百菌清降解菌株的施加對其降解效果及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

摘要：研究了菌株P(guān)seudochrobactrum sp. BSQ-1在土壤中降解百菌清（TPN）的效率以及對土壤中微生物群落多樣性的影響。結(jié)果表明，在21 d內(nèi)，菌株BSQ-1對TPN的降解率約為60%，并且通過MiSeq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，施加降解菌株BSQ-1可部分恢復(fù)土壤中微生物群落的豐富度和多樣性，能緩解TPN污染對土壤微生物的威脅。

關(guān)鍵詞：百菌清；降解菌株；生物強化；土壤微生物群落

中圖分類號：S154.3;X53" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0055-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.009 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Effect of the application of chlorothalonil-degrading strains on its degradation effect and

soil microbial community structure

LIU Xiao-mei1， CAO Lu-lu2， CHEN Jian-fang1， WANG Yan-fang1， REN Ke1，

ZHANG Tao1， MEI Jian-jun1， XU Xi-hui2

（1.Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou" 014040， Inner Mongolia， China;

2.College of Life Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing" 210095， China）

Abstract： The degradation efficiency of chlorothalonil （TPN） by strain Pseudochrobactrum sp. BSQ-1 in soil and its effect on microbial community diversity in soil were studied. The results showed that the degradation rate of TPN by strain BSQ-1 was about 60% within 21 days. The application of degrading strain BSQ-1 could partially restore the richness and diversity of microbial communities in soil and alleviate the threat of TPN pollution to soil microorganisms by MiSeq technology analysis.

Key words： chlorothalonil; degrading strains; bioaugmentation; soil microbial community

百菌清（四氯間苯二甲腈，TPN）俗稱達克靈、桑瓦特等，是一種廣譜的非內(nèi)吸型保護性殺菌劑。百菌清有2個同分異構(gòu)體，即四氯鄰苯二甲腈和四氯對苯二甲腈。百菌清對鳥類、魚類以及水生無脊椎動物具有很高的毒性，在生態(tài)環(huán)境中被廣泛地檢測到。百菌清及其異構(gòu)體導(dǎo)致的污染已經(jīng)引起了社會各界的關(guān)注。隨著百菌清的廣泛應(yīng)用（中國的年均使用量超過8 000 t，美國的年均使用量超過5 000 t），其進入環(huán)境的幾率相應(yīng)增大。百菌清在自然環(huán)境中很難被降解，再加上極難溶于水，其殘留所引起的環(huán)境安全等問題不容忽視[1]。作為一種使用范圍較廣的有機氯殺菌劑，百菌清主要被用于多種作物的真菌病害預(yù)防，例如蔬菜等作物的病害防治。近年來，百菌清在蔬菜中被越來越頻繁地檢出，其殘留問題的解決迫在眉睫。生物修復(fù)百菌清及其同分異構(gòu)體污染的環(huán)境是簡便、可靠、有效并且無二次污染的修復(fù)方法。因此，獲得高效降解百菌清的微生物菌株資源并研究其在微生物修復(fù)中的生態(tài)學(xué)效應(yīng)具有重要的理論意義以及應(yīng)用價值。利用降解菌株或其降解酶修復(fù)百菌清及其異構(gòu)體所造成的環(huán)境污染問題是非常有前景的方法。細菌因其強大的降解有機以及無機污染物的能力，在生物降解中扮演重要角色[2]，已經(jīng)陸續(xù)分離出了多株具有百菌清降解能力的細菌菌株[3，4]。百菌清的代謝途徑主要包括4種，水解脫鹵、還原脫氯、甲硫基或甲氧基取代氯原子的取代反應(yīng)以及腈基的氧化或者水解作用[5]。

然而，通過添加外源菌株降解農(nóng)藥受多種因素的影響，如農(nóng)藥類型、外源降解菌株的特征以及環(huán)境條件等[6，7]，同時土壤中的微生物群落（土著微生物）、降解菌株與農(nóng)藥之間充滿了復(fù)雜而又有序的互動。研究表明，化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用已經(jīng)對土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響[8，9]。接種的菌株通常會與土著微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，這可能導(dǎo)致所接種菌株的生存能力和適應(yīng)能力變差[10]。但是，接種菌株在降解農(nóng)藥的同時能夠緩解農(nóng)藥對土著微生物群落的選擇性壓力[11]。某些農(nóng)藥可以為接種菌株提供碳源或者氮源，所以這些農(nóng)藥反而能夠幫助接種菌株在土壤中生存繁殖。此外，微生物群落之間復(fù)雜的相互作用也能影響菌株對農(nóng)藥的降解速率以及最終的降解產(chǎn)物[12，13]。所以，了解接種菌株以及農(nóng)藥對土著微生物的影響將有助于降解菌株的選擇同時提高其降解速率，因為生物修復(fù)的成功與否主要取決于接種菌株對環(huán)境的生存以及適應(yīng)能力[10]。因此，本試驗研究了百菌清降解菌Pseudochrobactrum sp. BSQ-1對污染土壤中百菌清的降解能力以及對土壤中微生物群落的影響，以期為百菌清污染土壤的生物修復(fù)提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為百菌清高效降解菌Pseudochrobactrum sp. BSQ-1。供試土壤采自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市井坪公園表層5～10 cm土壤。供試農(nóng)藥為百菌清原藥（CTN）（純度為98.5%），由江陰蘇利精細化工有限公司饋贈，使用濃度50 mg/kg。供試試劑二氯甲烷（分析純）、丙酮（色譜純）等購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司，乙腈（色譜純）等由德國的Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。

1.2 試驗設(shè)計

土壤中分別噴灑50 mg/kg百菌清，充分攪拌均勻后置于實驗室中待土壤中的甲醇揮發(fā)。12 h后，處理組中按照108 CFU/g干土的接種量分別接入剛培養(yǎng)好的含有菌株BSQ-1生理鹽水的菌懸液，陰性對照中加入等體積的無菌生理鹽水并且充分拌勻，分裝入花盆（上口直徑為22 cm，底面直徑為15 cm，高度為16 cm）中，同時添加沒有百菌清和BSQ-1菌劑的空白對照，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)，調(diào)節(jié)土壤中的含水量到20%左右。將花盆全部放置在模擬自然環(huán)境光照時間的20 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，光照時間設(shè)為12 h/d。采用稱重的方法補水使土壤中的含水量基本保持不變。連續(xù)培養(yǎng)21 d，每7 d取1次土樣。

CK表示沒有經(jīng)任何處理的空白土樣，樣品編號SL代表只添加50 mg/kg百菌清的土壤處理，樣品編號BSQ代表只添加菌株BSQ-1的土壤處理，樣品編號SLBSQ代表同時添加50 mg/kg百菌清和菌株BSQ-1的土壤處理；樣品中編號最后一個數(shù)字表示取樣時間，1代表7 d時所取土樣，2代表14 d時所取土樣，3代表21 d時所取土樣。例如，SLBSQ1、SLBSQ2與SLBSQ3表示7、14、21 d時添加50 mg/kg百菌清與菌株BSQ-1的土壤樣品。待測樣品編號與對應(yīng)取樣時間如表1所示。

1.3 菌株的培養(yǎng)及菌懸液的制備

將菌株BSQ-1分別劃線接種于含50 mg/kg百菌清的固體培養(yǎng)基上；挑取單菌落接種于裝有3 mL的LB液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)過夜；將上述活化的菌液按1%的接種量接種于裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)至菌株的對數(shù)生長期；6 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用生理鹽水洗滌2遍并重懸，測定并調(diào)整菌懸液的濃度，使其在600 nm處的吸光度（OD600 nm）為1.0，均勻噴灑于試驗土壤中。

1.4 土壤中百菌清濃度的檢測

采用五點取樣法，取10 g土壤樣品，添加20 mL丙酮與二氯甲烷的混合液（體積比 1︰1）160 r/min，30 ℃搖床振蕩5 h，取下層有機相，重復(fù)上述步驟2次，合并提取的有機相后，置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)，用2 mL的乙腈（色譜純）定容，有機濾膜過濾（0.22 μm）后采用HPLC檢測樣品中的百菌清含量。該方法對土壤中百菌清的提取回收率高達92.5%±0.9%，可有效提取土壤中的百菌清。

1.5 Myseq-PE250測序

測序服務(wù)由上海派森諾生物科技股份有限公司提供。測序策略：Miseq-PE250。上游引物序列（338F）：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物序列（806R）：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中百菌清的降解效果

如圖1所示，在含有50 mg/kg百菌清的土壤中，菌株BSQ-1能在21 d內(nèi)將百菌清降解到20 mg/kg左右，降解率約為60%，明顯低于Xu等[14]研究中菌株BSQ-1在土壤中對TPN的降解率，主要原因在于南北方土壤以及氣候的差異影響了菌株BSQ-1的生長，進而影響其對TPN的降解。圖1的結(jié)果說明，菌株BSQ-1可以作為北方地區(qū)TPN污染土壤原位修復(fù)的應(yīng)用菌株。

2.2 微生物群落豐度與多樣性

通過MiSeq-PE250測序，共得到384 778條OTUs，各樣本文庫的覆蓋度（Coverage）都在0.985 0以上（表2），表明測序結(jié)果可以反映土壤中微生物群落的真實情況。由Chao1豐度指數(shù)可知，CK0的微生物豐度最高，其余各樣品的Chao1豐度指數(shù)為1 144～1 487，相對變化較小，表明TPN與菌株BSQ-1的加入對微生物群落的多樣性影響較低。與CK相比，只加TPN的樣品（SL1、SL2、SL3）Shannon多樣性指數(shù)的降幅較大，說明TPN的加入在一定程度上影響了土壤中微生物的多樣性，混合施加TPN和菌株BSQ-1的樣品的Shannon多樣性指數(shù)有所提高，表明菌株BSQ-1的加入緩解了TPN對土壤中微生物群落的威脅。其余各組樣品Shannon多樣性指數(shù)的變化幅度較小，說明各組樣品之間的微生物多樣性差異較小。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

土壤樣品中不同門水平的相對豐度如圖2所示，相對豐度從高到低依次為變形菌門（Proteobacteria）、 放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、專利菌門（Patescibacteria）、粘球菌門（Myxococcota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。總體上，放線菌門是土壤樣品初期（0 d）的優(yōu)勢菌門，其相對豐度在50%以上，變形菌門是BSQ、SLBSQ各土壤樣品的優(yōu)勢菌門，相對豐度均在30%以上，其中同時添加百菌清與菌株BSQ-1的土壤樣品（SLBSQ）中變形菌門的相對豐度都在70%以上。

在屬水平上，土壤樣品中不同屬水平的相對豐度如圖3所示，相對豐度從高到低依次為偽蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）、偽關(guān)節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）、甲藻菌屬（Methylotenera）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、諾維草螺菌屬（Noviherbaspirillum）、馬闊里類芽孢桿菌屬（Paenisporosarcina）、芽生球菌屬（Blastococcus）。偽關(guān)節(jié)桿菌屬是空白對照（CK）土壤樣品的優(yōu)勢菌屬；在添加菌株BSQ-1（BSQ）、混合施加百菌清和菌株BSQ-1（SLBSQ）的土壤樣品中，優(yōu)勢菌屬是偽蒼白桿菌屬，說明菌株BSQ-1成功定植，并具有較強的生存能力。

2.4 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

主坐標分析（PCoA）如圖4所示，施加降解菌株與不施加降解菌株在PC1相距較遠，表明施加降解菌株的處理（BSQ）與空白對照（CK）以及施加百菌清的處理（SL）的微生物群落組成差異較大。施加降解菌株（BSQ）與同時施加降解菌株及TPN的處理（SLBSQ）沒有顯著差異，空白對照（CK）與施加百菌清（SL）的處理沒有顯著差異。聚類分析結(jié)果與主坐標分析結(jié)果一致。

3 討論

本試驗研究了菌株BSQ-1對土壤中TPN的降解效果及其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。菌株BSQ-1通過水解脫鹵途徑以羥基取代TPN的4號位氯原子（4-OH-TPN）。盡管只有一個氯原子被取代，但代謝物4-OH-TPN比TPN的毒性更小，并且4-OH-TPN的水溶性明顯提高[3]，更容易從土壤中去除。

接種菌株處理（BSQ、SLBSQ）中偽蒼白桿菌屬的相對豐度較高，這表明菌株BSQ-1在與土著微生物競爭時具有較強的生存能力。無論是外源添加降解菌株或外源污染物都會降低樣品的微生物群落多樣性，但是施加降解菌株BSQ-1可部分恢復(fù)土壤中微生物群落的豐富度和多樣性，表明菌株BSQ-1能夠緩解TPN污染對土壤微生物的威脅。同時，混合施加TPN和菌株BSQ-1（SLBSQ）的土壤樣品的多樣性指數(shù)有所提高，同時其屬水平的物種豐富度逐步轉(zhuǎn)變?yōu)閭紊n白桿菌屬，說明菌株BSQ-1的施加即生物強化的過程，可馴化土壤中的微生物群落向提高降解TPN速率的方向演變。一些研究也表明，降解菌株的添加可以顯著改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[13，15]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)菌株BSQ-1降解百菌清的研究結(jié)果與Xu等[14]對菌株BSQ-1的研究結(jié)果稍有差異，究其主要原因在于土壤的理化性質(zhì)以及地理環(huán)境的不同，這表明相較于南方地區(qū)（南京市），菌株BSQ-1在北方地區(qū)（內(nèi)蒙古自治區(qū)）土壤中的競爭力及生存力更強，較適合應(yīng)用于去除北方地區(qū)土壤中的TPN。這說明除了接種物和農(nóng)藥的特征外，土壤性質(zhì)也會影響微生物的降解過程，如土壤中的有機質(zhì)含量和pH[4]等。

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