黃花白及多倍體種質(zhì)創(chuàng)制研究

摘""要：本研究以黃花白及（Bletilla"ochracea"Schltr.）種子為誘變材料，采用不同濃度秋水仙素溶液和不同處理時(shí)間進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)處理，以期找到誘導(dǎo)黃花白及多倍體植株的試驗(yàn)條件。結(jié)果表明：以0.25%秋水仙素溶液浸泡黃花白及種子6"d為誘導(dǎo)黃花白及四倍體的最佳方式，可獲得較高的種子存活率和誘導(dǎo)率，其中種子存活率為35.66%，誘導(dǎo)率為45%。從形態(tài)學(xué)方面觀察，四倍體植株平均高度、葉數(shù)、葉寬、莖粗、塊莖、根長(zhǎng)和根粗均大于二倍體植株，并且四倍體植株氣孔明顯變大，氣孔密度降低。本研究創(chuàng)制的黃花白及四倍體新種質(zhì)將為黃花白及等藥用蘭科植物的遺傳性狀的改良提供技術(shù)參考和研究材料。

關(guān)鍵詞：黃花白及；多倍體；秋水仙素；流式細(xì)胞術(shù)；染色體計(jì)數(shù)中圖分類號(hào)：S326""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Polyploid"Germplasm"Induction"of"Bletilla"ochracea"Schltr.

HE"Jiamin1，2，"ZHENG"Sujin2，3，"ZENG"Xinhua2，3，"LUO"Shaofan2，"LAN"Siren1，"HUANG"Weichang1，2，3*

1."College"of"Landscape"Architecture，"Fujian"Agriculture"and"Forestry"University，"Fuzhou，"Fujian"350002，"China;"2.nbsp;Shanghai"Chenshan"Botanical"Garden"/"Eastern"China"Conservation"Centre"for"Wild"Endangered"Plant"Resources，"Shanghai"201602，"China;"3."Shanghai"Chenshan"Botanical"Garden"/"Shanghai"Key"Laboratory"of"Plant"Functional"Genomics"and"Resources，"Shanghai"201602，"China

Abstract："To"generate"polyploid"B."ochracea"Schltr"and"find"out"the"optimal"induction"condition，"the"seeds"of"diploid"B."ochracea"were"treated"with"different"concentration"of"colchicine"solution"under"a"range"of"treatment"time."The"results"of"the"study"suggested"that"the"seeds"treated"with"0.25%"colchicine"solution"for"six"days"was"effective"in"polyploid"induction"for"B."ochracea，"with"a"35.66%"survival"rate"of"treated"seeds"and"a"45%"induction"rate."The"tetraploid"gave"a"significant"enhancement"on"various"agronomic"traits，"including"plant"height，"leaf"number，"leaf"width，"stem"diameter，"bulb"length"and"root"diameter."In"addition，"tetraploid"B."ochracea"showed"increased"stomatal"aperture"and"decreased"stomatal"density."The"tetraploid"B."ochracea"was"generated"in"this"study，"which"would"provide"technical"support"and"basic"material"for"improving"the"genetic"traits"of"medicinal"orchids.

Keywords："Bletilla"ochracea"Schltr.;"polyploidy;"colchicine;"flow"cytometer;"chromosome"counting

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.011

黃花白及（Bletilla"ochracea"Schltr.）是蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla）多年生草本植物，在陜西、重慶、湖北、湖南、江西、廣西等地區(qū)分布。黃花白及花序具3～8朵，花朵常黃色，葉片為長(zhǎng)形披針狀，花朵淡雅，葉片秀麗，具有較高的園藝觀賞價(jià)值。此外，黃花白及和小白及[B."formosana"（Hayata）"Schltr.]與白及[B."striata"（Thunb.）"Reichb."f.]為同屬植物，均為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥[1]，其塊莖具備藥用價(jià)值，在我國(guó)常被用作白及的替代品。前人研究發(fā)現(xiàn)白及與黃花白及、小白及之間HPLC指紋圖譜相似度較高，這表明白及與黃花白及所含化學(xué)成分類似[2]。近期研究表明黃花白及多糖與白及多糖具有相似的結(jié)構(gòu)，具有抗腫瘤療效[3]。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黃花白及還具有促凝血[4]和抗胃潰瘍[5]等作用。然而，近年由于對(duì)植物源性藥物市場(chǎng)需求的不斷增加，黃花白及也面臨野生資源被過(guò)度采集和生境退化或喪失而導(dǎo)致數(shù)量銳減等問(wèn)題[6]。黃花白及已被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）和國(guó)際貿(mào)易公約（CITES）附錄Ⅱ，在我國(guó)屬于瀕危（EN）保護(hù)植物。

目前黃花白及的研究多集中在其藥用化學(xué)成分的分析和菌根共生等方面，對(duì)于黃花白及新種質(zhì)創(chuàng)新研究鮮有報(bào)道。因此，加快培育出性狀更優(yōu)良的黃花白及新品種對(duì)于滿足不斷增長(zhǎng)的藥材市場(chǎng)需求和保護(hù)黃花白及野生資源顯得更加迫切。多倍體誘導(dǎo)作為育種工具中的有效技術(shù)之一，對(duì)于優(yōu)良物種培育、品種雜交、性狀改良、生產(chǎn)和商業(yè)化等具有重要作用[7-8]。為創(chuàng)制表型和栽培性狀更優(yōu)良黃花白及新種質(zhì)，本研究采用秋水仙素溶液浸種法對(duì)黃花白及進(jìn)行倍性誘導(dǎo)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、染色體計(jì)數(shù)、氣孔觀察等方法鑒定黃花白及表型變異植株。黃花白及倍性新種質(zhì)的培育可為藥用蘭科植物育種提供技術(shù)參考。

1""材料與方法

1.1""材料

選取上海辰山植物園科研中心蘭科植物資源圃的黃花白及自交蒴果為試驗(yàn)材料。

1.2""方法

1.2.1""種子活力檢測(cè)""采用TTC改良染色法[9]對(duì)黃花白及種子活力進(jìn)行檢測(cè)（適用于新鮮采摘的種子），根據(jù)TTC染色結(jié)果計(jì)算種子活力率，選取活力良好的種子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將種子混樣后加入1.0%TTC染液沒(méi)過(guò)種子并搖勻，將其置于40"℃環(huán)境下避光染色12"h后吸取種子置于載玻片上，在體視顯微鏡下觀察染色情況。種子種胚顏色越紅，說(shuō)明種子活力越高；若種胚不變色，說(shuō)明種子無(wú)活力。隨機(jī)取3個(gè)視野，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算種子活力率，活力率=胚染上紅色種子數(shù)/有胚種子總數(shù)×100%，本試驗(yàn)所選取種子活力率為89.29%。

1.2.2""倍性誘導(dǎo)""以黃花白及種子為誘變材料，采用秋水仙素浸泡法進(jìn)行倍性誘導(dǎo)。在超凈工作臺(tái)對(duì)種子進(jìn)行無(wú)菌處理，先用75%酒精浸泡3"min，再用3%次氯酸鈉浸泡殺菌5"min，無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干水分。接著將種子分別轉(zhuǎn)移至0.25%、0.50%、1.00%秋水仙素溶液（誘導(dǎo)液添加不超過(guò)2.0%"DMSO）中避光誘導(dǎo)，對(duì)照組則用無(wú)菌水浸泡處理，各處理組均置于120"r/min轉(zhuǎn)速搖床暗處理3、6、9"d。每個(gè)處理種子數(shù)量約為100粒，每個(gè)處理重復(fù)5次。誘導(dǎo)處理結(jié)束后，用無(wú)菌水沖洗3次，利用無(wú)菌濾紙吸干水分后置于播種培養(yǎng)基使其恢復(fù)正常生長(zhǎng)。30"d后統(tǒng)計(jì)種子存活率，并繼代1次，90"d后再轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基，待植株生長(zhǎng)到210"d后，篩選形態(tài)變異植株并對(duì)其進(jìn)行倍性鑒定。

1.2.3""流式細(xì)胞檢測(cè)""每個(gè)處理選取20株誘變株進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，取0.50～1.00"cm2的樣本葉片，置于冰上的培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的細(xì)胞核提取緩沖液，用鋒利的雙面刀片快速垂直切碎葉片30～60"s，此過(guò)程盡量將材料浸沒(méi)于裂解液中。吸取混合溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至測(cè)定管內(nèi)，得到細(xì)胞核懸浮液，加入染色液（染色緩沖液+碘化丙啶+RNAseA儲(chǔ)備液），混勻后置于4"℃避光染色15～"30"min，隨后使用PARTEC"CyFlow流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。具體試驗(yàn)操作參照GALBRAITH等[10]的方法。

1.2.4""根尖染色體計(jì)數(shù)""參考王樂(lè)樂(lè)等[11]和MORAES等[12]的方法。從植株上切取3～4"mm長(zhǎng)勢(shì)旺盛根尖，將根尖置于對(duì)二氯苯飽和溶液中，并在4"℃條件下浸泡處理5"h，然后用Carnoy溶液[乙醇∶乙酸，3∶1（v/v）]在4"℃條件下固定12"h。再將固定的根尖用無(wú)菌水沖洗3～5次，將水吸干后，置于2.0%纖維素酶和果膠酶溶液，并在37"℃水中解離約15～20"min。根尖分生區(qū)細(xì)胞核用卡寶品紅染液染色3～5"min，壓片，最后置于顯微鏡下觀察根尖細(xì)胞染色體。

1.2.5""形態(tài)學(xué)觀察""參考前人研究方法[13-14]，對(duì)植株株高、葉片大小、數(shù)量、莖稈、塊莖大小、分蘗數(shù)等形態(tài)特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、測(cè)量，對(duì)比加倍植株與對(duì)照植株的形態(tài)變化。此外，氣孔特征通常是檢測(cè)倍性水平的重要指標(biāo)。采用OMIDBAIGI等[15]的方法，取對(duì)照和誘變植株葉片，用速干透明指甲油進(jìn)行處理之后，在光學(xué)顯微鏡觀察氣孔大小，并計(jì)算氣孔密度。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用Image"J軟件和IBM"SPSS"Statistics"27軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。樣本間差異的顯著性采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。使用Microsoft"Excel"2021軟件和Adobe"Photoshop"2024軟件繪制圖表。

2""結(jié)果與分析

2.1""秋水仙素誘導(dǎo)黃花白及

通過(guò)不同濃度的秋水仙素對(duì)黃花白及進(jìn)行處理，結(jié)果如表1所示，處理濃度越高且處理時(shí)間越長(zhǎng)，植株存活率越低。在處理時(shí)間均為6"d的情況下，秋水仙素濃度為0.50%和1.00%的處理植株死亡率達(dá)到100%。黃花白及在0.25%秋水仙素條件下處理6"d的誘導(dǎo)率達(dá)到45%，其次是1.00%秋水仙素處理種子3"d，誘導(dǎo)率為40%，但該處理?xiàng)l件下存活率只有8.69%。結(jié)合誘導(dǎo)率和存活率結(jié)果得出，黃花白及種子經(jīng)0.25%秋水仙素處理6"d是誘導(dǎo)出四倍體植株的最佳處理方式。

2.2""流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

誘導(dǎo)處理210"d后，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)誘變植株進(jìn)行DNA含量檢測(cè)和分析，以未經(jīng)處理的二倍體黃花白及為對(duì)照，根據(jù)二倍體黃花白及和誘變株黃花白及熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行快速鑒定，如圖1可見(jiàn)，二倍體黃花白及熒光強(qiáng)度大概在200處達(dá)到峰值，誘變株黃花白及熒光強(qiáng)度大概在400處達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的2倍。由此可見(jiàn)該誘變株為四倍體黃花白及。

2.3""根尖染色體計(jì)數(shù)

對(duì)經(jīng)過(guò)流式基因組檢測(cè)的加倍植株的根尖進(jìn)行染色體壓片處理，結(jié)果表明，未處理對(duì)照黃花白及根尖染色體數(shù)目為2n=2x=34，經(jīng)流式鑒定的基因組加倍黃花白及根尖染色體數(shù)目為2n=4x=68（圖2）。

2.4""表型性狀分析

在相同的培養(yǎng)條件下，對(duì)黃花白及四倍體和二倍體植株進(jìn)行形態(tài)比較分析。如圖3和表2所示，黃花白及四倍體植株表型發(fā)生顯著性變化，其植株株高、葉片數(shù)量、葉寬、莖粗、塊莖直徑、根長(zhǎng)和根粗平均數(shù)值均高于二倍體植株。其中四倍體黃花白及的葉寬、塊莖直徑和根粗?jǐn)?shù)值分別比二倍體黃花白及增加75.0%、52.4%和45.5%，具有顯著性差異（Plt;0.05）。此外，四倍體植株表型同時(shí)具有矮化（最矮株高為對(duì)照最矮的0.325倍）和變大（最高株高為對(duì)照最高的1.44倍）趨勢(shì)，并均與二倍體黃花白及表型差異明顯。與二倍體黃花白及對(duì)照相比較，四倍體植株葉片更寬更厚，根增長(zhǎng)加粗，這些都可作為四倍體黃花白及輔助鑒定的特征。

2.5""氣孔觀察

通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)二倍體黃花白及和四倍體黃花白及葉表皮氣孔進(jìn)行觀察和拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度和氣孔面積大小。結(jié)果顯示（表3、圖4A、圖4B），四倍體黃花白及葉表皮氣孔顯著大于二倍體黃花白及，同時(shí)氣孔密度變小。此外，葉片解剖結(jié)構(gòu)也受到多倍體化的影響，與二倍體植株相比，四倍體植株葉片整體比二倍體葉片厚46.31%（圖4C、圖4D）。

3""討論

黃花白及兼具觀賞與藥用價(jià)值，隨著藥用植物市場(chǎng)對(duì)植物源性藥物的需求增長(zhǎng)，黃花白及面臨過(guò)度采集和生境退化或喪失等挑戰(zhàn)。并且黃花白及在我國(guó)屬于瀕危（EN）植物，已被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》（IUCN）。多倍體誘導(dǎo)能使植物獲得改良性狀，如更大的器官（葉、花等）[16]，更高的生物量，耐旱性和抗病性增強(qiáng)[17-18]，這些特性的改變甚至可以使多倍體植物占據(jù)新的生態(tài)位[19-20]。并且這些多倍性狀的變化提高了它們?cè)谵r(nóng)藝用途的可能性[16]。因此，培育出產(chǎn)量更高，抗性更強(qiáng)等優(yōu)良性狀的黃花白及品種將成為黃花白及可持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵途徑。

多倍體誘導(dǎo)成功的因素涉及物種、抗有絲分裂劑、外植體材料類型、處理濃度和時(shí)間等。種子、不定芽、從生芽、原球莖、類原球莖、莖尖、帶節(jié)莖段等分裂旺盛組織常作為蘭科植物多倍體誘導(dǎo)的材料[21]。同其他植物一樣，秋水仙素也是蘭科植物倍性育種最常用的抗有絲分裂劑[21-22]。例如，LI等[23]使用秋水仙素對(duì)白及種子進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，得出經(jīng)0.1%秋水仙素處理7"d后，四倍體誘導(dǎo)率高達(dá)（40.67±0.89）%。崔廣榮等[24]利用0.2%～0.4%秋水仙素處理文心蘭（Oncidium）類原球莖薄切片10～20"d，四倍體誘導(dǎo)率可達(dá)26.70%。由于植物具有表皮蠟、種皮，或較厚的角質(zhì)層細(xì)胞等諸多物理屏障，因此抗有絲分裂劑的有效性會(huì)受到溶劑影響。DMSO可通過(guò)增加細(xì)胞滲透性從而提升化學(xué)試劑的吸收率，根據(jù)HAMILL等[25]研究，與溶于水的秋水仙素對(duì)照相比，用溶于2%或4%"DMSO的秋水仙素處理降低了香蕉外植體的存活率，但誘導(dǎo)獲得的四倍體植株數(shù)目增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，秋水仙素濃度和處理時(shí)間與存活率呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，這與LI等[23]誘導(dǎo)白及種子結(jié)果相似，隨著秋水仙素濃度和處理時(shí)間延長(zhǎng)，存活率逐漸降低，在0.4%濃度處理9"d時(shí)死亡率最高。此外，在LIU等[26]誘導(dǎo)鐵皮石斛（Dendrobium"officinale）研究中，也是隨著秋水仙素濃度提高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組原球莖存活率均降低，以0.4%濃度處理48"h死亡率最高。在本研究中，黃花白及在0.50%和1.00%秋水仙素條件下處理6"d的死亡率最高達(dá)到了100%，這可能是由于秋水仙素濃度太高、處理時(shí)間太長(zhǎng)以及添加了DMSO對(duì)種子毒害太強(qiáng)導(dǎo)致。不同物種對(duì)抗有絲分裂劑濃度和處理時(shí)間所呈現(xiàn)的效果也不同，因此，找到誘導(dǎo)率和存活率都較高的處理?xiàng)l件是倍性育種的關(guān)鍵。本研究黃花白及在0.25%秋水仙素條件下處理6"d時(shí)誘導(dǎo)率和變異率分別高達(dá)45%和55%，存活率為35.66%，其次是1.00%秋水仙素處理種子3"d，誘導(dǎo)率和變異率均為40%，但該處理?xiàng)l件下存活率只有8.69%。對(duì)比各處理組的誘導(dǎo)率和存活率數(shù)據(jù)，0.25%秋水仙素處理時(shí)間6"d是創(chuàng)制黃花白及四倍體植株的最佳方式。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和染色體計(jì)數(shù)檢測(cè)出23株四倍體，觀察發(fā)現(xiàn)大部分四倍體黃花白及呈現(xiàn)葉片變寬變厚、莖稈變粗、塊莖變大、根系變粗、氣孔變大和氣孔密度變小等性狀，與白及[23]、鐵皮石斛[26-27]、熒光蝴蝶蘭（Phalaenopsis"bellina）[14]、紫毛兜蘭（Paphiopedilum"villosum）[28]、紋瓣蘭[Cymbidium"aloifolium"（L.）"Sw.][29]等多倍體植株器官粗大化特征相一致。在大多數(shù)情況下，物種基因組加倍后植株器官（葉、花）通常會(huì)呈現(xiàn)“巨體效應(yīng)（gigas"effect）”特征。然而，在本研究中，出現(xiàn)部分四倍體植株較二倍體植株葉片更厚更寬、葉表皮更粗糙、氣孔更大，但整體植株更矮小現(xiàn)象。在前人的研究中也具有類似情況，如PODWYSZYNSKA等[30]誘導(dǎo)的四倍體郁金香（Tulipa"gesneriana）出現(xiàn)了矮化現(xiàn)象，與二倍體郁金香相比，四倍體郁金香的葉、花以及整體植株均顯著變小。除此之外，LI等[31]誘導(dǎo)的三倍體木槿（Hibiscus"moscheutos）的花比二倍體??；REGALADO等[32]誘導(dǎo)的四倍體矮牽牛（Petunia"axillaris）比二倍體矮牽牛矮，但葉片比二倍體矮牽牛緊湊（54%）；FETOUH等[33]誘導(dǎo)的四倍體日本女貞（Ligustrum"japonicum）平均數(shù)據(jù)比二倍體矮31.0%，冠幅小33.1%；以及PADOAN等[34]誘導(dǎo)的三倍體柑橘（Citrus"clementine）的葉比二倍體親本小。相關(guān)學(xué)者推測(cè)該現(xiàn)象可能是由于在高倍性水平下，細(xì)胞周期成本更高，細(xì)胞分裂延遲，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量更少和器官更小[35-36]。由于培育時(shí)間不足，后續(xù)的試驗(yàn)還需進(jìn)一步探究四倍體黃花白及與二倍體植株開(kāi)花性狀、塊莖藥用成分等方面的變化?？傊?，本研究誘導(dǎo)出的黃花白及四倍體植株與原二倍體植株形態(tài)變異顯著，為藥用蘭花種質(zhì)庫(kù)增添了“gigas”化和矮化的表型性狀的多倍體植物新材料，可為黃花白及遺傳性狀改良等研究和實(shí)踐應(yīng)用提供幫助。

致謝""本項(xiàng)研究由國(guó)家重要野生植物種質(zhì)資源庫(kù)支持。另外，感謝邵文、閆曉芳、劉鳳欒、邵麗和倪子軼老師們給出的寶貴建議和幫助。

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