N-乙酰半胱氨酸緩解小鼠代謝綜合征膀胱纖維化的分子機制

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2025.01.028

摘要：【目的】探究N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）緩解小鼠代謝綜合征膀胱纖維化的分子機制，為深入理解膀胱纖維化的病理學(xué)過程及開發(fā)新的治療策略提供理論參考?！痉椒ā窟x擇8周齡C57BL/6雄性小鼠和ob/ob（B6.V-Lepob/J）雄性小鼠（代謝綜合征模型），試驗持續(xù)20周，試驗結(jié)束后處死小鼠，采集膀胱組織。以C57BL/6雄性小鼠為對照組（Con），ob/ob（B6.V-Lepob/J）雄性小鼠為代謝綜合征模型組（ob/ob），利用Western blotting檢測小鼠膀胱組織中TGF-β1、SMAD、p38、p-ERK、p-JNK、α-SMA、3-Nitrotyrosine（NT）等蛋白相對表達量，采用免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠膀胱組織中NF-κB與TGF-β1表達情況及分布特點。分離小鼠膀胱平滑肌細胞（BSMCs），篩選葡萄糖濃度并繪制BSMCs生長曲線。設(shè)對照組（Con）、高糖組（HG）、高糖+NAC組（HG+NAC）和高滲組（HO），檢測CRP、IL-6、IL-1β、NLRP3、TGF-β1、BK-β1、SKCa3蛋白相對表達量。使用MCC950和PDTC抑制NLRP3和NF-κB信號通路，檢測ROCK1、NLRP3、NF-κB、TGF-β1蛋白相對表達量。【結(jié)果】與Con組相比，ob/ob組小鼠膀胱組織中NT、TGF-β1和α-SMA蛋白相對表達量顯著升高（Plt;0.05，下同），SMAD、p38、p-ERK和p-JNK蛋白相對表達量無顯著差異（Pgt;0.05，下同）。葡萄糖濃度篩選結(jié)果表明，45 mmol/L的葡萄糖為最佳干預(yù)濃度。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與Con組相比，HG組BSMCs中CRP、IL-6、TGF-β1、IL-1β和NLRP3蛋白相對表達量顯著升高，BK-β1和SKCa3蛋白相對表達量顯著降低。與HG組相比，HG+NAC組BSMCs中CRP、IL-6、TGF-β1、IL-1β和NLRP3蛋白相對表達量顯著降低，BK-β1和SKCa3蛋白相對表達量顯著升高。抑制NLRP3和NF-κB信號通路后，與HG組相比，HG+MCC950和HG+PTCD組BSMCs中TGF-β1蛋白相對表達量顯著降低，NF-κB蛋白相對表達量顯著升高，HG+MCC950組BSMCs中ROCK1和NLRP3蛋白相對表達量顯著降低，HG+PTCD組BSMCs中ROCK1和NLRP3蛋白相對表達量無顯著差異?！窘Y(jié)論】高糖因素誘發(fā)的小鼠膀胱功能損傷涉及氧化應(yīng)激—炎癥反應(yīng)—組織纖維化相關(guān)分子機制通路，NAC主要通過抑制ROS/NLRP3/NF-κB/TGF-β1信號通路阻斷功能損傷中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)展進程。與抗炎治療相比，NAC抗氧化治療對組織纖維化的治療效果可能更顯著。

關(guān)鍵詞：N-乙酰半胱氨酸；代謝綜合征；膀胱功能損害；氧化應(yīng)激；炎癥反應(yīng)

中圖分類號：S865.13文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）01-0314-10

Molecular mechanism of N-acetylcysteine alleviating bladder fibrosis in mice with metabolic syndrome

RENYa-lin1，2，SU Bo-yan2，HE Qi-qi2*

（1College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2Department of Urology，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou，Gansu 730030，China）

Abstract：【Objective】To explore the molecular mechanism by which N-acetylcysteine（NAC）alleviated bladder fi-brosis in metabolic syndrome mice，which could provide theoretical reference for a deeper understanding of the pathologi-cal process of bladder fibrosis and the development of new treatment strategies.【Method】C57BL/6 male mice and ob/ob（B6.V-Lepob/J）male mice（metabolic syndrome model）at 8 weeks of age were selected.The experiment lasted for 20 weeks.After the end of the experiment，the mice were killed and the bladder tissues were collected.C57BL/6 male mice were used as the control group（Con），and ob/ob（B6.V-Lepob/J）male mice were used as the metabolic syndrome model group（ob/ob）.The relative expression levelsofTGF-β1，SMAD，p38，p-ERK，p-JNK，α-SMA，3-Nitrotyrosine（NT）and other proteins in the bladder tissues of mice were detected by Western blotting.Immunohistochemical staining was used to detect the expression and distribution characteristics of NF-κB and TGF-β1 in the bladder tissues of mice.Mouse bladder smooth muscle cells（BSMCs）were isolated，the glucose concentration was screened and the growth curve of BSMCs was drawn.The control group（Con），high glucose group（HG），high glucose+NAC group（HG+NAC）and hyperos-motic group（HO）were set up to detect the relative expression levels of CRP，IL-6，IL-1β，NLRP3，TGF-β1，BK-β1 and SKCa3 proteins.MCC950 and PDTC were used to inhibit the NLRP3 and NF-κB signaling pathways，and the relative ex-pression levels of ROCK1，NLRP3，NF-κB and TGF-β1 proteins were detected.【Result】Compared with the Con group，the relative expression of NT，TGF-β1 andα-SMA proteins in the bladder tissue of the ob/ob group mice was signifi-cantly increased（rlt;0.05，the same below），and there was no significant difference in the relative expression of SMAD，p38，p-ERK and p-JNK proteins（rgt;0.05，the same below）.The results of glucose concentration screening showed that 45 mmol/L glucose was the optimal intervention concentration.Western blotting results showed that compared with the Con group，the relative expression of CRP，IL-6，TGF-β1，IL-1βand NLRP3 proteins in BSMCs of the HG group was signifi-cantly increased，and the relative expression of BK-β1 and SKCa3 proteins was significantly decreased.Compared with the HG group，the relative expression of CRP，IL-6，TGF-β1，IL-1βand NLRP3 proteins in BSMCs of the HG+NAC group was significantly decreased，and the relative expression of BK-β1 and SKCa3 proteins was significantly increased.After in-hibiting the NLRP3 and NF-κB signaling pathways，compared with the HG group，the relative expression of TGF-β1 pro-tein in BSMCs of HG+MCC950 and HG+PTCD groups was significantly decreased，and the relative expression of NF-κB protein was significantly increased；the relative expression of ROCK1 and NLRP3 proteins in BSMCs of HG+MCC950 group was significantly decreased，and there was no significant difference in the relative expression of ROCK1 and NLRP3 proteins in BSMCs of HG+PTCD group.【Conclusion】High glucose-induced bladder function damage in mice involves molecular mechanism pathways related to oxidative stress-inflammatory response-tissue fibrosis.NAC mainly blocks the development of oxidative stress，inflammatory response and fibrosis in functional damage by inhibiting the ROS/NLRP3/NF-κB/TGF-β1 signaling pathway.Compared with anti-inflammatory treatment，NAC antioxidant treat-ment may have a more significant therapeutic effect on tissue fibrosis.

Key words：N-acetylcysteine；metabolic syndrome；bladder function damage；oxidative stress；inflammatory re- sponse

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（81800671，82360156）；Gansu Health Care In-dustry Research Management Project（GSWSKY2021-070）；Lanzhou University Cuiying Talent Top Project（CY2021-MS-A02）

0引言

【研究意義】近年來，肥胖問題在全球范圍內(nèi)日益嚴峻，尤其是在人類和動物群體中，肥胖發(fā)生率逐年上升。Courcier等（2010）、Cave等（2012）研究表明，約63%的貓和59%的狗存在超重或肥胖問題。肥胖所引發(fā)的代謝綜合征（Metabolic syndrome，MS）已被證實與下尿路疾病密切相關(guān)，如膀胱出口梗阻、膀胱過度活動癥及尿潴溜等，并能導(dǎo)致MS型膀胱功能損傷（Metabolic syndrome bladder dysfunc-tion，MBD）（Lee et al.，2008；Zhang et al.，2018；Fu et al.，2024）。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種廣泛應(yīng)用的抗氧化劑和抗炎劑，是內(nèi)源性氨基酸L-半胱氨酸的衍生物，也是三肽谷胱甘肽（GSH）的前體物質(zhì)（王海云等，2023）。Samuni等（2013）研究表明，NAC不僅能調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，還能影響多種疾病的病理進程，包括線粒體功能障礙、細胞凋亡及炎癥反應(yīng)等。探究NAC緩解小鼠代謝綜合征膀胱纖維化的潛在分子機制，對深入理解膀胱纖維化的病理學(xué)過程及開發(fā)新的治療策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Tanaka等（2005）對糖脂代謝的研究表明，貓肝臟中葡萄糖激酶的活性缺乏，且糖異生速率的限制酶活性顯著高于犬，使得貓更易形成肥胖，并發(fā)生胰島素抵抗，最終發(fā)展為MS；Tvarijonaviciute等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，約20%的超重或肥胖犬存在代謝紊亂，且符合MS的診斷標準。肥胖相關(guān)的代謝綜合征是動物泌尿系統(tǒng)疾病的重要危險因素。Lekcharoensuk等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，肥胖引起的代謝綜合征還會增加犬只罹患尿道括約肌功能不全、草酸鈣結(jié)石癥及膀胱移行細胞癌等疾病的風(fēng)險；Henegar等（2001）研究表明，肥胖癥與犬類腎臟組織學(xué)變化密切相關(guān)，表現(xiàn)為腎小囊、系膜基質(zhì)、腎小球和腎小管基底膜的增厚，及腎小球的分裂細胞數(shù)增加；He等（2016）對B6.V-Lepob/J小鼠肥胖模型的研究表明，肥胖引發(fā)的代謝綜合征會導(dǎo)致排尿功能障礙，且ob/ob小鼠和高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠均是研究MS相關(guān)疾病的理想動物模型；章文靜等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征動物模型表現(xiàn)出高水平的逼尿肌細胞凋亡及膀胱逼尿肌肥厚，同時膀胱壁M2、M3型毒蕈堿受體的表達也顯著上調(diào)；Rodríguez等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，肥胖的伊比利亞母豬表現(xiàn)出腎小球腫大、系膜擴張、結(jié)節(jié)性腎小球硬化及脂質(zhì)沉積等病理特征。NAC能通過清除活性氧（Reactive oxygen species，ROS）來調(diào)節(jié)氧化還原平衡，在多種疾病模型中展現(xiàn)出顯著的抗氧化與抗炎作用（雷少青等，2018；Yang et al.，2019；Yuan et al.，2019；楊欣榮等，2020；Li etal.，2022）。氧化應(yīng)激涉及自由基積累與抗氧化防御系統(tǒng)失衡，是多種病理過程的核心驅(qū)動因素。雷少青等（2018）研究表明，NAC可通過直接中和ROS、增強GSH合成酶活性及恢復(fù)線粒體功能等途徑有效減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的組織損傷，在2型糖尿病模型中，NAC顯著降低了肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平，并抑制了FoxO1信號通路過度活化，進而改善了代謝紊亂引起的器官損傷。在泌尿系統(tǒng)疾病領(lǐng)域，氧化應(yīng)激與膀胱過度活動癥的發(fā)病機制密切相關(guān)。唐陽國等（2022）研究表明，MS型SD大鼠膀胱平滑肌含量減少，黏膜下炎癥細胞增多，并伴有較多的粗大纖維條索，使用NAC治療后，病理變化有所緩解；武冠宇等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，膀胱組織中ROS的異常積累可導(dǎo)致尿路上皮敏感性增強與逼尿肌功能失調(diào)，表明NAC可能通過抑制炎癥因子的釋放及調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路來發(fā)揮抗氧化作用?！颈狙芯壳腥朦c】NAC能有效緩解高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠膀胱纖維化（He et al.，2016），但其具體分子機制尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用Western blotting、免疫組織化學(xué)染色等方法，解析NAC抑制代謝綜合征膀胱纖維化進程的分子機制，闡明抗氧化治療與經(jīng)典抗炎信號通路間的交叉對話機制，為開發(fā)基于多靶點協(xié)同干預(yù)的MBD精準治療策略提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物供試20只SPF級6周齡C57BL/6雄性小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，20只瘦素缺陷型ob/ob（B6.VLepob/J）雄性小鼠（代謝綜合征模型）購自鼠來寶（武漢）生物科技有限公司。動物試驗由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準，批準號2021A-006。

1.1.2細胞株來源小鼠膀胱平滑肌細胞（BSMCs）由C57BL/6雄性小鼠膀胱組織分離獲得。取5只雄性小鼠，經(jīng)安樂死后，通過腹部正中切口切取膀胱組織；膀胱組織在生理鹽水和PBS中反復(fù)洗滌，去除黏膜、黏膜下層及漿膜層，剪成肉糜，使用II型膠原酶消化1 h；消化后的組織通過細胞篩網(wǎng)過濾并離心，接種于含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗的DMEM細胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)48 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，直至細胞鋪板并進行傳代。

1.1.3主要儀器設(shè)備及試劑主要儀器設(shè)備：熒光顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）、渦旋振蕩器（武漢賽維爾生物科技有限公司）、實時熒光定量PCR儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司）、超微量分光光度計［鼎昊源（天津）生物科技有限公司］、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置（北京六一生物科技有限公司）、化學(xué)發(fā)光儀（上海天能生命科學(xué)有限公司）、酶標儀［帝肯（上海）實驗器材有限公司］、脫水機（濟南丹吉爾電子有限公司）、包埋機和冷凍臺（武漢俊杰電子有限公司）、病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）、掃描儀（山東斯瑞締醫(yī)療科技有限公司）。供試試劑：高脂飼料（蛋白20%，碳水化合物20%，脂肪60%）和常規(guī)飼料（蛋白20%，碳水化合物76%，脂肪4%）（沈陽茂華生物科技有限公司）、葡萄糖和NAC（合肥凱米克生化科技有限公司）、D-甘露醇（大連美侖生物技術(shù)有限公司）、抗熒光淬滅劑和DAPI（武漢賽維爾生物科技有限公司）、IL-6抗體、TGF-β抗體和TGF-β1抗體［賽信通（上海）生物試劑有限公司］、BK-β1抗體、p-ERK抗體和p-JNK抗體［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］、SKCa3抗體（亞諾法生技股份有限公司）、NF-κB抗體、IL-1β抗體、GAPDH抗體、β-Actin抗體和ROCK1抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、MCC950和PDTC（上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2動物飼養(yǎng)

實驗小鼠飼養(yǎng)在溫度（23±2）℃、濕度（50±10）%、12 h光照/12 h黑暗交替的動物房內(nèi)2周，自由采食，以適應(yīng)環(huán)境。選擇8周齡C57BL/6雄性小鼠和ob/ob（B6.V-Lepob/J）雄性小鼠，試驗持續(xù)20周，試驗結(jié)束后處死小鼠，采集膀胱組織。

1.3免疫組織化學(xué)染色

C57BL/6雄性小鼠為對照組（Con），ob/ob（B6.V-Lepob/J）雄性小鼠為代謝綜合征模型組（ob/ob）。小鼠膀胱組織在4%多聚甲醛中固定，隨后進行脫水、石蠟包埋、切片和抗原修復(fù)處理。切片完成后，使用3%BSA封閉30min，加入一抗在4℃下孵育過夜。使用PBS洗滌3次，每次5min，加入二抗，在避光條件下孵育50min。使用DAPI復(fù)染細胞核，滴加抗熒光淬滅劑封片。

1.4葡萄糖濃度篩選

BSMCs在37℃培養(yǎng)箱中于含10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以正常培養(yǎng)的BSMCs為對照（Con），在0、25、50和100 mmol/L葡萄糖中培養(yǎng)7 d進行初步篩選，隨后在25～50 mmol/L間增設(shè)35、40和45 mmol/L濃度，進一步篩選。使用超微量分光光度計檢測OD450 nm，繪制細胞生長曲線，確定最佳干預(yù)濃度。

1.5試驗分組

在確定葡萄糖最佳干預(yù)濃度后，試驗設(shè)對照組（Con）、高糖組（HG）、高糖+NAC組（HG+NAC）和高滲組（HO），分別于DMEM細胞培養(yǎng)基、45 mmol/L葡萄糖、45 mmol/L葡萄糖和5 mmol/L NAC、50 mmol/L甘露醇中培養(yǎng)48 h。為進一步探究NAC干預(yù)對細胞纖維化的作用機制，使用0.01μmol/L MCC950和0.01μmol/L PDTC處理細胞，試驗設(shè)對照組（Con）、高糖組（HG）、高糖+MCC950組（HG+MCC950）、高糖+PDTC組（HG+PDTC）和高滲組（HO）。

1.6 Western blotting檢測

向組織和細胞樣品加入蛋白裂解液，按照試劑盒說明提取蛋白。取100μL上清液，在4°C下12000 r/min離心10 min，通過BCA法測定蛋白濃度；蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分析后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉1.5 h；PVDF膜與一抗在4℃下孵育過夜；使用1×TBST洗膜3次，每次5min；加入二抗置于搖床中室溫孵育2～3 h；使用1×TBST洗膜3次，每次10 min；加入適量ELC發(fā)光顯影液，在凝膠顯影儀下曝光觀察。

1.7統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及制圖。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠膀胱組織中炎癥因子、氧化應(yīng)激與重構(gòu)因子相關(guān)蛋白相對表達量

收集C57BL/6雄性小鼠和ob/ob（B6.V-Lepob/J）雄性小鼠膀胱組織，進行Western blotting檢測。結(jié)果如圖1-A所示，ob/ob組小鼠膀胱組織中3-Nitroty‐rosine（NT）、TGF-β1及α-SMA蛋白相對表達量顯著高于Con組（rlt;0.05，下同），提示ob/ob組小鼠膀胱存在明顯的氧化應(yīng)激及纖維化現(xiàn)象。對膀胱組織中多個炎癥標志物進行Western blotting檢測，以明確氧化應(yīng)激與纖維化的炎癥通路。結(jié)果（圖1-B）顯示，與Con組相比，ob/ob組小鼠膀胱組織中SMAD、p38、p-ERK和p-JNK蛋白相對表達量無顯著差異（rgt;0.05，下同），提示TGF-β1和α-SMA蛋白的激活由其他信號通路介導(dǎo)。

2.2小鼠膀胱組織中NF-κB和TGF-β1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖2）顯示，Con組小鼠膀胱組織中NF-κB和TGF-β1的熒光信號較分散且強度較低，ob/ob組小鼠膀胱組織中NF-κB與TGF-β1的熒光信號較集中且強度較高，此外，還在小鼠膀胱組織觀察到大量細胞碎片，表明細胞發(fā)生損傷甚至凋亡。提示高糖環(huán)境中NF-κB和TGF-β1在膀胱組織中的活化程度更高。

2.3葡萄糖濃度篩選結(jié)果

在篩選高糖培養(yǎng)條件時，發(fā)現(xiàn)25 mmol/L葡萄糖能明顯促進BSMCs生長（圖3），通過進一步篩選葡萄糖濃度，最終確定45 mmol/L為最佳干預(yù)濃度，細胞生長曲線如圖4所示，與Con組相比，45 mmol/L的葡萄糖組BSMCs OD450 nm在第4 d顯著升高，第5～7 d極顯著升高（rlt;0.01）。

2.4 NAC對BSMCs中炎癥因子、重構(gòu)因子與鉀離子通道相關(guān)蛋白相對表達量的影響

Western blotting檢測結(jié)果（圖5）顯示，與Con組相比，HG組BSMCs中CRP、IL-6、TGF-β1、IL-1β和NLRP3蛋白相對表達量顯著升高，鉀離子通道蛋白BK-β1和SKCa3相對表達量顯著降低；與HG組相比，HG+NAC組BSMCs中CRP、IL-6、TGF-β1、IL-1β和NLRP3蛋白相對表達量顯著降低，BK-β1和SKCa3蛋白相對表達量顯著升高。上述結(jié)果表明，高糖環(huán)境下BSMCs中炎癥因子及重構(gòu)因子蛋白相對表達量升高，誘導(dǎo)細胞纖維化加劇，同時細胞內(nèi)鉀離子通道功能受到抑制，NAC則降低了高糖環(huán)境下BSMCs中炎癥因子及重構(gòu)因子蛋白相對表達量，緩解了高糖環(huán)境造成的BSMCs鉀離子通道功能抑制。

2.5抑制NLRP3和NF-κB信號通路對BSMCs中重構(gòu)因子、炎癥因子與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白相對表達量的影響

結(jié)果（圖6）顯示，與HG組相比，HG+MCC950和HG+PTCD組BSMCs中TGF-β1蛋白相對表達量顯著降低，提示NLRP3和NF-κB信號通路在高糖誘導(dǎo)的TGF-β1活化過程中發(fā)揮了重要作用，NF-κB蛋白相對表達量顯著升高，HG+MCC950組BSMCs中ROCK1和NLRP3蛋白相對表達量顯著降低，HG+PTCD組BSMCs中ROCK1和NLRP3蛋白相對表達量無顯著差異。提示MBD的發(fā)展為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和纖維化表現(xiàn)，且與抗氧化治療相比，抗炎治療對纖維化抑制的效果較為有限。

3討論

MBD與糖尿病膀胱的病理過程具有相似性，高血糖引起的氧化應(yīng)激所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，能導(dǎo)致膀胱環(huán)形肌出現(xiàn)纖維化及神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂，進而改變膀胱的收縮頻率與力量，最終發(fā)展為糖尿病并引發(fā)尿潴留和尿毒癥。唐陽國等（2022）研究表明，高脂飼料飼喂的大鼠膀胱組織抗氧化能力降低，且發(fā)生組織纖維化，而NAC治療能有效緩解MBD的癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，NAC的干預(yù)有效緩解了MBD的氧化應(yīng)激，抑制了膀胱纖維化，但具體的分子機制尚未明確。ob/ob組小鼠膀胱組織中NT蛋白相對表達量顯著高于Con組，提示ob/ob組小鼠膀胱組織氧化應(yīng)激水平升高。此外，ob/ob組小鼠膀胱組織中TGF-β1和α-SMA蛋白相對表達量顯著高于Con組，表明其膀胱組織纖維化加劇。研究表明，低濃度的ROS可調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管張力等生理過程，而高濃度的ROS則會誘導(dǎo)細胞凋亡并造成組織損傷（Birder，2020），進而導(dǎo)致TGF-β1過度激活，促進細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積，成纖維細胞過度增殖和分化，最終加劇膠原沉積和纖維增生（Yan et al.，2018）。

在MBD的病理過程中，氧化應(yīng)激與纖維化的發(fā)生可能是通過炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的。高糖和肥胖等因素引發(fā)的胰島素抵抗會導(dǎo)致慢性氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS，而過量的ROS會導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和DNA發(fā)生氧化損傷，進而影響細胞生存（Rich‐ter et al.，1988；Cadenas and Davies，2000；Pacher et al.，2007）。與核DNA相比，線粒體DNA（mtDNA）更易受到ROS的影響（Herrero and Barja，2001），mtDNA損傷不僅引發(fā)炎癥反應(yīng)，還會導(dǎo)致線粒體形態(tài)改變與功能損傷（Krysko et al.，2011；Chen et al.，2018），進一步產(chǎn)生線粒體活性氧（mtROS），加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，ROS能增強T淋巴細胞活化，誘導(dǎo)白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附與趨化，進而滲透到炎癥反應(yīng)區(qū)域（Dr?ge，2002；Valko et al.，2007）。此外，脂質(zhì)過氧化物可間接激活2型環(huán)氧合酶（COX-2），從而激活巨噬細胞的炎癥潛能（Kumagai et al.，2004）。研究表明，MS患者機體存在與炎癥相關(guān)性較高的組織重塑過程，肥胖癥患者機體普遍處于慢性低級炎癥狀態(tài)，體內(nèi)炎癥因子CRP、TNF-α、IL-6、IL-1β水平普遍高出正常范圍（陳曉可等，2024）。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于Con組，HG組BSMCs中CRP、IL-6、TGF-β1、IL-1β、NLRP3蛋白相對表達量顯著升高，提示細胞炎癥反應(yīng)加劇。IL-6不僅參與免疫與炎癥反應(yīng)，還能通過誘導(dǎo)趨化因子和黏附因子激活巨噬細胞等炎癥細胞發(fā)生分化與遷移，促進組織重塑（王信光等，2024）。NAC干預(yù)后，BSMCs中CRP、IL-6、TGF-β1、IL-1β、NLRP3蛋白相對表達量顯著降低，表明NAC抑制了小鼠膀胱組織炎癥反應(yīng)和纖維化。NAC是一種經(jīng)典的天然抗氧化劑，乙酰化合物的結(jié)構(gòu)特點使其具有明顯的還原性，分子內(nèi)游離的巰基能清除機體內(nèi)的自由基，此外，NAC進入細胞后其含有的半胱氨酸能通過消除自由基減少氧化損

傷并促進GSH合成，而GSH能直接清除OH-和O-，進而增強機體抗氧化能力（Tenório et al.，2021）。NAC的巰基在清除自由基的同時，還能減輕DNA損傷，調(diào)整信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達，抵抗細胞凋亡（Kumar etal.，2021）。本研究中，ob/ob組小鼠膀胱組織中p38、p-ERK與p-JNK蛋白相對表達量與Con組差異不顯著，提示活化TGF-β1及誘導(dǎo)α-SMA介導(dǎo)的組織再生可能由其他信號通路完成。

本研究發(fā)現(xiàn)，HG組BSMCs中NLRP3異常升高，推測NLRP3可能是抑制膀胱纖維化的重要干預(yù)因子。NLRP3在動脈粥樣硬化、糖尿病、肝纖維化、肺纖維化及各種急性、慢性腎臟疾病中廣泛存在，并通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與線粒體自噬與凋亡（Shahzad et al.，2015；Gong et al.，2016；Ludwig-Portugall et al.，2016）。NLRP3能促使IL-1β和IL-18的分泌，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)（姜昊瑋和吳照球，2022）。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3激活可能受到線粒體損傷、mtROS刺激、K+外流與溶酶體損傷釋放組織蛋白酶等因素的影響（Santoro et al.，1992；Unger et al.，1992；齊士勇和徐勇，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，HG組BSMCs離子通道蛋白BK-β1和SKCa3相對表達量顯著降低，與HG組相比，HG+NAC組BSMCs中BK-β1和SKCa3蛋白相對表達量顯著升高，提示NLRP3可能參與了MBD的病理發(fā)展進程。研究表明，給予高脂飲食的NLRP3缺陷小鼠對胰島素高度敏感（Zhou et al.，2010）；NLRP3在大鼠膀胱中定位于尿路上皮（Hughes et al.，2015），能誘導(dǎo)膀胱出口梗阻、出血性膀胱炎及糖尿病并發(fā)癥等膀胱病理性疾病發(fā)生（Hughes et al.，2014，2016）；缺乏NLRP3的糖尿病小鼠不會出現(xiàn)糖尿病性膀胱功能障礙，NLRP3的缺失不僅不影響血糖水平，還能消除炎癥癥狀（Hughes et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，HG組BSMCs中NLRP3和IL-1β蛋白相對表達量顯著升高，與HG組相比，HG+NAC組BSMCs中NLRP3和IL-1β蛋白相對表達量顯著降低。研究表明，在NF-κB激活信號下，NLRP3能與ASC、caspase-1組裝形成NLRP3炎癥小體，而NLRP3炎癥小體可釋放caspase-1，并分泌IL-1β、IL-18和Gasdermin D等細胞因子，進而激活細胞焦亡（孫瑋等，2024；陶懷祥等，2024）。此外，低濃度的過氧化氫能激活NF-κB以調(diào)節(jié)促炎細胞因子水平，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)并激活NADPH氧化酶，刺激并增加ROS的產(chǎn)生，最終加重氧化應(yīng)激反應(yīng)（Prieto et al.，2014）。NF-κB參與許多炎癥性疾病的發(fā)生，是TLR4信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄激活因子，能激活大量炎癥細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達，是調(diào)控炎癥反應(yīng)進程的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)信號（Luo et al.，2022）。NAC能通過清除ROS而抑制NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而減少炎癥因子的表達并抑制NLRP3炎癥小體的形成，最終減輕炎癥反應(yīng)。

Ruiz-Ortega等（2020）研究表明，NF-κB/TGF-β1信號通路在有關(guān)纖維化的疾病進展過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，ob/ob組小鼠膀胱組織中大量細胞發(fā)生損傷，可觀察到許多細胞碎片，NF-κB與TGF-β1分布不均，集中在細胞核周圍，提示ob/ob組小鼠膀胱組織可能發(fā)生NLRP3/NF-κB信號通路引發(fā)的細胞焦亡。抑制NLRP3和NF-κB信號通路后，與HG組相比，HG+MCC950和HG+PDTC組BSMCs中TGF-β1蛋白相對表達量顯著降低，表明抑制NF-κB和NLRP3信號通路有利于減輕纖維化，而介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的ROCK1蛋白相對表達量受NF-κB抑制的影響較小，且與HG組相比，HG+NAC組BSMCs中TGF-β1、IL-1β和NLRP3蛋白相對表達量顯著降低，進一步證實了NLRP3/NF-κB信號通路是ROS的下游產(chǎn)物，三者共同介導(dǎo)纖維化的發(fā)生。此外，相較于通過NLRP3/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)，NAC的抗氧化治療可能更有利于MBD轉(zhuǎn)歸。

4結(jié)論

高糖因素誘發(fā)的小鼠膀胱功能損傷涉及氧化應(yīng)激—炎癥反應(yīng)—組織纖維化相關(guān)分子機制通路，NAC主要通過抑制ROS/NLRP3/NF-κB/TGF-β1信號通路阻斷功能損傷中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)展進程。與抗炎治療相比，NAC抗氧化治療對組織纖維化的治療效果可能更顯著。

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（責(zé)任編輯：蘭宗寶，張博）