑似感染ALV的江漢雞進行臨床剖檢，發(fā)現(xiàn)病雞脾臟腫大，肝臟上肉眼可見腫瘤。將勻漿組織接種DF-1細(xì)胞盲傳3代后，經(jīng)ELISA和IFA檢測確定為ALV陽性，進一步通過亞群特異性引物鑒定，最終成功分離出1株ALV-J毒株，命名為HB18449株。已有研究對江漢雞核心種群AL凈化情況進行了初步調(diào)查，并表明ALV-J和ALV-K亞群是主要流行毒株[11]，但是關(guān)于毒株的遺傳進化關(guān)系并未作出詳細(xì)分析。囊膜蛋白（env）在決定ALV的宿主范圍和致病性方面起著關(guān)鍵作用，其在不同亞群間存在較大差異，因此常被用于遺傳進化分析[12]。本研究對分離株HB18449的env基因進行擴增并構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株與山東商品蛋雞分離株SD13QJ03相似性最高。此外，分離株與白羽肉雞、黃羽肉以及商品蛋雞分離株均與英國原型株處于一個大分支，表明地方雞和商品雞仍然圍繞著英國原型株不斷地變異進化。

ALV感染可導(dǎo)致雞群產(chǎn)生各類腫瘤，還會引發(fā)雞只免疫抑制和生長遲緩，對家禽業(yè)構(gòu)成巨大威脅[13]。研究表明，三黃雞中分離的ALV-J和ALV-K毒株、蘆花雞分離的ALV-J毒株、龍勝鳳雞中分離的ALV-A毒株感染均能抑制雛雞生長發(fā)育，降低其疫苗免疫應(yīng)答水平并引起組織學(xué)病變[14]。然而，江漢雞ALV毒株的致病性還未見相關(guān)報道，為探究江漢雞ALV-J分離株HB18449的致病性，本研究從生長性能、免疫器官指數(shù)、病毒血癥、體液免疫以及細(xì)胞免疫等多方面評估了分離株的致病特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組生長緩慢，免疫器官發(fā)育受到抑制，在感染后第14天病毒血癥檢出率為100%。此外，感染組血液中CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著降低，表明雞只細(xì)胞免疫水平下降。同時，感染組對免疫的各種疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均低于對照組，表明雞只體液免疫也受到一定的抑制。因此，HB18449株對SPF雞具有較強致病性，能夠使其產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制。

中國地方雞種群具有品系眾多、背景復(fù)雜的特點，再加上ALV具有隱性、混合感染和易變異等特性，使得全面凈化ALV面臨巨大困難。與此同時，地方雞種群不充分凈化也加大了ALV對商品雞群傳播的風(fēng)險。本研究不僅豐富了地方雞ALV基因組庫資源，為地方雞ALV的進化趨勢提供參考，還對其致病性進行了分析，有助于ALV防控措施的制定，為保護地方品種資源增添一份力量。

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