水牛睪丸生精細胞蛋白質(zhì)組學(xué)及其磷酸化修飾組學(xué)聯(lián)合分析

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2025.01.023

摘要：【目的】綜合分析水牛睪丸生精細胞蛋白質(zhì)組學(xué)及其磷酸化修飾組學(xué)，探究水牛精子發(fā)生過程中蛋白的動態(tài)表達變化及其調(diào)控機制，為解析水牛精子發(fā)生的分子機制提供理論依據(jù)。【方法】從性成熟期水牛睪丸組織中分離生精細胞，采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）構(gòu)建水牛生精細胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組表達譜。利用生物信息學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，篩選出關(guān)鍵蛋白及其磷酸化修飾位點。構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）和激酶—底物互作網(wǎng)絡(luò)。采用Western blotting檢測和免疫組織化學(xué)分析驗證篩選出的關(guān)鍵蛋白?！窘Y(jié)果】蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組中分別鑒定出1785和129個蛋白，共同鑒定到78個蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組中的高豐度蛋白包括熱休克蛋白和微管蛋白等。GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，RNA剪接在蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組中均被顯著富集（Plt;0.05），剪接體是磷酸化蛋白富集最多的信號通路。蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果表明，RNA識別基序結(jié)構(gòu)域的富集程度最高。細胞周期依賴性蛋白激酶在蛋白質(zhì)組PPI和磷酸化蛋白質(zhì)組激酶—底物互作網(wǎng)絡(luò)中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組共同鑒定到的78個蛋白中，有17個蛋白與精子發(fā)生密切相關(guān)。Western blotting檢測和免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明，LMNA蛋白及其磷酸化形式LMNA（pS392）均能被成功鑒定，LMNA主要分布于曲細精管基底膜附近，而LMNA（pS392）主要分布于曲細精管管腔附近。【結(jié)論】水牛睪丸生精細胞高表達熱休克蛋白可能與水牛適應(yīng)濕熱氣候有關(guān)，高表達微管蛋白可能與生精細胞在曲細精管內(nèi)的遷移密切相關(guān)。RNA剪接和磷酸化修飾可能通過影響蛋白的功能和分布來調(diào)控精子的發(fā)生過程。

關(guān)鍵詞：生精細胞；蛋白質(zhì)組；磷酸化蛋白質(zhì)組；RNA剪接

中圖分類號：S823.83文獻標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2025）01-0261-14

Integrated analysis of proteomics and phosphoproteomics in testicular spermatogenic cells of buffalo

HUANG Yu-lin1，WANG Chen-yang1，LIU Xu-yang1，ZHANG Peng-fei2*，F(xiàn)U Qiang3，ZHANG Ming3

（1College of Basic Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530200，China；2College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；3State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】To comprehensively analyze the proteomics and immunohistochemistry-based phosphopro-teomics of buffalo testicular spermatogenic cells，and explore the dynamic expression changes of proteins and their regula-tory mechanisms during buffalo spermatogenesis，which could provide theoretical basis for analyzing the molecular mechanism of buffalo spermatogenesis.【Method】Spermatogenic cells were isolated from testicular tissue of sexually ma-ture buffaloes，and the proteome and phosphorylation proteome expression profiles of buffalo spermatogenic cells were constructed by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）.The data were jointly analyzed by bioinformatics softwares to screen out key proteins and their phosphorylation modification sites.Protein interaction networks（PPI）and kinase-substrate interaction networks were constructed.Western blotting and immunohistochemical analysis were used to verify the screened key proteins.【Result】A total of 1785 and 129 proteins were identified in the proteome and phospho-proteome respectively，and 78 shared proteins were identified.High-abundance proteins in the proteome included heatshock proteins and tubulin.GO functional annotation and KEGG signaling pathway enrichment analysis results showedthat RNA splicing was significantly enriched in both the proteome and the phosphoproteome（Plt;0.05），and the spliceo-some was the signaling pathway with the most phosphorylated proteins enriched.The results of proteomic domain enrich-ment analysis showed that the RNA recognition motif domain was the most enriched.Cell cycle-dependent protein kinases played a key role in both proteome PPI and kinase-substrate interaction network in phosphoproteome.Among the 78shared proteins identified in the proteome and phosphoproteome，17 proteins were closely related to spermatogenesis.Western blotting and immunohistochemical analysis showed that both LMNA protein and the phosphorylated form LMNA（pS392）could be successfully identified.LMNA was mainly distributed near the basement membrane of theseminiferoustubules，while LMNA（pS392）was mainly distributed near the lumen of theseminiferous tubules.【Conclusion】The high expression of heat shock proteins in buffalo testicular spermatogenic cells may be related to the adaptation of buffalo to hot and humid climate，and the high expression of tubulin may be closely related to the migration of spermatogenic cellsin seminiferous tubules.RNA splicing and phosphorylation modifications may regulate spermatogenesis by affecting pro-tein function and distribution.

Key words：spermatogenic cells；proteome；phosphoproteome；RNA splicing

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32160789）

0引言

【研究意義】精子發(fā)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)進程，伴隨時空變化，包括精原細胞有絲分裂、精母細胞減數(shù)分裂及精子形成。生精細胞作為精子發(fā)生的執(zhí)行者，涵蓋了多種類型的精原細胞、精母細胞與精子細胞（Tan et al.，2023）。精原細胞為二倍體祖細胞，具有分化為精母細胞和進行有絲分裂自我更新的雙重功能；初級精母細胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂后形成次級精母細胞，次級精母細胞在第二次減數(shù)分裂中進一步分裂為單倍體的圓形精子細胞；圓形精子細胞經(jīng)歷細胞質(zhì)及細胞核的系列變化，最終形成精子并釋放至生精小管（Rabbaniet al.，2022）。水牛的生精表觀遺傳周期為8.6 d，生精過程持續(xù)約38 d，屬于大型家畜中較短的生精周期（Huang et al.，2016）。目前，針對水牛雄性生殖的研究較為匱乏，且其生精過程與其他物種差異較大。因此，深入探究其分子機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】精子發(fā)生歷來是研究的重點，尤其是不同物種間的精子發(fā)生差異。Gan等（2013）利用基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，鑒定了2008種小鼠精原細胞、精母細胞及精子中的蛋白；Chen等（2017）測序分析了男性生殖細胞中的小RNA，并構(gòu)建了miRNAs圖譜；Chen等（2018）采用高精度單細胞測序方法構(gòu)建了小鼠精子發(fā)生過程的轉(zhuǎn)錄組圖譜；Wang等（2018）首次在單細胞水平闡明了人類精子發(fā)生過程中基因表達的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；吳朝棟（2019）利用全基因組DNA甲基化測序和NA-SEQ技術(shù)探究了圩豬睪丸甲基化和轉(zhuǎn)錄組的變化，篩選出了相關(guān)候選基因和通路；Wang等（2019a）在分子層面探究了哺乳動物減數(shù)分裂過程中染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；哈斯高娃（2022）通過對不同年齡段雙峰駝睪丸進行全轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān)的候選靶基因；伏曉玉（2023）通過對藏綿羊和胡羊睪丸進行轉(zhuǎn)錄組測序與生物信息學(xué)分析，識別了與精子發(fā)生相關(guān)的差異表達基因、轉(zhuǎn)錄本及可變剪接事件；石軍（2023）利用轉(zhuǎn)錄組測序分析了牦牛睪丸組織不同發(fā)育階段的差異表達基因，篩選出了與胰島素和肽類激素相關(guān)的信號通路；鄒玥（2023）對黔北麻羊睪丸進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)IGF1基因在睪丸發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；Huang等（2023）采用單細胞多組學(xué)測序揭示了男性精母細胞減數(shù)分裂重組過程中DNA去甲基化事件；Sahlu（2023）通過對荷斯坦公牛睪丸進行全轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出了與睪丸發(fā)育相關(guān)的候選基因；馬劍峰等（2024）則通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了大白豬和青峪豬睪丸中差異基因的表達，探討了其生物學(xué)功能；梅艷芳等（2024）通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，12月齡布萊克特黑牛精子發(fā)生過程中差異表達基因主要富集在Wnt和PI3K-Akt信號通路；石淳元和趙彥玲（2024）通過對藏野豬的睪丸進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出了與性成熟相關(guān)的候選基因?！颈狙芯壳腥朦c】蛋白作為生命活動的關(guān)鍵執(zhí)行者，其翻譯后修飾對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白定位和降解等生物學(xué)過程具有重要影響，并與多種疾病密切相關(guān)（Kitamura and Galligan，2023）。磷酸化是哺乳動物體內(nèi)最常見的翻譯后修飾，由500種不同的激酶催化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸發(fā)生磷酸化。水牛精子發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在睪丸和精子水平（Holland and Ohlendieck，2015；Huang et al.，2015；Hou et al.，2019；Li etal.，2019），鮮見對生精細胞蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探究水牛生精細胞中的蛋白表達及翻譯后修飾，為探究精子發(fā)生機制和水牛優(yōu)良種質(zhì)的培育提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

新鮮睪丸組織取自當(dāng)?shù)赝涝讏鲂猿墒炱谒＃〔暮?，將組織置于無菌生理鹽水中，3 h內(nèi)送至實驗室。所用抗體均購自美國Abcam公司；ProLongTM Gold抗熒光淬滅封片劑和磷酸化肽段富集試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific公司；色譜柱和純化柱購自美國Waters公司。

1.2生精細胞分離與鑒定

將取回的睪丸去除被膜和白膜，使用75%酒精消毒，剪碎，放入含0.1%膠原酶Ⅳ的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基中，37℃搖床孵育15min，離心去除上清液。加入含0.25%胰蛋白酶和2μg/mL DNaseⅠ的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基，在37℃下消化10 min，待曲細精管完全酶解后，加入等量完全培養(yǎng)基終止消化。用40μm過濾篩過濾細胞，130×g離心5 min。培養(yǎng)基重懸后，將細胞轉(zhuǎn)移到0.1%明膠覆蓋的100 mm細胞培養(yǎng)皿中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，收集懸浮細胞進行鑒定。將生精細胞滴于載玻片中央，自然晾干后，使用4%多聚甲醛在室溫下固定10 min；PBS洗滌后，加入含0.1%Triton X-100的PBS，室溫孵育10min。加入一抗DDX4，4℃下孵育12 h；加入二抗IgG-Hamp;L（Alexa Fluor?488），37℃下避光孵育1h；用PBS洗滌載玻片3次，加入含DAPI的ProLongTM Gold抗熒光淬滅封片劑，然后將載玻片置于熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3蛋白提取與烷基化修飾

用PBS洗滌生精細胞3次，加入10 mL蛋白裂解緩沖液（8 mol/L尿素、20 mmol/LHEPES、2.5 mmol/L焦磷酸鈉、1 mmol/Lβ-甘油磷酸酯、1 mmol/L釩酸鈉和1%蛋白酶抑制劑，pH 8.0）；使用超聲細胞破碎儀對樣品進行超聲處理，檢測蛋白質(zhì)濃度；每個樣品取5 mg蛋白，加入1.25 mol/L DTT，55℃溫育30 min；加入樣品體積1/10的碘乙酰胺，室溫避光孵育15 min；加入3倍樣品體積的20 mmol/L HEPES （pH 8.0）稀釋烷基化蛋白溶液；加入樣品體積1/50的1 mg/mL胰蛋白酶，37℃下消化12h。

1.4肽段純化

酶解后的肽段利用Sep-Pak C18純化柱純化。向樣品中加入20%TFA，于冰上孵育15 min；離心，將懸浮液轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中；使用5 mL乙腈激活Sep-Pak C18色譜柱，并用1、3、6 mL 0.1%TFA連續(xù)清洗；加入樣品，采用1、5、6 mL 0.1%TFA清洗色譜柱；利用2 mL色譜柱清洗液（0.1%TFA，5%乙腈）清洗一次；加入2 mL洗脫液（0.1%TFA，40%乙腈）收集多肽，重復(fù)3次；收集洗脫液，于-80℃冰箱冷凍過夜。純化后的肽段5%用于蛋白質(zhì)組分析，95%用于磷酸化肽段富集和磷酸化蛋白質(zhì)組分析。

1.5磷酸化肽段富集

利用TiO?磷酸肽段富集試劑盒富集肽段。組裝磷酸化柱，使用20μL洗滌緩沖液清洗，3000×g離心2 min；使用20μL結(jié)合/校正緩沖液在3000×g下離心2 min；將樣品加入磷酸化柱中，1000×g離心5 min；分別加入結(jié)合/平衡緩沖液、平衡緩沖液、洗滌緩沖液和水，3000×g離心2 min。磷酸化樣品用50μL洗脫緩沖液在1000×g下洗脫5min。

1.6液相色譜分離

采用E2695高pH反相液相色譜法，利用Waters X-Bridge C18色譜柱分離多肽。流動相A為2%的乙腈水溶液，流動相B為98%的乙腈水溶液，pH 10.0，洗脫時間80 min。在0.5 mL/min的流速下，流動相B的濃度在10～55 min內(nèi)從0增加到35%。收集10～55 min的餾分，最后合并為12個餾分。

1.7質(zhì)譜分析

使用EASY-nLC 1000納升級液相色譜系統(tǒng)對肽段進行分離。多肽溶解于溶劑A（2%乙腈，0.1%甲酸）中，然后用溶劑B（98%乙腈，0.1%甲酸）洗脫，流速為250 nL/min，洗脫程序：2%～6%溶劑B 5 min，6%～15%溶劑B 27 min，15%～23%溶劑B 17 min，23%～98%溶劑B 2 min，98%～2%溶劑B 5 min和2%溶劑B 5min。對于磷酸化蛋白質(zhì)組的肽段，使用溶劑B以250 nL/min的流速洗脫，歷時90 min，洗脫程序：0～13%溶劑B 4 min、13%～20%溶劑B 40 min、20%～32%溶劑B 36 min、32%～98%溶劑B 5 min和98%溶劑B 5min。質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置：一級質(zhì)譜分辨率70000 m/z，一級質(zhì)譜掃描范圍300～2000 m/z，二級質(zhì)譜分辨率17500m/z，碰撞模式為高能碰撞解離（HCD），歸一化碰撞能量27。

1.8生物信息學(xué)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析采用Proteome Discoverer 2.1和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/tax-onomy/9913）。檢索條件設(shè)定：一級質(zhì)量誤差：±20 PPM；二級質(zhì)量誤差：±0.02 Da；靜態(tài)修飾：氨基甲?；–）乙基；動態(tài)修飾：蛋氨酸（M）氧化；酶消化方法：胰蛋白酶；最大缺失位點：2；蛋白和肽段鑒定的假陽性率（FDR）：1%。建立表達譜后，對蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行GO功能注釋（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）和KEGG信號通路富集（https：//www.genome.jp/kegg）分析。使用STRING 11.0（https：//string-db.org/）獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.0進行可視化。采用精子發(fā)生在線1.0數(shù)據(jù)庫（https：//mcg.ustc.edu.cn/bsc/spermgenes/simple.php）富集與精子發(fā)生相關(guān)的蛋白。

1.9免疫組織化學(xué)染色

睪丸組織使用4%多聚甲醛固定24h，采用梯度酒精、二甲苯脫水并用石蠟包埋；將樣本切成石蠟切片，放入50℃烘箱中烘烤12h；切片采用梯度酒精脫蠟，并使用3%甲醇過氧化氫孵育30min；采用pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)，PBST沖洗；1%Triton X-100-PBST溶液孵育30 min；5%山羊血清封閉1 h；加入一抗DDX4、LMNA和LMNA（pS392）于4℃下孵育12 h，PBST洗滌3次；加入二抗IgG-Hamp;L（Alexa Fluor?488）于37℃下避光孵育1 h，PBST洗滌3次；加入含DAPI的ProLongTM Gold抗熒光淬滅封片劑，于熒光顯微鏡下采集圖像。

1.10 Western blotting檢測

蛋白樣品經(jīng)5%SDS-PAGE（80 V，30 min）和12%SDS-PAGE（120 V，90 min）電泳分析后，在100 V 300 mA條件下轉(zhuǎn)膜1 h；室溫下使用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，以阻止非特異性結(jié)合；1×TBST洗滌3次，加入一抗LMNA和LMNA（pS392），于4℃下孵育12h；1×TBST洗滌3次，加入二抗，室溫下孵育1h；加入ECL發(fā)光顯影液，在凝膠顯影儀下曝光觀察。

2結(jié)果與分析

2.1 DDX4定位與生精細胞鑒定結(jié)果

DDX4是一種生殖細胞特異性蛋白，僅在睪丸生精細胞中表達（Kimetal.，2015）。水牛睪丸免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖1-A）顯示，DDX4分布于曲細精管，定位于細胞質(zhì)，與生精細胞在曲細精管中的位置相符。對分離的生精細胞進行免疫熒光染色鑒定，結(jié)果（圖1-B）顯示，DDX4分布于細胞質(zhì)，經(jīng)統(tǒng)計分析，生精細胞的陽性率為95%。

2.2生精細胞蛋白質(zhì)組理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果

在生精細胞蛋白質(zhì)組中，共鑒定出11809個特異性肽段，對應(yīng)1785個蛋白。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，蛋白理論等電點（pI）主要分布在5～10（圖2-A），蛋白分子量主要分布在20～80 Da（圖2-B），蛋白序列覆蓋率主要分布在40%以內(nèi)（圖2-C）。所有鑒定出的蛋白至少有一個特異性肽段（圖2-D）。

2.3高豐度蛋白功能分析結(jié)果

肽匹配圖譜（PSM）可作為蛋白的半定量指標(biāo)，PSM值越大表示蛋白豐度越高。在生精細胞蛋白質(zhì)組中，發(fā)現(xiàn)了10種高豐度蛋白（表1），其中HSPA2、HSP90AA1、HSP90B1和HSPA5為熱休克蛋白，具有分子伴侶蛋白活性，能增強細胞抗應(yīng)激能力，這可能與水牛適應(yīng)濕熱氣候有關(guān)。微管蛋白家族中TUBB4B、LOC100295712、TUBB5和TUBA1A組成了微管，微管作為細胞骨架的主要組成部分，在維持細胞內(nèi)物質(zhì)的形狀、運動和運輸方面發(fā)揮著重要作用，可能與生精細胞在曲細精管內(nèi)的遷移密切相關(guān)。血紅蛋白亞基β（HBB）和延伸因子1-α1（EEF1A1）負責(zé)調(diào)節(jié)抗病毒先天免疫反應(yīng)（Yang et al.，2019），并在mRNA翻譯過程中促進多肽鏈的延伸。

2.4生精細胞蛋白質(zhì)組GO功能注釋分析結(jié)果

GO功能注釋分析按細胞組分（Cellular compo-nent，CC）、生物學(xué)過程（Biological process，BP）和分子功能（Molecular function，MF）三大類別進行。生精細胞蛋白質(zhì)組中有1740個蛋白具有功能信息。在生物學(xué)過程中，顯著富集的GO功能條目包括RNA剪接（RNA splicing）、翻譯（Translation）、細胞定位（Cellular localization）、氧化還原過程（Oxidation-reduction process）、蛋白折疊（Protein folding）、細胞酰胺代謝過程（Cellular amide metabolic process）等（Plt;0.05，下同）（圖3-A）。在細胞組分中，細胞器（Organelle）的富集程度最高（圖3-B），可能是由于細胞活性增加導(dǎo)致生精細胞不斷分化所致。在分子功能中，顯著富集的GO功能條目包括分子結(jié)合和水解酶活性（Hydrolase activity）等，分子結(jié)合中RNA結(jié)合（RNA binding）的富集程度最高（圖3-C）。此外，在生物學(xué)過程中，還發(fā)現(xiàn)了精卵識別、有性生殖、精子發(fā)生、雄配子生成、精母細胞分化、生殖細胞發(fā)育、配子生成、受精、生殖和精子運動等許多與生殖相關(guān)的過程（圖4），這些過程涉及大量功能蛋白和調(diào)節(jié)因子。

2.5生精細胞蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果

使用DAVID V6.8軟件對水牛生精細胞蛋白質(zhì)組進行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（圖5）僅展示前10個被顯著富集的結(jié)構(gòu)域，其中，RNA識別基序結(jié)構(gòu)域（RNA recognition motif domain）富集程度最高，其能識別多種RNA和蛋白，參與多種生物功能，通常與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控相關(guān)，表明精子發(fā)生過程中調(diào)控機制的復(fù)雜性。

2.6生精細胞蛋白質(zhì)組PPI分析結(jié)果

將蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，再將得到的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.0進行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示，PPI由1094個節(jié)點和13763條邊組成，其中多數(shù)節(jié)點存在2個以上的互作關(guān)系（圖6）。選取節(jié)點間中心度最大且大于平均節(jié)點度的前10個節(jié)點蛋白為關(guān)鍵蛋白（表2），其中，熱休克蛋白A8（HSPA8）、細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）和DNA定向RNA聚合酶II亞基C（POLR2C）是PPI分析中最關(guān)鍵的3個蛋白。

2.7生精細胞磷酸化蛋白質(zhì)組GO功能注釋分析結(jié)果

在磷酸化蛋白質(zhì)組中，共鑒定出129種磷酸化蛋白、201個磷酸化肽段和417個磷酸化位點。其中，絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）位點的數(shù)量分別為328、79和10個。在生精細胞磷酸化蛋白質(zhì)組中，有123個蛋白質(zhì)具有注釋信息。在生物學(xué)過程中，RNA剪接是最顯著富集的GO功能條目，其他富集的GO功能條目還包括基因表達（Gene expression）、細胞周期（Cell cycle）、有絲分裂運動（Mitotic cytokinesis）、氮化合物過程（Nitrogen com-pound metabolic process）、繁殖（Reproduction）和蛋白質(zhì)靶向（Protein targeting）等（圖7-A），顯示了磷酸化蛋白功能的多樣性。在細胞組分中，細胞核（Nucleus）為最顯著富集的GO功能條目，表明鑒定出的磷酸化蛋白主要位于細胞核中（圖7-B）。在分子功能中，顯著富集到的GO功能條目有分子結(jié)合和酶活性（圖7-C）相關(guān)條目。

2.8生精細胞磷酸化蛋白質(zhì)組KEGG信號通路富集分析結(jié)果

在鑒定到的129個磷酸化蛋白中，有62個被成功映射到不同的信號通路上。剪接體（Spliceosome）是磷酸化蛋白富集最多的信號通路，與GO功能注釋分析結(jié)果相符，表明這些蛋白在RNA剪接過程中發(fā)揮了重要作用。其他富集的信號通路包括代謝途徑（Metabolic pathway）、RNA轉(zhuǎn)運（RNA transport）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondarymetabolite）、細胞周期（Cell cycle）和細胞衰老（Cel-lular senescence）等（圖8）。

2.9生精細胞磷酸化蛋白質(zhì)組激酶—底物互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

使用iGPS構(gòu)建生精細胞激酶及其底物的磷酸化位點網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)已確定的磷酸化位點，預(yù)測激酶與底物間的互作關(guān)系。結(jié)果（圖9）顯示，共有451個激酶—底物互作關(guān)系，其中，與359個磷酸化位點對應(yīng)的36個底物受205個預(yù)測激酶的調(diào)控。細胞周期蛋白依賴性激酶7（CDK7）調(diào)控的底物數(shù)量最多，其活性最高。

2.10 GO功能注釋聯(lián)合分析結(jié)果

從蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的GO功能注釋結(jié)果中，選取前20個顯著富集的生物學(xué)過程進行聯(lián)合分析。結(jié)果（圖10）顯示，2種組學(xué)的共同信號通路均與RNA剪接相關(guān)。此外，蛋白質(zhì)組中單獨富集的生物學(xué)過程包括蛋白折疊、氧化還原過程、細胞酰胺代謝過程等；磷酸化蛋白質(zhì)組中單獨富集的生物學(xué)過程為細胞器組織（Organelle organization）、染色體組織（Chromosome organization）、細胞衰老的正調(diào)控（Positive regulation of cell aging）等。在磷酸化蛋白質(zhì)組中，參與細胞衰老的蛋白包括高遷移率組A1（HMGA1）、Sirtuin 1（SIRT1）和LaminA/C（LMNA）。

2.11 PPI聯(lián)合分析結(jié)果

蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組共同鑒定到78個蛋白，分別占蛋白質(zhì)組的4.4%，占磷酸化蛋白質(zhì)組的60.5%。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，再將得到的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.0進行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示（圖11），該網(wǎng)絡(luò)由56個節(jié)點和115條邊組成。在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)了細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、真核翻譯起始因子4 Gamma 1（EIF4G1）、小核核糖核蛋白U5亞基200（SNRNP200）、腫瘤蛋白p53結(jié)合蛋白1（TP53BP1）和通用轉(zhuǎn)錄因子IIF亞基1（TFIIF）5個關(guān)鍵蛋白（表3）。

2.12精子發(fā)生相關(guān)蛋白富集結(jié)果

利用精子發(fā)生在線1.0數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組共同鑒定到的78個蛋白，結(jié)果（表4）顯示，有17個蛋白在數(shù)據(jù)庫中被檢索到。

2.13數(shù)據(jù)驗證

為驗證蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性，選擇LMNA蛋白進行分析。Western blotting檢測結(jié)果（圖12-A）顯示，LMNA蛋白及其磷酸化形式LMNA（pS392）均被成功鑒定。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖12-B）顯示，LMNA主要分布于曲細精管基底膜附近，而LMNA（pS392）主要分布于曲細精管管腔附近。同一蛋白在不同亞細胞位置的分布差異，間接表明磷酸化修飾可能影響蛋白的功能和分布。

3討論

精子發(fā)生是一個復(fù)雜且嚴(yán)格調(diào)控的過程，涉及數(shù)千種蛋白的協(xié)調(diào)表達，以確保雄性配子的持續(xù)產(chǎn)生，而生精細胞是精子發(fā)生過程的主要參與者。本研究對生精細胞中的1785個蛋白和129個磷酸化蛋白進行了鑒定和生物信息學(xué)分析。在生精細胞蛋白質(zhì)組中，發(fā)現(xiàn)了10種高豐度蛋白，有4個蛋白屬于熱休克蛋白家族（HSPA2、HSP90AA1、HSP90B1和HSPA5），熱休克蛋白作為免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子，在免疫抑制和免疫刺激中發(fā)揮重要作用（Hristova，2012），提示精子發(fā)生可能通過大量熱休克蛋白對各種刺激做出反應(yīng)，以維持精子發(fā)生內(nèi)部環(huán)境的平衡。此外，4種高豐度蛋白屬于微管蛋白家族（TUBB4B、LOC100295712、TUBB5和TUBA1A），微管蛋白是微管的組成部分，微管是細胞分裂和遷移等細胞過程的基礎(chǔ)。微管動力學(xué)參與維持細胞形態(tài)和功能，并在生殖細胞有絲分裂和減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用（O’Donnell and O’Bryan，2014），這與精子發(fā)生需要持續(xù)的細胞分化相契合。

RNA剪接是蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組中富集最多的生物學(xué)過程。Zhang等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，雙酚A（BPA）對RNA剪接的阻斷會導(dǎo)致后代雄性小鼠睪丸發(fā)育不良；Song等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，睪丸發(fā)育受可變剪接的調(diào)控水平高于其他組織；Wu等（2022）研究表明，RNA剪接的調(diào)控是男性生育的必要條件，BUD31介導(dǎo)的精子干細胞內(nèi)的可變剪接可以調(diào)節(jié)哺乳動物雄性生殖細胞的自我更新和分化。提示RNA剪接在生精細胞中的存在是維持精子發(fā)生正常進行的必要條件。此外，在高豐度蛋白中發(fā)現(xiàn)了大量熱休克蛋白家族成員，而在生精細胞蛋白質(zhì)組PPI分析中同樣發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵蛋白HSPA8。Wang等（2019b）研究發(fā)現(xiàn)，急性熱應(yīng)激會上調(diào)雞睪丸中HSPA8蛋白的表達，提示HSPA8可在外界刺激下維持正常的精子發(fā)生。生精細胞磷酸化蛋白質(zhì)組KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，剪接體是主要的調(diào)控途徑。Wu等（2016）研究表明，剪接體缺陷會影響人類精原細胞的分化，并導(dǎo)致非梗阻性無精子癥；Alikhani等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，生精細胞匱乏的人類睪丸中參與剪接體的蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)。Kim等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，CDK7存在于減數(shù)分裂過程中，并在精母細胞中高度表達。本研究發(fā)現(xiàn)，CDK7調(diào)控的底物數(shù)量最多，活性最高，且CDK1處于PPI網(wǎng)絡(luò)中心，表明細胞周期依賴激酶在水牛生精細胞的分化過程中高度活躍。Liu等（2017）研究表明，SIRT1基因敲除小鼠對精子發(fā)生過程中生精細胞的早期有絲分裂和減數(shù)分裂無明顯影響，但在頂體發(fā)生過程存在缺陷，導(dǎo)致圓形精子不育的表型；Wang等（2018）對人類睪丸細胞的研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1在精原細胞基底層附近活躍，在其他生精細胞中逐漸下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，細胞衰老的正調(diào)控僅在磷酸化蛋白質(zhì)組中被富集，涉及的蛋白有HMGA1、SIRT1和LMNA，與Liu等（2017）、Wang等（2018）的研究結(jié)果相符。Alsheimer等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，LMNA基因敲除的小鼠在精子發(fā)生過程中出現(xiàn)障礙，具體表現(xiàn)為精母細胞中性染色體配對存在嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致青春期小鼠精母細胞大量凋亡；Shen等（2014）通過siRNA干擾技術(shù)降低了LMNA的表達，能增加小鼠精子頂體分裂，并顯著增加精子頭部和尾部的畸形率；Milbradt等（2016）研究表明，LMNA的第22和392位絲氨酸位點的磷酸化是有絲分裂過程中核纖層短暫解體的關(guān)鍵因素。在本研究中，LMNA及其磷酸化形式LMNA（pS392）在細胞中均有表達，表明磷酸化可能會改變蛋白在精子發(fā)生中的作用。

4結(jié)論

水牛睪丸生精細胞高表達熱休克蛋白可能與水牛適應(yīng)濕熱氣候有關(guān)，高表達微管蛋白可能與生精細胞在曲細精管內(nèi)的遷移密切相關(guān)。RNA剪接和磷酸化修飾可能通過影響蛋白的功能和分布來調(diào)控精子的發(fā)生過程。

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（責(zé)任編輯：蘭宗寶，張博）