類黃酮3′-羥化酶及其在大麥中的研究進展

摘要：類黃酮3′-羥化酶（F3′H）是植物黃酮類化合物中的花青素和原花青素合成代謝中的關鍵酶，在植物的花色和果色修飾、抗逆、抗病蟲等方面有重要作用。大麥（Hordeum vulgare L.）富含黃酮物質(zhì)，具有保健功效，對大麥F3′H基因進行相關研究對培育富含黃酮物質(zhì)的藥食兩用大麥品種有重要意義。介紹了F3′H的發(fā)現(xiàn)歷程以及在花青素和原花青素合成途徑中的作用；在基因?qū)用娴南嚓P研究中，已有多種植物的F3′H基因被克隆出來，部分研究對該基因的形成以及進化歷程進行了分析，部分研究揭示了與F3′H基因相關的轉(zhuǎn)錄因子以及其在不同部位、不同外界環(huán)境條件脅迫下的表達情況；在部分植物中F3′H基因的表達可提高植物對逆境脅迫以及部分病蟲害的抵抗能力；大麥中黃酮合成途徑中的相關結(jié)構(gòu)基因基本都已被克隆出來，F(xiàn)3′H基因是其中較晚被克隆出來的，該基因已有多個變體從一些大麥品種中被克隆出來并進行了相關研究，這些研究對培育富含黃酮的大麥品種具有重要意義。

關鍵詞：類黃酮3′-羥化酶（F3′H）；黃酮；代謝；大麥（Hordeum vulgare L.）

中圖分類號：S512.3;Q946.5" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）03-0029-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.03.005 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research progress of flavonoid 3′-hydroxylase and its applications in barley

ZHAO Wei1，2，JING Xing-huai1，2，YANG Tao1，CHEN Jia1，PU Xiao-ying1，YANG Xiao-meng1，

LI E-xian1，LI Xia1，YANG Li-e1，ZENG Ya-wen1

（1.Institute of Biotechnology and Germplasm Resources， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming" 650205， China;

2.Pu’er University ， Pu’er" 665000， Yunnan， China）

Abstract： Flavonoid 3′-hydroxylase （F3′H） is a key enzyme in the biosynthetic pathway of anthocyanins and proanthocyanidins in plant flavonoids， playing a crucial role in modifying flower and fruit colors， as well as enhancing stress resistance and pest resistance in plants. Barley （Hordeum vulgare L.） is rich in flavonoids and possesses health-promoting properties， and research on the F3′H gene in barley is significant for the development of medicinal and edible barley varieties rich in flavonoids. This review briefly introduced the discovery history of F3′H and its role in the biosynthetic pathway of anthocyanins and proanthocyanidins. At the genetic level， the F3′H gene had been cloned from various plants. Some studies have analyzed the formation and evolutionary history of this gene， while others have revealed the transcription factors associated with F3′H and its expression patterns in different tissues and under various environmental stress conditions. In some plants， the expression of the F3′H gene could enhance resistance of plants to stress and some pests and diseases. In barley， most of the structural genes involved in the flavonoid biosynthetic pathway have been cloned， with F3′H being one of the later genes to be cloned. Currently， multiple variants of this gene have been cloned and studied from several barley varieties， and these studies are of great significance for the future breeding of barley varieties rich in flavonoids.

Key words：flavonoid 3′-hydroxylase（F3′H）; flavone; metabolism; barley（Hordeum vulgare L.）

類黃酮3′-羥化酶（F3′H）屬細胞色素P450亞家族，是植物黃酮類化合物中花青素和原花青素合成代謝中的關鍵酶，能催化二氫山奈酚的B環(huán)3′位置羥基化生成二氫槲皮素，隨后在其他酶的作用下生成槲皮素、原花青素和花青素[1-4]。其活性首次發(fā)現(xiàn)于纖細單冠菊（Happloppapus gracilis）培養(yǎng)細胞提取的微粒體中[5]，后在矮牽牛中第一次提取出F3′H基因的全長[3]。研究表明，F(xiàn)3′H在植物花和果實顏色修飾、抗逆性、抗病蟲方面有重要作用[4]。大麥（Hordeum vulgare L.）是繼水稻、玉米、小麥之后的世界第四大禾谷類作物，其中70%被用作飼料、16%用于釀造行業(yè)，其余的14%則用于食品和醫(yī)藥領域[6]。大麥中富含多種活性成分，包括β-葡聚糖、酚類、黃酮類及活性多肽等，在保健品、藥品等方面的開發(fā)有很大潛力[7]。其中的黃酮類化合物，特別是花青素和原花青素，是國際上公認的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑，其具有的抗炎、抗癌、預防糖尿病、防治肝損傷、抗氧化應激等功能引起了人們的廣泛關注[8]。在大麥花青素和原花青素合成代謝中涉及到多種酶的參與，對編碼這些酶蛋白基因的研究也成為大麥相關研究的熱點。而在大麥花青素和原花青素生物合成的結(jié)構(gòu)基因中，F(xiàn)3′H和F3′5′H基因家族的相關研究較少。

1 F3′H概述

類黃酮3′-羥化酶是花青素生物合成過程中的關鍵酶，屬于細胞色素P450單加氧酶，可對多種依賴NADPH的底物進行催化氧化[1，2，4]。類黃酮3′-羥化酶的活性首次發(fā)現(xiàn)于纖細單冠菊（Happloppapus gracilis）培養(yǎng)細胞提取的微粒體中[5]。F3′H是與細胞色素P450其他同家族成員相聯(lián)系的膜復合體，很難被分離；在植物中，通過對比用大量與P450類似的序列找出與P450s家族高度同源的保守區(qū)，并以此為基礎克隆出F3′H基因，這是相當困難的任務[9-11]。此外，該基因還存在提取含量低、容易被降解等問題，這也是整個P450基因家族在提取過程中的最大困難。隨著PCR技術的不斷發(fā)展，人們才逐漸看到從植物中分離出F3′H基因的可能。直到1999年，才首次從矮牽牛（Petunia hybrida）得到F3′H的cDNA全長并被鑒定屬于CYP75B2家族[3，11]。在隨后的研究中，人們又在紫蘇子[Perilla frutescens （L.） Britt.]、大豆[Glycine max （L.） Merr.]、葡萄（Vitis vinifera L.）、菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat）、甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]等植物中相繼得到了F3′H基因[12]。從20世紀至今仍有不少從其他植物當中克隆出F3′H基因的報道，可見對F3′H基因的研究一直是人們關注的課題。而對該基因的相關研究方向集中在花色和果色修飾、基因的克隆和表達分析、對外界環(huán)境的響應、抗病蟲、抗逆等方面[4]。

2 F3′H參與花青素和原花青素的合成代謝

花青素賦予了花和果實豐富顏色的同時也賦予了這些植物很高的營養(yǎng)價值，對于提高作物的經(jīng)濟價值有重要意義。F3′H是由二氫堪非醇（DHK）合成花青素途徑中的第一個關鍵酶，植物花青素的合成代謝可分為以下3個階段（圖1）。第一階段是苯丙氨酸經(jīng)過苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）生成香豆酰輔酶A（香豆酰-CoA），同時乙酸在乙酰輔酶A連接酶（ACL）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的作用下生成丙二酰輔酶A（丙二酰-CoA）[13]。第二階段是香豆酰-CoA和丙二酰-CoA在查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）作用下生成二氫山奈酚（DHK），二氫山奈酚在類黃酮3′-羥化酶（F3′H）和類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）作用下生成二氫槲皮素（DHQ）和二氫楊梅素（DHM），或者在二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）、花青素合成酶/無色花青素雙加氧酶（ANS/LDOX）和類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶/氧甲基轉(zhuǎn)移酶（UFGT/OMT）作用下直接生成天竺葵素-3-葡萄糖苷[14]。第三階段是生成的二氫槲皮素和二氫楊梅素在二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）、花青素合成酶/無色花青素雙加氧酶和類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶/氧甲基轉(zhuǎn)移酶作用下生成相應的花色苷，最后在甲基轉(zhuǎn)移酶（MT）等酶的轉(zhuǎn)化下生成更穩(wěn)定的花青素[15]。此外F3′H還參與到原花青素的合成代謝當中，F(xiàn)3′H參與途徑中的無色矢車菊素和矢車菊素分別在無色花青素還原酶（LAR）和花青素還原酶（ANR）的作用下生成兒茶素和表兒茶素，最終聚合成原花青素[16]。

3 F3′H基因相關研究

3.1 F3′H基因序列研究

F3′H基因已經(jīng)在多種植物中被發(fā)現(xiàn)。有學者從甘藍型油菜中克隆出F3′H基因，全長3 038 bp，包含3個內(nèi)含子，與已知的F3′H基因特別是擬南芥的F3′H具有高度同源性[17]。從山葡萄中克隆出的F3′H基因全長1 844 bp，屬于P450超基因家族， 不包含信號肽[18]。梁明煒等[2]以新彩棉5號（XC-5）纖維為材料分離得到了2個F3′H基因的全長cDNA 序列，長度分別為1 761 bp和1 892 bp，它們均含有" " "1個97～1 629 bp、長度為1 533 bp的開放閱讀框，能夠編碼510個氨基酸[19]。李雙江等[19]從苦蕎中克隆出1個含有1 470 bp開放閱讀框架的F3′H基因，能夠編碼489個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)屬于細胞色素P450家族。李爽等[20]從3種龍血樹中克隆得到的F3′H基因的DNA序列大小分別為1 824、1 820、" " "1 824 bp，cDNA序列大小均為1 533 bp，其中存在" " 1個大小為291/287 bp的內(nèi)含子序列，這與此前NCBI報道的序列MG675627完全一致，所用的3種龍血樹的F3′H基因編碼區(qū)序列高度同源，達99.57%。吳紅松等[21]利用cDNA末端快速克隆技術分別擴增3′端和5′端，得到了松果菊F3′H基因的cDNA，其開放閱讀框長度為1 533 bp，編碼510個氨基酸，通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)其與非洲菊雜交種和菊花具有高度同源性。從3種石榴品種中得到的3個PgF3′H成員均含有保守結(jié)構(gòu)域 CYP75B，具有較保守的基因結(jié)構(gòu)，通過對其順式作用元件和表達情況分析，發(fā)現(xiàn)其中2個F3′H基因可能受光和生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)[22]。

3.2 F3′H基因進化分析

相關研究表明，F(xiàn)3′H和F3′5′H基因之間的分化發(fā)生在1.29億年前，早于單子葉植物和雙子葉植物物種的出現(xiàn)。F3′H拷貝大約發(fā)生在8 000萬年前；F3′5′H在進化歷程中至少發(fā)生了3次復制事件，分別在9 100萬、3 600萬和800 萬年前[23]。從分子演化角度來看，F(xiàn)3′H基因可以劃分為Ⅰ和Ⅱ兩個主要類群，其中第Ⅰ大類又分為ⅠA、ⅠB、ⅠC三類[11]。胡利宗等[24]利用生物信息學手段對矮牽牛、擬南芥、高粱等已知的F3′H基因的序列及演化特性進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)F3′H基因外顯子數(shù)變異范圍為2～7，根據(jù)外顯子數(shù)量將所分析的F3′H基因分為3類，包括2個外顯子類型、3個外顯子類型、4～7個外顯子類型，雖然變異長度相對較大但相位比較保守，每個物種中F3′H都沒有顯著的擴增，而多倍體物種中一般都有2個以上的成員，且各成員間的微共線性很好，旁系同源基因受功能限制的程度較低，并且比直系同源基因進化快。Jia等[25]對12種常見的單子葉植物進行了全基因組調(diào)查并選出了44個F3′H基因的候選基因，全基因組調(diào)查、系統(tǒng)發(fā)育、進化動力學和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模分析的結(jié)果顯示，單子葉植物F3′Hs（F3′H基因變體）經(jīng)歷了揮發(fā)性譜系特異性基因復制和基因丟失事件，認為在單子葉植物的共同祖先中進行基因復制后，單子葉植物F3′H已經(jīng)進化成2個獨立的譜系（Mono_F3′H Ⅰ類和Ⅱ類）。單子葉植物F3′HⅡ類功能分化受到陽性自然選擇的影響，作用于幾個特定的氨基酸位點。SRS6中這些選定位點和其他位點的氨基酸取代顯示出對F3′H底物結(jié)合具有重要的影響，并可能有助于F3′HⅠ類功能酶對圣草酚5′-羥基化活性的募集。此外，還觀察到F3′HⅠ類和Ⅱ類之間的轉(zhuǎn)錄差異[25]。

3.3 F3′H基因的表達特性

花瓣和果實是F3′H基因表達的常見部位，在對矮牽?；ò甑难芯恐邪l(fā)現(xiàn)除花瓣外，F(xiàn)3′H基因在子房、花萼、花梗、花藥等花的其他部位也有表達，在花的發(fā)育過程中花冠生長時該基因的表達水平達最高，隨著后續(xù)發(fā)育的進行，F(xiàn)3′H基因在花中的表達水平逐漸降低，最終在花完全發(fā)育成熟后不再表達[3]。山葡萄花色苷表達的相關研究顯示，在果實的整個發(fā)育過程中，F(xiàn)3′H基因在果實未著色時的表達水平最低，在果實有5%著色后表達水平開始提高，在果實有50%著色時表達迅速增強，最終在果實完全著色時表達最強烈[26]。除了花和果實外，該基因在植物的其他部位也有表達。黃文坤等[27]的研究表明，在紫荊澤蘭的根、莖、葉中都有F3′H基因的表達；Castellarin等[28]從葡萄中克隆出了4個F3′H基因，發(fā)現(xiàn)其在根中均有表達，其中2個基因還在莖、葉、花、種子中有表達。轉(zhuǎn)錄因子對F3′H基因的表達也有一定影響。周晨露[29]在對轉(zhuǎn)錄因子Ant1和Ant2調(diào)控大麥子粒花青素合成的研究中發(fā)現(xiàn)，2個轉(zhuǎn)錄因子中僅有1個在愈傷組織當中進行過表達時會出現(xiàn)CHI和F3′H表達水平上調(diào)的情況。轉(zhuǎn)錄因子TTG1也可以調(diào)節(jié)F3′H基因的表達，通過構(gòu)建TTG1依賴的bHLH四重突變體發(fā)現(xiàn)該基因在bHLH和ttg1多重突變的擬南芥苗中會出現(xiàn)下調(diào)表達的情況，同時還檢測到該基因在bHLH功能遺失的突變體苗中的表達是野生型中的30%，據(jù)此認為F3′H基因是由依賴TTG1和不依賴TTG1的雙重機制調(diào)節(jié)的[4，30]。此外，氮脅迫會顯著影響F3′H基因的表達，在缺氮條件下一些植物的F3′H基因會優(yōu)先表達，從而使植物中積累天竺葵色素和矢車菊色素[31，32]。

3.4 外界環(huán)境對F3′H基因表達的影響

F3′H基因的表達受到外界環(huán)境因子的影響，隨著外界環(huán)境的變化F3′H基因的表達也會出現(xiàn)相應的變化。根據(jù)已有的研究結(jié)果來看，影響F3′H基因表達的環(huán)境因子主要有水、溫度、聲波、微生物作用、鹽等[11，19，33-39]（表1）。此外，外源植物生長調(diào)節(jié)劑以及蔗糖含量的提高也會影響F3′H基因的表達。

4 F3′H在抗逆抗病蟲方面的研究

F3′H作為類黃酮合成途徑中的關鍵酶，在植物抵御逆境上有重要的作用。劉艷玲[12]利用NaCl、ABA和H2O2處理擬南芥和小麥后發(fā)現(xiàn)，其F3′H基因的表達量都出現(xiàn)明顯的下調(diào)，山奈酚和槲皮素的含量顯著升高，并且山奈酚和槲皮素間的動態(tài)平衡向山奈酚偏移，且通過構(gòu)建擬南芥F3′H過表達株系，發(fā)現(xiàn)山奈酚和槲皮素的動態(tài)平衡向槲皮素偏移，此時植物逆境脅迫的耐受能力減弱，說明F3′H基因提高植物抗逆能力的機制主要是通過調(diào)節(jié)山奈酚和槲皮素間的動態(tài)平衡來實現(xiàn)的。在抗病蟲方面，Sun等[40]在對水稻稻飛虱抗性的研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的轉(zhuǎn)錄阻遏復合物MYB22-TOPLESS-HDAC1，其通過F3′H的轉(zhuǎn)錄阻抑協(xié)同正向調(diào)節(jié)水稻對褐飛虱的抗性，具體的作用機制是MYB22通過EAR基序與TOPLESS相互作用，并將HDAC1募集到F3′H的啟動子并抑制其轉(zhuǎn)錄。Schuler[41]的研究發(fā)現(xiàn)，在甜橙苯丙素途徑的類黃酮生物合成分支中，F(xiàn)3′H將四羥基查爾酮的異構(gòu)化形式柚皮素轉(zhuǎn)化為圣草酚，將二氫山奈酚轉(zhuǎn)化為二氫槲皮素，將山奈酚轉(zhuǎn)變?yōu)殚纹に?，而羥基化的圣草酚可有效抑制棉鈴蟲的生長。炭疽病是禾本科常見的一種由真菌引起的侵染性病害，從苗期到成株期均可染病，對高粱、玉米等禾本科農(nóng)作物的危害極大。高粱植株被高粱炭疽病分生孢子攻擊后在真菌感染部位的葉片表皮細胞中會產(chǎn)生紅褐色色素，經(jīng)過質(zhì)譜法鑒定為3-脫氧花青素，3-脫氧花青素包括木犀草素、5-甲氧基木犀草素、芹菜素和阿拉伯糖基5-O-芹菜素的咖啡酸酯，這些化合物在細胞包涵體中積累，包涵體向真菌滲透部位遷移，然后釋放其內(nèi)容物，殺死真菌和合成這些化合物的細胞，高粱在受到真菌攻擊后會刺激3-脫氧花青素的合成，F(xiàn)3′H、CHS、DFR會在24 h內(nèi)被誘導并合成芹菜素和木犀草素等植物抗毒素[42]。在高粱中F3′H的表達負責木犀草素的合成，因此該基因的表達水平對確定感染高粱芽孢桿菌的高粱葉片的顏色變化至關重要[43]。

5 大麥黃酮合成相關酶以及大麥中F3′H的鑒定

大麥在遺傳學和育種領域有著廣泛的研究價值，但由于大麥基因組較大（大于5 Gbp，約為水稻的12倍），在分子生物學和基因組學上的研究一直受到限制[44]。2012年10月17日，國際大麥測序聯(lián)盟（IBSC）在Nature上公布了較為完善的大麥基因組測序圖譜[45]，為大麥基因組輔助研究和作物改良提供了新平臺。2017年4月27日，大麥基因組的研究又取得重大進展，通過綜合運用多種先進的測序和組裝技術，組裝出包含4.79 Gbp的大麥高質(zhì)量參考基因組序列，有效地拓寬了大麥日趨狹窄的基因庫[46]。綜上，與水稻等作物相比，大麥在基因方面的研究是滯后的。隨著黃酮化合物在各種植物的研究中成為熱點，一些大麥研究者的目光轉(zhuǎn)向了大麥黃酮合成途徑中各類酶結(jié)構(gòu)基因的研究（表2）[23，47-53]。

早在20世紀大多數(shù)黃酮合成途徑中的酶結(jié)構(gòu)基因已被鑒定出來，而大麥的F3′H基因在經(jīng)歷了很長時間后才從大麥中被鑒定出來。但在大麥中觀察到F3′H蛋白活性的時間較早。1991年在對大麥類黃酮生物合成途徑中的基因酶關系的研究中證實了F3′H的活性，當時的研究人員將NADPH添加到測定混合物中，使用14C柚皮素作為底物，標記的柚皮素有5%～10%轉(zhuǎn)化為圣草酚，在野生型大麥及ant17、ant18和ant19突變體的蛋白質(zhì)提取物中顯示出類黃酮3′-羥化酶活性[54]。SHOEVA 等[53]在對有色大麥類黃酮合成途徑的調(diào)控研究中，用基于NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的大麥預測F3′H序列設計的引物進行qRT-聚合酶鏈反應，在大麥中鑒定出位于染色體1H上的F3′H基因，并且發(fā)現(xiàn)在所用的有色大麥中紫色大麥的F3′H基因表達水平要高于另外兩種大麥。Vikhorev等[23]選用大麥栽培品種Bowman及其近等基因系作為材料，使用Oligo Primer Analysis Software v.7（https：//www.oligo.net/）基于IPK Barley BLAST Server中發(fā)現(xiàn)的序列構(gòu)建基因特異性引物進行qRT-PCR，最后在大麥的基因組中鑒定出了2個F3′H的基因拷貝（F3′H-1、F3′H-2），分別位于1HL和6HS染色體上，其中F3′H-1主要在糊粉層、麩皮和種皮中轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)3′H-2僅在莖中轉(zhuǎn)錄，并且通過對注釋基因啟動子元件（ATG起始位點上游約600 bp）的分析揭示了許多負責光依賴性激活的動因，特別是在F3′H-1中，研究人員揭示了參與類黃酮化合物生物合成的基因所需的Myb依賴性和Myc依賴性元件，最后還通過SWISS-MODEL程序?qū)Υ篼溨械腇3′H結(jié)構(gòu)進行了預測（圖2）[23]。

6 展望

有關F3′H基因的關注點集中在花色改變和一些有色果實的研究中，在植物抗逆性和對外界環(huán)境的應答中也有相關研究，主要內(nèi)容是各種植物F3′H基因的克隆和鑒定以及F3′H的作用機制。隨著人們對健康的關注度不斷提高，植物藥用價值和營養(yǎng)價值開始成為人們關注的重點。黃酮化合物作為植物獨有的次生代謝產(chǎn)物，在抗氧化、抗疲勞、預防心血管疾病方面有顯著效果，已成為人們廣泛關注的對象[55]。而F3′H作為黃酮途徑中的關鍵酶，其在植物功能性開發(fā)上的價值逐漸被人們所關注。已有很多關于F3′H的研究在藥用植物中開展。李爽等[20]對基原植物龍血竭中的F3′H基因進行了克隆和分析，發(fā)現(xiàn)F3′H在龍血竭生物合成中的潛在作用，為龍血竭人工結(jié)脂技術開發(fā)提供了分子基礎。張智新[56]對甘草中的F3′H基因進行了研究，通過基因敲除和過表達技術發(fā)現(xiàn)F3′H基因會負調(diào)控作用甘草酸的合成，導致其含量下降。此外，還有很多關于藥用植物上F3′H的研究。而大麥作為一種藥食同源植物，其功能性的開發(fā)受到人們的廣泛關注，其中的黃酮類化合物和含量備受關注[57]。大麥中的黃酮化合物含量豐富，總黃酮含量達30 mg/g，其中麥黃酮含量達0.009 mg/g，麥黃酮對改善記憶、老年癡呆癥的治療有一定效果[58，59]。關于大麥中F3′H基因的研究相對較少，該基因在大麥功能性開發(fā)中的應用研究也較少。隨著轉(zhuǎn)基因和基因編輯等技術的廣泛應用，對大麥F3′H基因進行克隆，利用基因工程更深入地了解該基因的功能，同時探索大麥F3′H基因和其他結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同轉(zhuǎn)化，有望培育出黃酮含量高并且可調(diào)控的大麥新品種。

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