秋石斛DenTFL1基因的克隆與表達(dá)分析

摘""要：TFL1基因?qū)儆诹字Ｒ掖及方Y(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding"protein，"PEBP）家族成員，與植物開(kāi)花調(diào)控密切相關(guān)。為探究秋石斛中TFL1基因的功能，本研究基于花序發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)克隆了1個(gè)秋石斛TFL1同源基因DenTFL1，并對(duì)其進(jìn)行生物信息分析、蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)以及表達(dá)模式的分析。結(jié)果表明：秋石斛DenTFL1基因cDNA全長(zhǎng)522"bp，編碼173個(gè)氨基酸；DenTFL1蛋白分子式為C870H1354N246O249S6，分子量為19.43"kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為7.82，蛋白具有親水性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；DenTFL1蛋白不含有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，占比61.85%，還含有23.70%的延伸鏈，14.45%的α-螺旋，三維結(jié)構(gòu)模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，DenTFL1含有PEBP保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，DenTFL1基因與金釵石斛、球花石斛中的同源基因親緣關(guān)系較近且蛋白序列的一致性較高，進(jìn)化較為保守。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，秋石斛DenTFL1蛋白主要與AT5G63440、LFY、SOC1、AGL24、AGL8等蛋白發(fā)生互作。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，DenTFL1基因在秋石斛不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的各個(gè)組織部位均有表達(dá)，其中在幼苗和成熟株的莖以及花柄中的表達(dá)量最高，在幼苗的根以及中苗的葉片和根中的表達(dá)量則相對(duì)較低；在花序發(fā)育的不同階段均有較高的表達(dá)量（除了長(zhǎng)度為3.0"cm的花序之外），在發(fā)育后期的花苞和成熟花各輪花器官中高表達(dá)，而在發(fā)育早期的各輪花器官中的表達(dá)量相對(duì)較低。本研究為進(jìn)一步揭示TFL1基因在秋石斛中花期調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：秋石斛；DenTFL1；基因克?。槐磉_(dá)分析中圖分類(lèi)號(hào)：S682.31""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"DenTFL1"Gene"in"Dendrobium"Hybrid

MO"Shunjin1，2，"LI"Zhengqi3，"YU"Xiaoyun1，2，"LU"Shunjiao1，2，"LIAO"Yi1，2，"YI"Shuangshuang1，2*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Crop"Gene"Resources"and"Germplasm"Enhancement"in"Southern"China，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Key"Laboratory"of"Tropical"Crops"Germplasm"Resources"Genetic"Improvement"and"Innovation"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Hainan"Engineering"Technology"Research"Center"of"Tropical"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"3."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China

Abstract："Gene"TFL1"belongs"to"the"phosphatidylethanolamine"binding"protein"（PEBP）"family"and"is"closely"related"to"plant"flowering"regulation."To"explore"the"functions"of"TFL1"gene"in"Dendrobium"hybrid，"based"on"the"transcriptome"data"of"floral"in"Dendrobium"hybrid，"a"TFL1"gene"was"cloned"and"named"DenTFL1."And"the"bioinformatic"analysis"protein"structure"and"subcellular"localization"prediction，"expression"patterns"analysis"were"done"to"explored"the"functional"of"DenTFL1."The"results"showed"that"the"full"length"of"DenTFL1"cDNA"sequence"was"522"bp，"encoding"173"amino"acids."Bioinformatics"analysis"showed"that"the"molecular"formula"of"DenTFL1"was"C870H1354N246O249S6，"the"theoretical"relative"molecular"mass"of"the"protein"was"19.43"kDa，"and"the"theoretical"isoelectric"point"was"7.82，"and"the"protein"was"hydrophilic"and"structurally"stable."Subcellular"prediction"showed"that"it"was"located"in"the"cytoplasm，"without"signal"peptide"and"transmembrane"domain."The"secondary"structure"was"dominated"by"61.85%"of"random"curl，"also"contained"23.70%"of"the"extended"chain，"14.45%"of"α-helix."The"three-dimensional"structural"model"was"basically"consistent"with"the"secondary"structure."The"conserved"domain"analysis"showed"that"DenTFL1"had"a"conserved"PEBP"domain"and"amino"acid"sequence"alignment"and"phylogenetic"tree"analysis"showed"that"DenTFL1"was"closely"related"to"D."nobile"and"D."thyrsiflorum."The"constructed"protein"network"showed"that"DenTFL1"mainly"interacted"with"AT5G63440，"LFY，"SOC1，"AGL24，"AGL8."Expression"analysis"showed"that"DenTFL1"was"expressed"in"all"tissues"of"different"development"stages"of"Dendrobium"hybrid，"and"had"the"highest"expression"level"in"the"stems"of"young"and"mature"plantlet"and"the"flower"stalks，"and"had"a"lower"expression"level"in"the"roots"of"young"plantlet"and"the"leaves"and"roots"of"medium"plantlets."Moreover，"it"had"a"high"expression"in"different"development"stage"of"inflorescence"except"3.0"cm"long"inflorescence."It"also"showed"high"expression"in"7.0"mm"and"9.0"mm"width"floral"bud"and"the"tissues"of"fully"open"flower，"but"expressed"lower"in"the"tissues"of"early"development"stages"of"floral"bud."The"research"could"provide"a"reference"for"the"flowering"regulation"of"Dendrobium"hybrid，"and"add"relevant"information"for"the"study"of"TFL1.

Keywords："Dendrobium"hybrid;"DenTFL1;"gene"cloning;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.003

秋石斛，也被稱(chēng)為蝴蝶石斛，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬多年生草本植物，具有重要觀賞價(jià)值。海南處于熱帶地區(qū)，憑借其優(yōu)越的氣候及地理優(yōu)勢(shì)，是熱帶花卉的主產(chǎn)區(qū)，也是我國(guó)秋石斛的主要產(chǎn)地[1]。近年來(lái)，秋石斛的栽種面積逐年擴(kuò)大，每年的秋石斛出貨量也不斷增多[2]。我國(guó)引入秋石斛栽植時(shí)間較晚，但是近年來(lái)秋石斛盆花生產(chǎn)發(fā)展速度快，具有很高的研究?jī)r(jià)值和商業(yè)前景。秋石斛花期集中在秋季，國(guó)內(nèi)花卉消費(fèi)呈現(xiàn)節(jié)日消費(fèi)的特點(diǎn)，如在春節(jié)、情人節(jié)等節(jié)日前后市場(chǎng)需求較大，秋石斛自然花期和市場(chǎng)需求旺季不遇，導(dǎo)致花卉的商品價(jià)值大大降低，嚴(yán)重影響了秋石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展。使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以誘導(dǎo)秋石斛提前開(kāi)花[3]，但是會(huì)造成花朵數(shù)量減少甚至畸形等不利影響[4]。作為觀花植物，秋石斛的成花狀況是影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的關(guān)鍵因素，成花質(zhì)量直接關(guān)系到秋石斛的觀賞價(jià)值。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，蘭花在分子育種方面也進(jìn)行了深入的研究[5]，有效調(diào)控秋石斛花期使之能按需開(kāi)花是目前秋石斛生產(chǎn)急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前關(guān)于秋石斛開(kāi)花相關(guān)基因研究較少，本研究對(duì)調(diào)控秋石斛花期相關(guān)的DenTFL1基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，以期為秋石斛花期調(diào)控提供有效的理論依據(jù)。

前人研究發(fā)現(xiàn)植物的開(kāi)花途徑主要有6種，即光周期途徑（photoperiod"pathway）、春化途徑（vernalization"pathway）、自主途徑（autonomous"pathway）、赤霉素途徑（gibberellin"pathway）、環(huán)境溫度途徑（ambient"temperature"pathway）和年齡途徑（age"pathway）[6]。各調(diào)控途徑的不同通路在植物體內(nèi)交匯后，共同作用將開(kāi)花信號(hào)傳遞給一系列成花/抑花因子，如FLOWERING"LOCUS"T（FT）和TERMINAL"FLOWER"1（TFL1）[7]，開(kāi)花調(diào)節(jié)因子被激活后共同調(diào)控植物的花期[8]。這2個(gè)調(diào)節(jié)因子均屬于PEBP（phosphatidylethanolamine-"binding"protein）家族成員[9]。盡管FT-like基因與TFL1-like基因在序列上展現(xiàn)出高度同源性，但二者卻具有拮抗功能[10]。具體而言，F(xiàn)T-like基因?qū)﹂_(kāi)花過(guò)程具有促進(jìn)作用，而TFL1-like基因則起到抑制開(kāi)花的作用[11]。在擬南芥中，F(xiàn)T蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白結(jié)合形成FT/FD蛋白復(fù)合物，誘導(dǎo)開(kāi)花基因表達(dá)，促進(jìn)擬南芥開(kāi)花，而TFL1基因表達(dá)時(shí)，TFL1蛋白也可以與FD蛋白結(jié)合，但是TFL1/FD復(fù)合物產(chǎn)生開(kāi)花抑制基因，從而抑制擬南芥的開(kāi)花[12]。迄今為止，開(kāi)花抑制因子TFL1同源基因被發(fā)現(xiàn)存在于番茄[13]、玉米[14]、龍膽[15]、菊花[16]、水仙[17]以及藏紅花[18]等植物中。TFL1基因在秋石斛中的作用機(jī)理并不明確，本研究基于花序發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，克隆秋石斛開(kāi)花關(guān)鍵基因DenTFL1，分析預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析基因表達(dá)特性，為秋石斛開(kāi)花調(diào)控提供有效的理論依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

秋石斛三亞陽(yáng)光（Dendrobium"hybrid，"Sonia"Hiasakul）采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶蘭花資源圃（儋州）。分別采取幼苗期莖（YS）、幼苗期根（YR）、幼苗期葉（YF）、中苗期莖（MS）、中苗期根（MR）、中苗期葉（MF）、成熟期莖（MaS）、成熟期根（MaR）、成熟期葉（MaF）及成熟的花梗（Ped）、花柄（Sta）等部位，同時(shí)采集長(zhǎng)度分別為1、3、5、7、9"cm的花序（1FB、3FB、5FB、5FB、9FB），直徑分別為1、3、5、7、9"mm的花苞（1F、3F、5F、7F、9F），以及直徑為3、5、7"mm花苞和完全開(kāi)放花朵的萼片（3S、5S、7S、FS）、花瓣（3P、5P、7P、FP）、唇瓣（3L、5L、7L、FL）、合蕊柱（3C、5C、7C、FC）等花器官（圖1）。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的中苗，在48"h內(nèi)每2"h采集中苗葉片。采樣時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取樣后立刻剪碎，用錫紙包裹后放入液氮中，于-80"℃冰箱保存?zhèn)溆?。所采樣品用于RNA的提取、基因克隆及表達(dá)分析。

1.2""方法

1.2.1""總RNA提取與基因克隆""使用天根RNAprep"Pure"Plant"Plus"Kit試劑盒提取秋石斛RNA，將質(zhì)量合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，于–20"℃冰箱保存?zhèn)溆?。以三亞?yáng)光秋石斛轉(zhuǎn)錄組中得到的DenTFL1基因序列為依據(jù)，使用Primer"Premier"5軟件設(shè)計(jì)引物（表1），用反轉(zhuǎn)錄的花苞cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，利用熱激法將得到的膠回收產(chǎn)物與大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α連接，挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，并挑選陽(yáng)性菌測(cè)序。

1.2.2""生物信息學(xué)分析""利用ExPasy-ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam）在線軟件分析蛋白的理化性質(zhì)；利用ExPASy-protscale預(yù)測(cè)分析蛋白的親水性；利用WoLF"PSORT（https：//"wolfpsort.hgc.jp/）和Cell"ploc2.0（http：//www.csbio."sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測(cè)DenTFL1蛋白的亞細(xì)胞定位；利用SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//"swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維空間結(jié)構(gòu)；利用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/"services/TMHMM-2.0/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)；利用SignalP-6.0（https：//services.healthtech."dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST工具獲得DenTFL1蛋白的同源序列，并用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析，使用MEGA-11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3""DenTFL1基因的表達(dá)分析""以三亞陽(yáng)光秋石斛的不同組織為材料分析秋石斛DenTFL1基因的組織表達(dá)特性。使用吐露港的2×Q3"SYBR"qPCR"Master"mix試劑盒，CFX96"Touch儀器進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，DenTFL1基因的相對(duì)表達(dá)量使用2???Ct法計(jì)算。DenTFL1基因的熒光定量PCR引物見(jiàn)表1，使用秋石斛β-actin基因作為內(nèi)參[19]。計(jì)算結(jié)果使用Origin"2024軟件制圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""DenTFL1基因克隆

以秋石斛花苞cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR成功擴(kuò)增出目的基因DenTFL1（圖2），經(jīng)測(cè)序獲得522"bp的序列。

2.2""DenTFL1蛋白的生物信息學(xué)分析

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，DenTFL1蛋白包含173個(gè)氨基酸，分子量為19.43"kDa，分子式簡(jiǎn)寫(xiě)為C870H1354N246O249S6，理論等電點(diǎn)（pI）為7.82；帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為2個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為20個(gè)；纈氨酸在氨基酸序列中占比最高（13.3%），其次為精氨酸（9.2%）；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)達(dá)39.91，推測(cè)其為穩(wěn)定堿性蛋白?？傆H水性平均值（GRAVY）為-0.257，推測(cè)DenTFL"1蛋白屬于親水蛋白（圖3）。保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（CDD）預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DenTFL1蛋白屬于PEBP超家族。SignalP"6.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Sec/SPI為0.0004，其它類(lèi)型蛋白占比為0.9996，表示DenTFL1蛋白可能不具有信號(hào)肽。TMHMM"2.0軟件分析該蛋白質(zhì)不含跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該蛋白屬于非分泌性蛋白。使用WoLF"PSORT和Cell-PLoc"2.0在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果均表明DenTFL1蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)。

DenTFL1蛋白由3種構(gòu)象組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲（random"coil）占比最高，為61.85%；其次是延伸鏈（extended"strand），占比23.7%；α-螺旋（alpha"helix）占比僅有14.45%（圖4A）。使用SWISS-MODEL軟件以匹配度最高的水稻PEBP家族Os02g0531600蛋白為模板建模，得到TFL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖4B），與二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，DenTF1L蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中同樣含有較多的無(wú)規(guī)則卷曲。

2.3""DenTFL1蛋白同源序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找其它植物中與DenTFL1蛋白同源的序列，并用DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DenTFL1序列與金釵石斛（KAI0496869.1）、球花石斛（KAL0910461.1）、Masdevallia"wendlandiana（QLM02222.1）、文心蘭（AIU44253.1）、香莢蘭（KAG0489005.1）等物種同源基因的氨基酸序列高度相似，同源性分別為96.53%、94.80%、85.55%、87.86%、85.38%（圖5），說(shuō)明可能具有相似功能。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，秋石斛DenTFL1與金釵石斛的親緣關(guān)系最近，其次是球花石斛，與高粱，油棕親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

2.4""DenTFL蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)與分析

利用STRING軟件對(duì)秋石斛DenTFL1進(jìn)行蛋白質(zhì)互作（protein-protein"interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。DenTFL1氨基酸序列與擬南芥AtTFL1相似性較高，同源性為69.1%。借助AtTFL1已知的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)對(duì)DenTFL1的蛋白互作調(diào)控機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖7），聚類(lèi)系數(shù)為0.891，PPI富集P值為5.57e-05，可能與DenTFL1存在互相作用的蛋白有10個(gè)，分別是AT5G63440（0.963）、LFY（0.938）、SOC1（0.931）、AGL24（0.924）、AGL8（0.907）、CAL（0.905）、F6I1.13（0.888）、DECOY（0.875）、AT1G64880（0.866）、VIN3（0.852）。GO富集分析表明，DenTFL1的互作蛋白主要參與花序分生組織特性的維持，胚胎后發(fā)育的正向調(diào)控、花朵發(fā)育的正向調(diào)控等生物過(guò)程。

2.5""DenTFL1基因的表達(dá)特性分析

為探究DenTFL1基因在秋石斛中的表達(dá)特性，本研究對(duì)秋石斛不同發(fā)育階段的不同組織、不同發(fā)育階段的花序、花苞以及不同發(fā)育階段花器官中的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。不同發(fā)育階段的不同組織表達(dá)特性分析結(jié)果表明，DenTFL1基因在秋石斛各發(fā)育階段不同組織中均有表達(dá)，在幼苗和成熟苗的莖、花柄中高表達(dá)，其次是成熟株的根和幼苗的葉片，中苗的莖、根和葉中的表達(dá)量均較低（圖8）。

花序和花苞的表達(dá)特性分析（圖9）發(fā)現(xiàn)，DenTFL1在花序發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，在長(zhǎng)度1"cm的花序中的表達(dá)量最高，之后表達(dá)量迅速下降，在長(zhǎng)度3"cm的花序中的表達(dá)量最低，之后表達(dá)量又迅速上升，在長(zhǎng)度5、7、9"cm的花序中均有較高的表達(dá)量。在各個(gè)發(fā)育階段的花苞中，DenTFL1主要在花苞發(fā)育后期高表達(dá)，其中在7"mm直徑的花苞中的表達(dá)量最高，其次是9"mm直徑的花苞。

在花器官中，完全開(kāi)放花朵的各個(gè)部位DenTFL1基因表達(dá)量明顯高于3、5、7"mm花苞的花器官。在未成熟時(shí)，幾個(gè)階段花苞中萼片的基因表達(dá)量均較高，當(dāng)花苞開(kāi)放時(shí)，各個(gè)花器官中基因表達(dá)量上升，明顯高于3、5、7"mm花苞，其中唇瓣的表達(dá)量最高（圖10）。

為分析DenTFL1在48"h周期內(nèi)表達(dá)變化，選取秋石斛中苗葉片部位進(jìn)行表達(dá)分析。DenTFL1在葉片中的晝夜表達(dá)結(jié)果顯示，DenTFL1在凌晨6：00—8：00時(shí)，中午12：00—16：00時(shí)，晚上18：00—22：00時(shí)的表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)（圖11），具有明顯的節(jié)律性。

3""討論

成花轉(zhuǎn)變是有花植物重要的生長(zhǎng)階段，最佳的開(kāi)花時(shí)期對(duì)于植物在適宜環(huán)境條件下完成生命周期具有重要意義[20]。花是絕大多數(shù)觀賞植物最重要的觀賞部位，開(kāi)花的早晚、開(kāi)花的應(yīng)節(jié)性等都極大地影響觀花花卉的價(jià)值，而通過(guò)花期調(diào)控使觀花花卉早開(kāi)花、應(yīng)節(jié)性開(kāi)花是提高其價(jià)值的有效手段之一，對(duì)開(kāi)花調(diào)控的分子機(jī)制解析是開(kāi)展花期調(diào)控研究的基礎(chǔ)。TFL1基因已被證實(shí)在調(diào)控植物的開(kāi)花時(shí)間及植株結(jié)構(gòu)中扮演重要角色[21]。TFL1是花序分生組織發(fā)育的主要負(fù)調(diào)控因子，可顯著延遲開(kāi)花時(shí)間[22]。蘋(píng)果中的MdTFL1-1和MdTFL1-2在花誘導(dǎo)過(guò)程中表達(dá)迅速降低，在擬南芥中異位表達(dá)會(huì)延遲開(kāi)花時(shí)間[23]，矮牽牛中的PhTFL1a/c都導(dǎo)致擬南芥明顯晚花[24]；龍眼中的DlTFL1-1和DlTFL1-2導(dǎo)致煙草和擬南芥開(kāi)花延遲[25]；在玫瑰中，開(kāi)花抑制因子TFL1同源物的缺失會(huì)改變開(kāi)花季節(jié)性，引起持續(xù)開(kāi)花[26]。由此推測(cè)，本研究克隆的秋石斛DenTFL1基因在調(diào)控花期方面也有一定的作用。本研究從秋石斛三亞陽(yáng)光品種中成功分離出DenTFL1基因，其全長(zhǎng)為522"bp，編碼173個(gè)氨基酸。通過(guò)蛋白序列對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，DenTFL1基因與金釵石斛（KAI049 6869.1）、球花石斛（KAL0910461.1）中的同源基因親緣關(guān)系較近且蛋白序列的一致性較高，推測(cè)DenTFL1基因在這幾個(gè)物種中的功能具有相似性。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析DenTFL1蛋白的基本理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等，推測(cè)其為穩(wěn)定堿性親水蛋白，且不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非分泌性蛋白。DenTFL1蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示DenTFL1蛋白有較多的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

植物的開(kāi)花受多種途徑調(diào)控，最終整合成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括許多開(kāi)花抑制因子和開(kāi)花促進(jìn)因子。在植物幼苗時(shí)期，開(kāi)花抑制因子高表達(dá)，抑制植物開(kāi)花，到了中苗期，開(kāi)花促進(jìn)因子開(kāi)始高表達(dá)，抑制開(kāi)花抑制因子的表達(dá)，使開(kāi)花抑制因子表達(dá)量降低，從而完成成花轉(zhuǎn)換，最終開(kāi)花[27]。而TFL1是一個(gè)開(kāi)花抑制因子，秋石斛DenTFL1的時(shí)空發(fā)育表達(dá)特性分析表明，其在幼苗期的莖中具有很高的表達(dá)量，而到了中苗之后，表達(dá)量明顯下降，與開(kāi)花抑制因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特性相一致。類(lèi)似的表達(dá)特性在二球懸鈴木（Platanus"acerifolia）[28]、巴西橡膠樹(shù)（Hevea"brasiliensis）[29]、三花龍膽（Gentiana"triflora）[15]等植物中同樣存在。表明秋石斛TFL1的同源基因DenTFL1同樣具有抑制秋石斛開(kāi)花的功能。

龍眼DlTFL1-1、DlTFL1-2在擬南芥過(guò)表達(dá)中出現(xiàn)了花序分支增多的表型，并且轉(zhuǎn)基因擬南芥中的AtAP1、AtFT、AtLFY基因表達(dá)量顯著下調(diào)[25]。TFL1及其同源基因除了具有調(diào)控開(kāi)花的功能之外，在很多物種中也報(bào)道了其參與調(diào)控植物形態(tài)建成及花器官發(fā)育的功能，如與AGAMOUS基因功能互作調(diào)控紫花苜蓿的花器官分化和花序發(fā)育[30]；與AGAMOUS、LEAFY共同互作調(diào)控?cái)M南芥花分生組織的分化[31]，通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控?cái)M南芥的開(kāi)花時(shí)間和花序發(fā)育[12]；與FT互作調(diào)控森林草莓（Fragaria"vesca）花序形態(tài)建成[32]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DenTFL1蛋白與LFY、AGL24、AGL8等存在相互作用，并且GO富集分析表明這些互作蛋白主要參與花序分生組織特性的維持，花朵發(fā)育的正向調(diào)控等生物過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)DenTFL1在花序、花苞發(fā)育的各個(gè)階段以及花器官發(fā)育的各個(gè)階段均有很高的表達(dá)量，表明DenTFL1極有可能也參與了秋石斛花序和花器官分化和發(fā)育的調(diào)控，但仍需通過(guò)進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

研究表明，TFL1除了能感受年齡途徑、自主途徑以及春化途徑的開(kāi)花信號(hào)調(diào)控植物開(kāi)花進(jìn)程之外，也能感受光周期途徑的開(kāi)花信號(hào)調(diào)控開(kāi)花進(jìn)程[27]，如森林草莓的FvTFL1突變將導(dǎo)致原本長(zhǎng)日照抑制開(kāi)花，短日照促進(jìn)開(kāi)花的植株在長(zhǎng)日照條件下出現(xiàn)早花的表型[33]，通過(guò)整合溫度信號(hào)和光周期信號(hào)來(lái)抑制森林草莓的開(kāi)花[34]，通過(guò)感受溫度和光周期信號(hào)調(diào)控黃瓜的有限生長(zhǎng)發(fā)育[35]等。本研究中，DenTFL1晝夜節(jié)律表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn)，其具有很明顯的晝夜表達(dá)規(guī)律，表明DenTFL1可以感受晝夜的光周期信號(hào)，從而誘導(dǎo)其表達(dá)量的變化，說(shuō)明DenTFL1可以通過(guò)感受光周期的信號(hào)調(diào)控秋石斛的開(kāi)花進(jìn)程。

本研究克隆了秋石斛DenTFL1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)特性分析，為全面深入解析DenTFL1生物學(xué)功能及作用機(jī)制提供參考，為后續(xù)深入解析其在秋石斛花期調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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