DNA甲基化影響不同倍性西瓜抗旱鍛煉相關(guān)生理指標(biāo)的分析

摘""要：為了探索DNA甲基化對不同倍性西瓜抗旱鍛煉的影響，本研究以不同倍性西瓜懸浮培養(yǎng)細胞為材料，使用甘露醇（Mannitol）模擬干旱脅迫，經(jīng)過脅迫、恢復(fù)、再脅迫的方法測定細胞生長情況和抗性相關(guān)生理指標(biāo)。同時，利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷（5-AzaC）處理，探索甲基化對這些生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，在干旱條件下，抗逆鍛煉對細胞的生長有顯著的保護作用。但是，5-AzaC抑制了細胞的質(zhì)外體堿化，提升了丙二醛（MDA）含量，使脯氨酸（Pro）含量和超氧化物歧化酶（SOD）等保護酶活性降低，加劇了滲透脅迫的損傷，部分逆轉(zhuǎn)了細胞抗旱鍛煉的效果，且在西瓜二倍體和三倍體細胞中尤其明顯。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，MDA、Pro含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性指標(biāo)可以作為西瓜細胞干旱脅迫抗逆鍛煉效果的主要評定指標(biāo)。本研究可為DNA甲基化參與西瓜抗性鍛煉效果的評價指標(biāo)篩選和形成機制提供參考。

關(guān)鍵詞：西瓜；倍性；DNA甲基化；干旱脅迫；生理指標(biāo)；抗旱鍛煉中圖分類號：S651""""""文獻標(biāo)志碼：A

Effects"of"DNA"Methylation"on"Physiological"Indexes"Related"to"Drought"Hardening"in"Watermelon"with"Different"Ploidy

WANG"Xiaoqing1，2，3，"GAO"Yu1，2，3，"JIANG"Xuefei1，3*，"QIAO"Fei2*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University"/"Key"Laboratory"for"Quality"Regulation"of"Tropical"Horticultural"Crops"of"Hainan"Province，"Danzhou，"Hainan"571737，nbsp;China;"2."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572025，"China

Abstract："In"order"to"explore"the"effect"of"DNA"methylation"on"drought"hardening"of"different"ploidy"watermelon，"mannitol"was"used"to"mimic"drought"stress"in"suspension"cultured"cells"of"different"ploidy"watermelon."The"cell"growth"and"resistance"related"physiological"indexes"were"measured"after"stress，"recovery"and"re-stress"treatments."Meanwhile，"the"DNA"methyltransferase"inhibitor"5-azacytidine"（5-AzaC）"was"used"to"explore"whether"methylation"is"involved"in"resistance"regulation."The"results"showed"that"5-AzaC"could"retard"the"growth，"inhibit"the"extracellular"alkalization，"increase"the"content"of"malondialdehyde，"bring"down"the"content"proline"and"the"activity"of"protective"enzymes"such"as"SOD"in"all"types"of"cells."Moreover，"it"caused"the"membrane"permeability"raising"in"diploid"and"triploid"cells."Above"results"suggest"that"5-AzaC"can"aggravate"the"osmotic"stress"injury"and"reverse"the"effects"of"drought"hardening"partially."Principal"component"analysis"revealed"that"malondialdehyde"content，"proline"content，"PAL，"CAT"and"APX"activity"could"be"used"as"the"main"evaluation"indexes"for"evaluation"the"effect"of"drought"hardening."This"study"would"provide"clues"for"mining"the"physiological"indexes"for"evaluate"the"effects"of"stress"hardening"and"the"mechanism"of"DNA"methylation"involved"in"watermelon"resistance"regulation.

Keywords："watermelon;"ploidy;"DNA"methylation;"drought"stress;"physiological"index;"drought"hardening

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.019

西瓜（Citrullus"lanatus）是一種非常重要的園藝作物。在世界上，中國西瓜種植面積最大，其年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的67%左右[1-2]。干旱不僅會影響西瓜的光合作用，抑制細胞有絲分裂，使細胞膜發(fā)生膜質(zhì)過氧化，還會影響植物的電導(dǎo)率、滲透調(diào)節(jié)功能及活性氧代謝等[3-5]。因此，生產(chǎn)上經(jīng)常在苗期利用適度干旱鍛煉即“蹲苗”的措施來提高作物的抗旱能力[6]。

抗逆鍛煉是指植物經(jīng)過短期逆境處理，植物再次遭遇逆境時表現(xiàn)出更強的抗性，這種響應(yīng)也被稱為“脅迫記憶”[4-5]。例如，干旱鍛煉后的小麥遇到二次脅迫時，與未經(jīng)過干旱鍛煉的小麥相比可以緩解其減產(chǎn)[7]；再次遭遇干旱時，其苗高和鮮質(zhì)量都相對較高[8]。并且丙二醛（MDA）含量減少、脯氨酸（Pro）含量升高，過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等活性降低，說明干旱鍛煉可以減少活性氧的產(chǎn)生并且提高植物抗旱性[9-11]。然而，植物脅迫記憶的產(chǎn)生機制目前仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，脅迫記憶的產(chǎn)生過程與DNA甲基化修飾緊密相關(guān)[12]。植物在多倍體形成及其后續(xù)穩(wěn)定階段，基因結(jié)構(gòu)會經(jīng)歷重構(gòu)，基因的表達模式也會發(fā)生改變；在此過程中，表觀遺傳修飾（甲基化等）對基因功能和結(jié)構(gòu)的變化起到關(guān)鍵作用，促進了植物的適應(yīng)性和多樣性[13-15]，而多倍體的產(chǎn)生經(jīng)常會引起DNA甲基化變異[16]。西瓜多倍體材料豐富，不同倍性材料DNA甲基化研究方面已取得長足進展。例如，已明確西瓜基因組中DNA甲基化水平與倍性之間缺乏關(guān)聯(lián)[17]，并且觀察到三倍體西瓜表現(xiàn)出一種獨特的去甲基化模式[18]；在逆境條件下，發(fā)現(xiàn)不同倍性材料之間甲基化差異不明顯，但在相同NaCl濃度處理下二倍體甲基化率大于四倍體和三倍體[19]。然而，DNA甲基化是否參與了西瓜的抗旱鍛煉目前尚未見報道。

懸浮培養(yǎng)細胞具有生長一致、周期穩(wěn)定、受環(huán)境影響小等優(yōu)點，在細胞水平研究抗性形成機制方面有著獨特的優(yōu)勢[20]。因此，本研究以不同倍性西瓜懸浮細胞為材料，通過測定DNA甲基化對細胞生長量、電導(dǎo)率、質(zhì)外體堿、MDA、Pro含量和SOD、POD活性等生理指標(biāo)的變化，初步了解不同倍性西瓜抗旱鍛煉抗性形成機制，為西瓜抗旱生理研究和栽培提供參考。

1""材料與方法

1.1""材料

利用西瓜葉片誘導(dǎo)愈傷組織，培育并篩選出一致性、分散性較好的二倍體（2n）、三倍體（3n）和四倍體（4n）西瓜懸浮細胞作為試驗材料。該材料目前保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。懸浮細胞使用恒溫搖床150"r/min，25"℃，黑暗條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方與文獻[21]相同，初始接種量為5"mL，繼代周期為10"d。

1.2""方法

1.2.1""試驗處理""使用甘露醇（Mannitol）模擬干旱脅迫，參考ZHU等[22]的方法設(shè)定濃度（100"mmol/L）；使用DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷（5-AzaC）調(diào)節(jié)基因組DNA甲基化水平，參考ZHU等[20]的方法設(shè)定濃度（100"μmol/L）。每個倍性細胞系設(shè)計4個試驗處理：（1）CK（對照）；（2）S（脅迫處理）；（3）S-R（脅迫處理+恢復(fù)）；（4）A（脅迫處理+甲基化）（圖1）。

處理后的細胞于平臺期（10"d）連同培養(yǎng)基倒入真空抽濾裝置，抽干培養(yǎng)液，稱取0.10"g細胞于2"mL離心管中液氮速凍，然后存放于–80"℃超低溫冰箱待用。

1.2.2""懸浮細胞生長量及鮮質(zhì)量的測定""使用細胞壓積法（packed"cell"volume，"PCV）測定懸浮細胞的生長量[22]。在平臺期將懸浮細胞連同培養(yǎng)基倒入50"mL量筒中密封，靜置過夜，記錄懸浮培養(yǎng)體系總體積（VT）以及細胞沉淀體積（VC），計算出細胞的總體積變化：DPCV=VC/VT。在平臺期將細胞和培養(yǎng)基一同倒入真空抽濾裝置，將懸浮細胞抽至微干，使用萬分之一天平進行稱重，記錄細胞鮮質(zhì)量。

1.2.3""懸浮培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液pH（質(zhì)外體堿化）的測定""在細胞快速生長期（7"d），無菌條件下吸取2"mL細胞于5"mL離心管中，放入搖床中150"r/min，25"℃培養(yǎng)30～60"min后加入適量蒸餾水，再次穩(wěn)定30"min后倒入小燒杯[22]。進行以下3個處理：（1）Mannitol處理（100"mmol/L"Mannitol）；（2）CK處理（等體積超純水）；（3）Mannitol+5-AzaC處理（100"mmol/L"Mannitol+"100"μmol/L"5-AzaC）；以上3個處理30"min，分別使用pH計（Mettler"toledo，pH"12）測定pH的相對變化量（DpH）。

1.2.4""培養(yǎng)液電導(dǎo)率的測定""在細胞指數(shù)生長期（7"d），無菌環(huán)境下吸取5"mL細胞于10"mL離心管中，將其放入150"r/min，25"℃搖床培養(yǎng)30～"60"min后加入適量蒸餾水，繼續(xù)穩(wěn)定30"min后，進行以下3個處理：（1）Mannitol處理（100"mmol/L"Mannitol）；（2）CK處理（等體積超純水）；（3）Mannitol+5-AzaC處理（100"mmol/L"Mannitol+"100"μmol/L"5-AzaC）。以上3個處理10"min，分別立即測其電導(dǎo)率。

1.2.5""丙二醛含量和脯氨酸含量測定""參考鄭子凡等[23]的方法，使用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）分光光度法測定丙二醛（MDA）含量；磺基水楊酸法測定脯氨酸（Pro）含量。

1.2.6""抗氧化酶活性測定""參考鄭子凡等[23]的方法，使用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用生化法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；采用紫外分光光度計法測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。

1.3""數(shù)據(jù)處理

每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。使用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計分析軟件DPS"15.10的Duncan法進行差異顯著性分析。用Graphpad"Prism"8作圖。使用隸屬函數(shù)法[24]觀察DNA甲基化對細胞影響并進行綜合評價。當(dāng)測定指標(biāo)的變化率與抗旱性呈正相關(guān)，則Xu=（X–Xmin）/（Xmax–"Xmin）；當(dāng)測定指標(biāo)的變化率與抗旱性呈負相關(guān)，則Xu=1–（X–Xmin）/（Xmax–Xmin）。式中，Xu表示不同倍性西瓜懸浮細胞某一測定指標(biāo)的變化率，Xmin表示該指標(biāo)中的最小值，Xmax表示最大值。

2""結(jié)果與分析

2.1""滲透脅迫和DNA甲基化對細胞生長的影響

由圖2可知，處理S可以顯著降低細胞的鮮質(zhì)量和總體積，其中，2n、3n、4n在脅迫處理后的鮮質(zhì)量為對照的40%～50%。但經(jīng)S-R處理，細胞的生長可以恢復(fù)至對照的70%。而2n、3n、4n處理A的鮮質(zhì)量分別是處理S-R的71.31%、66.35%、41.79%，ΔPCV也呈現(xiàn)了相同的降低趨勢，逆轉(zhuǎn)了抗逆鍛煉的效果。說明DNA的甲基化參與了抗逆鍛煉對細胞生長的保護。

2.2""滲透脅迫和甲基化對質(zhì)外體堿化的影響

質(zhì)外體堿化是植物細胞遭受逆境后的重要保護機制之一[25]。由圖3可知，在2n、3n、4n中，Mannitol處理的ΔpH均比CK提高，而Mannitol+"5-AzaC處理的ΔpH均比Mannitol處理降低。表明滲透脅迫可以使培養(yǎng)液pH迅速上升。在3n中，ΔpH變化最為明顯，Mannitol處理比CK升高約0.32。同時，5-AzaC可以降低質(zhì)外體堿化的程度，Mannitol+5-AzaC處理的ΔpH比Mannitol處理降低約0.06～0.10。表明DNA的甲基化也參與了質(zhì)外體堿化。

2.3""滲透脅迫和甲基化對細胞膜透性影響

當(dāng)植物遭遇逆境時，細胞膜結(jié)構(gòu)極易受損，這種損傷使細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)部電解質(zhì)等成分流失，細胞電導(dǎo)率上升[26-27]。因此，可以通過測量電導(dǎo)率評估細胞膜所遭受的損害程度。由圖4可知，在2n、3n、4n中，Mannitol處理的電導(dǎo)率均比CK提高。而Mannitol+5-AzaC處理3n的電導(dǎo)率再次升高，且與CK差異顯著，2n、4n電導(dǎo)率則基本保持不變。同時，Mannitol+5-AzaC處理2n、4n的電導(dǎo)率小幅度上升，但與CK差異不顯著；而在3n中，電導(dǎo)率比CK約上升800"μS/cm，差異顯著。表明在三倍體中，抑制DNA去甲基化可導(dǎo)致細胞膜受損程度加深。

2.4""DNA甲基化對細胞丙二醛含量和脯氨酸含量的影響

MDA是細胞膜磷脂雙分子層受損，引發(fā)細胞膜膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，可以評估膜脂過氧化的變化[28]。由圖5可知，S-R處理的MDA含量顯著降低；而A處理2n、3n、4n的MDA含量均比S-R處理顯著升高，MDA含量分別是S-R處理的1.13倍、1.12倍、1.31倍。說明抗逆鍛煉可以降低干旱脅迫引起的MDA對質(zhì)膜的傷害，并且DNA的甲基化可能參與了MDA的生成調(diào)控。但是，在三倍體和四倍體中，對照的MDA含量較高，倍性增加造成MDA水平升高的問題仍有待探索。

植物遭遇干旱脅迫時可以通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增強植物的抗旱性[29]。S處理的Pro含量升高13～22"μg/g；2n的Pro含量升高約30"μg/g，3n、4n的Pro含量升高約11"μg/g；而復(fù)合使用5-AzaC后降低5～15"μg/g。在2n、3n、4n中，S處理的Pro含量均升高，而A、S-R處理的Pro含量的上升趨勢均受到抑制。說明抑制DNA甲基化降低了抗旱鍛煉的效果，表明DNA甲基化參與了細胞的滲透調(diào)節(jié)過程。

2.5""DNA甲基化對幾種抗氧化酶活性的影響

植物遭遇干旱脅迫時，可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶POD、SOD、APX、GSH-Px、CAT、PAL等的活性來減輕干旱脅迫帶來的傷害[8-11]。由圖6可知，在2n、3n、4n中，S處理的幾種抗氧化酶活性均顯著提高，而S-R處理均有所下降且差異顯著。說明抗逆鍛煉可以顯著降低過氧化物的產(chǎn)生。而A處理的抗氧化酶活性在不同倍性細胞上的變化趨勢不同。如SOD、APX、CAT、PAL活性在不同倍性細胞中，A處理的變化趨勢均顯著逆轉(zhuǎn)。而POD、GSH-Px活性在不同倍性細胞中的變化趨勢無明顯規(guī)律。說明去甲基化/甲基化均有可能參與了細胞清除過氧化物的過程，但對不同保護酶的作用不盡相同。

2.6""DNA甲基化對細胞影響的綜合性評價

對以上生理指標(biāo)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，很多指標(biāo)間存在極顯著相關(guān)性（表1），為了更有效地探討眾多生理指標(biāo)間的相關(guān)性和重要性，使用主成分分析[24]進行進一步綜合評價（表2）。在干旱脅迫抗逆鍛煉下，MDA、Pro含量及PAL、CAT、APX活性可以作為評價DNA甲基化影響細胞生長的主要指標(biāo)，SOD、POD活性和pH作為二級指標(biāo)。通過計算細胞在5-AzaC處理后的隸屬函數(shù)值發(fā)現(xiàn)，三倍體受甲基化的影響最大（平均隸屬函數(shù)值0.700）；二倍體次之（平均隸屬函數(shù)值0.433），四倍體受甲基化的影響最?。ㄆ骄`屬函數(shù)值0.365）。

3""討論

不同植物在干旱脅迫下會表現(xiàn)出不同的內(nèi)部適應(yīng)性機制，即便是同一物種的不同品種，在遭遇相同或不同的脅迫時，也可能呈現(xiàn)出不同的應(yīng)對策略與生理響應(yīng)模式[30]。在擬南芥[31]和番茄[32]"中均發(fā)現(xiàn)，遭遇干旱脅迫之后植物表現(xiàn)出更好的生長狀況，鹽和堿性脅迫誘導(dǎo)了水稻DNA甲基化的跨代改變[33]，HERMAN等[34]研究也發(fā)現(xiàn)桃葉蓼存在抗性跨代遺傳的現(xiàn)象。本研究通過干旱預(yù)處理細胞后，將其進行正常恢復(fù)培養(yǎng)，約經(jīng)過2次細胞分裂之后再次干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)細胞比直接脅迫生長更好，說明通過抗旱鍛煉后細胞可能具有更強的抗旱性，由此推測西瓜細胞也可能存在跨代遺傳的現(xiàn)象。復(fù)合使用5-AzaC處理后，抗旱鍛煉的效果被抑制，說明DNA去甲基化過程和抗性調(diào)節(jié)相關(guān)，并且甲基化可能是脅迫記憶形成的重要機制之一。

在干旱脅迫下，還可以通過測定細胞外pH和電導(dǎo)率判斷干旱對番茄細胞生長環(huán)境的影響[35]。鋁脅迫復(fù)合使用5-AzaC處理后，還可引起質(zhì)外體堿化現(xiàn)象，造成細胞生長環(huán)境改變，使生長受到抑制，并對細胞膜系統(tǒng)造成了傷害[26-27]。XU等[36]研究發(fā)現(xiàn)四倍體相比于二倍體和三倍體具有更大的基因組，基因表達水平保留更完整、維持相對較低的甲基化水平。此外，甲基化相關(guān)酶和調(diào)控因子的表達水平等差異也可能影響細胞對甲基化抑制劑的敏感性[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，四倍體西瓜懸浮細胞使用甘露醇處理后略高于甘露醇和5-AzaC共處理的電導(dǎo)率。由此推測四倍體西瓜基因組較大，所以受到的影響較小，本研究通過對不同倍性細胞進行綜合評價，結(jié)果也表明四倍體受到甲基化的影響較小。

此外，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也會影響懸浮細胞的生長[29]，且在不同的倍性中具有不同的表現(xiàn)。董民會[38]發(fā)現(xiàn)多倍體獼猴桃比二倍體染色體數(shù)量較多引起的基因劑量效應(yīng)減緩了MDA的形成。使用秋水仙堿誘導(dǎo)獼猴桃發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫10"d時的MDA含量低于脅迫5"d的MDA含量[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，三倍體和四倍體滲透脅迫10"d時MDA含量則低于對照，由此推測可能長時間脅迫導(dǎo)致細胞啟動防御機制，增加了其適應(yīng)能力，導(dǎo)致其MDA含量低于對照。而該現(xiàn)象并沒有發(fā)生在在二倍體中，說明脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDA可能和基因劑量負相關(guān)。復(fù)合使用5-AzaC處理細胞后與抗旱鍛煉后相比，MDA含量顯著上升，發(fā)生膜脂過氧化，細胞膜受損程度加深，表明5-AzaC抑制了抗旱鍛煉的效果，影響細胞的生長。

脯氨酸具有親水性，在干旱脅迫下其含量會增加，幫助細胞維持水分，脯氨酸含量越高其抗旱性越強[39-40]。水稻在干旱脅迫及恢復(fù)后其抗旱性會增強[40]。高鵬飛等[41]和陳翠紅等[42]也發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量隨脅迫時間的增加而上升。本研究結(jié)果表明，在干旱脅迫下脯氨酸含量顯著上升，抗旱鍛煉后的脯氨酸含量最高，這表明經(jīng)過預(yù)處理后的細胞抗旱性明顯增加。復(fù)合使用5-AzaC后，抗旱鍛煉誘導(dǎo)脯氨酸含量上升的效果被顯著抑制，印證了DNA的去甲基化和抗性相關(guān)基因的啟動緊密相關(guān)[43]。本研究還發(fā)現(xiàn)，利用5-AzaC抑制DNA甲基化可以逆轉(zhuǎn)抗性鍛煉的效果，說明DNA甲基化參與了抗逆鍛煉抗性的形成。且不同倍性材料之間效果不同，說明不同倍性材料之間DNA甲基化水平存在差異。

植物細胞在逆境下會產(chǎn)生大量的活性氧，植物可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，維持其正常的生長[3，"44]。在西瓜[29]和黃瓜[44]的研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會導(dǎo)致抗氧化酶活性增加。此外，在玉米和番茄的研究結(jié)果表明低溫鍛煉可以提高其抗冷性[45]。莫言玲等[24]結(jié)果表明不同倍性的植物抗氧化酶變化不同。本研究結(jié)果表明，在滲透脅迫處理下不同倍性細胞抗氧化酶系統(tǒng)具有相同的變化趨勢，POD、SOD、APX、GSH-Px、CAT、PAL活性與對照相比均顯著增加；經(jīng)過抗旱鍛煉后這些酶的活性與脅迫處理相比均有所下降，這可能是經(jīng)過抗旱鍛煉細胞產(chǎn)生活性氧較少，其含量相應(yīng)降低。本研究在細胞水平測定后發(fā)現(xiàn)，抗旱鍛煉和DNA甲基化共同處理下這些生理指標(biāo)變化趨勢不盡相同，但經(jīng)過相關(guān)性分析和主成分分析后發(fā)現(xiàn)部分指標(biāo)具有顯著相關(guān)性，并且在指標(biāo)的重要性上嘗試進行了排序，可為抗性鍛煉效果的評價體系構(gòu)建提供參考。

綜上所述，本研究結(jié)果表明DNA甲基化在不同倍性西瓜抗旱鍛煉中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過改變與抗旱相關(guān)基因的DNA甲基化水平，能夠影響西瓜的生理生化特性，從而影響其抗旱能力。這為后期進一步探索DNA甲基化相關(guān)基因在抗逆鍛煉中的具體機制提供科學(xué)依據(jù)。

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