莧色藜葉綠體基因組的解析與系統(tǒng)發(fā)育分析

摘要：本研究對莧色藜（Chenopodium amaranticolor）的葉綠體基因組進(jìn)行了高通量測序、組裝和注釋分析，比較了藜屬植物葉綠體基因組的特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)莧色藜葉綠體基因組長152 193 bp，GC含量37.25%，編碼131個(gè)基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因86個(gè)，偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子。共線性和滑動(dòng)窗口分析藜屬植物葉綠體基因組具有較高序列相似性，核苷酸多態(tài)性主要在LSC和SSC區(qū)的基因間隔區(qū)以及ndhF和ycf1基因內(nèi)部；SSR以單堿基重復(fù)為主，主要組成堿基為A、T；散在重復(fù)序列主要為正向重復(fù)和回文重復(fù)；系統(tǒng)發(fā)育分析莧色藜與臺灣藜（Chenopodium formosanum）的親緣關(guān)系較近；計(jì)算基于核基因的莧色藜與藜麥（Chenopodium quinoa）的遺傳距離大于葉綠體基因。本研究可為藜屬植物遺傳結(jié)構(gòu)與多樣性、特異基因挖掘以及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供參考。

關(guān)鍵詞：莧色藜；葉綠體基因組；高通量測序；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號：Q949.4 """""""文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A """""""文章編號：1007-0435（2025）03-0739-09

Chloroplast Genome Characteristics and Phylogenetic Analysis of Chenopodium amaranticolor

KONG Wei-qing，"ZHUO Su，"YANG Jin-hong^*

（School of Modern Agriculture amp; Biotechnology/Shaanxi key laboratory of sericulture，"Ankang University，"Ankang，"Shaanxi Province 725000，"China）

Abstract：This study conducted high-throughput sequencing，"assembly，"and annotation analysis of the chloroplast genome of Chenopodium amaranticolor. The analysis of features and phylogeny of Chenopodium"chloroplast genome discovered that the chloroplast genome of C. amaranticolor"was 152 193 bp in size with GC content of 37.25%，"encoding a total of 131 genes，"and 86 of them were protein coding genes，"which preferred using codons ending in A/U. The collinearity and sliding window analysis showed that the chloroplast genomes of Chenopodium"genus plants exhibited high sequence similarity，"and the nucleotide polymorphism sites were mainly found in the intergenic regions of LSC and SSC regions，"as well as within the ndhF"and ycf1"genes. The SSRs type in Chenopodium"plants chloroplast genomes were mainly single nucleotide repeats，"and the main component base were A/T. The types of repetitive sequences were mostly forward repeats and palindrome repeats. The phylogenetic analysis showed that C. amaranticolor"was closely related to C. formosanum. The genetic distance between C. amaranticolor"and C. quinoa"based on the nuclear genes is greater than that of chloroplast genes. The results of this study could provide references for further study on genetic structure and diversity，"specific gene mining，"and phylogenetic studies of C."spp.

Key words：Chenopodium amaranticolor；chloroplast genome；High-throughput sequencing；Phylogeny

藜屬（Chenopodium）植物為一年生草本植物，全世界約有250種。藜屬植物富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，籽?？捎米骷Z食，其中藜麥（C.quinoa）曾被南美洲土著居民作為主糧，且目前仍被作為一種全營養(yǎng)食物在全世界范圍內(nèi)種植^［1］。藜屬植物具有良好的抗逆性^［2］，是主要的田間雜草^［3-4］，如尖頭葉藜（C. acuminatum）、藜（C. album）、小藜（C. ficifolium）、麻籽藜（C. berlandieri），或作為飼用資源開發(fā)利用^［5-6］。莧色藜（Chenopodium amaranticolor）是藜屬植物中分布較少的一個(gè)種，其天然紅色素具有一定的穩(wěn)定性，是化工和食品原料，在部分地區(qū)也作為蔬菜食用和觀賞^［7］。莧色藜還具有廣譜的病毒抗性，是植物病毒學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的一種枯斑寄主指示植物，能夠繁殖雙生病毒科、豇豆花葉病毒科、桿狀病毒科等多種植物病毒^［8］。

葉綠體具有獨(dú)立于細(xì)胞核的基因組，可翻譯合成自身的蛋白質(zhì)，是一種半自主細(xì)胞器。葉綠體基因組通常為120 000～170 000 bp的環(huán)狀DNA分子，自1986年煙草^［9］和地錢^［10］的葉綠體DNA被測序以來，大量植物和藻類的葉綠體DNA被測序分析，其結(jié)構(gòu)具有較高的保守性，一般由大單拷貝區(qū)域（Large single-copy，LSC），小單拷貝區(qū)域（Small single-copy，SSC），以及兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)域（Inverted repeat a/b，IR a/b）等4個(gè)區(qū)域構(gòu)成，廣泛應(yīng)用于植物物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和物種起源的研究^［11］。截止2024年6月，NCBI公布的藜屬植物葉綠體基因組有藜、藜麥、臺灣藜（C. formosanum）、麻籽藜、尖頭葉藜、菱葉藜（Chenopodium bryoniaefolium）、小藜、蒼白莖藜（Chenopodium pallidicaule）、瑞典藜（Chenopodium suecicum）和Chenopodium petiolare在內(nèi)的10個(gè)物種。而莧色藜作為基礎(chǔ)性研究中廣泛應(yīng)用的種質(zhì)資源，其在系統(tǒng)發(fā)育中的位置及其與近緣物種的關(guān)系尚不明晰。

為從葉綠體基因組角度探究以上問題，本研究對莧色藜進(jìn)行了二代測序，組裝分析其葉綠體基因組及特征，并比較分析了藜屬植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)、GC含量、基因組成、重復(fù)序列、葉綠體基因組序列變異，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，為進(jìn)一步研究藜屬植物的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及親緣性等奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)使用莧色藜材料保存于安康學(xué)院陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。葉片經(jīng)純水清洗擦干后用錫紙包裹放入液氮速凍，之后于-80℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莧色藜基因組DNA提取與高通量測序 使用植物基因組DNA提取試劑盒（DP305，TIANGEN公司，北京）提取莧色藜總DNA，瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測DNA的質(zhì)量。合格樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行建庫和MGISEQ-200RS高通量測序平臺雙向150 bp測序。

1.2.2 葉綠體基因組組裝和注釋 fastp軟件對測定獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾^［12］，得到去除了接頭和低質(zhì)量的干凈數(shù)據(jù)。以NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載的藜屬植物葉綠體基因組NC序列做參考（表1），bowtie2軟件very-sensitive模式篩選干凈數(shù)據(jù)^［13］，spade3.15和GeSeq對篩選所得序列進(jìn)行組裝和注釋^［14-15］，運(yùn)用細(xì)胞器基因組繪圖軟件OGDRAW繪制物理圖譜^［16］，同時(shí)提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，登錄號PP727303。

1.2.3 葉綠體基因組特征分析 MegaX軟件統(tǒng)計(jì)藜屬植物葉綠體基因組密碼子的數(shù)量、使用頻率及相對同義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）^［17］，MISA軟件分析其中的簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）位點(diǎn)^［18］，設(shè)置單堿基至六堿基的最少重復(fù)性數(shù)目為10，5，4，3，3，3，兩個(gè)SSR之間的距離≥100 bp。使用在線REPuter（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）分析其中的散在重復(fù)序列。

1.2.4 共線性與多態(tài)性分析 Mauve軟件比對藜屬植物葉綠體基因組的GB注釋文件并分析其共線性^［19］，mafft進(jìn)行全基因組序列比對^［20］，DnaSP6軟件進(jìn)行序列多態(tài)性Pi滑動(dòng)窗口比較分析^［21］，設(shè)置窗口長度600 bp，步長200 bp。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 下載灰綠藜（Oxybasis glauca）的葉綠體基因組序列做外群，分析藜屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。mafft比對灰綠藜和藜屬植物葉綠體基因組^［20］，modeltest獲得最佳堿基替換模型為GTR+I+G4^［22］，使用該模型和Raxml-ng構(gòu)建最大似然（ML）進(jìn)化樹^［23］，同時(shí)使用MrBayes構(gòu)建BI系統(tǒng)發(fā)育樹^［24］。Bootstrap法檢驗(yàn)各分支的支持率，重復(fù)1000次。

1.2.6 莧色藜與藜麥單拷貝核基因和葉綠體基因的遺傳距離分析 單拷貝核基因是一種分子系統(tǒng)學(xué)研究的分子標(biāo)記，在生命樹的主干及主干和末梢之間分枝構(gòu)建中非常有價(jià)值。以藜麥的單拷貝核基因集（https：//treeoflife.kew.org/）作參考，easy353組裝莧色藜的單拷貝核基因，參數(shù)設(shè)置最低8×覆蓋度^［25］，mafft對莧色藜與藜麥的同源單拷貝核基因進(jìn)行兩兩比對。同時(shí)從genebank文件中提取CDS序列，mafft對二者的同源序列進(jìn)行兩兩比對?；贘C69模型，分別計(jì)算2個(gè)物種單拷貝核基因和葉綠體基因的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

高通量測序共獲得莧色藜基因組原始數(shù)據(jù)16 788 751條，質(zhì)控去除接頭和低質(zhì)量序列后，得到干凈數(shù)據(jù)約4.82G，16 762 445條。以葉綠體基因組NC序列為參考進(jìn)行篩選，得到莧色藜的潛在葉綠體基因組來源序列1 180 783條，組裝覆蓋度1 104.71×，所得莧色藜葉綠體基因組長152 193 bp，GC含量37.25%，與其他藜屬植物葉綠體基因組151 293（蒼白莖藜）～152 195 bp（臺灣藜）、GC含量37.24%～37.30%相符（圖1，表1）。11個(gè)藜屬植物的葉綠體基因組均為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)，LSC長度在82 948～83 704 bp，GC含量35.28%～35.32%，SSC和IR的長度分別為17 937～18 132 bp和25 109～25 218 bp，GC含量30.92%～31.13%和42.72%～42.76%。莧色藜葉綠體基因組及四分體的長度和GC含量均與臺灣藜和麻籽藜比較接近。

2.2 莧色藜葉綠體基因組的注釋及功能分類

分析莧色藜葉綠體基因組的編碼基因，共編碼131個(gè)基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因（Protein-coding genes，PCGs）86個(gè)，核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA）8個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Transfer RNA，tRNA）37個(gè)（表2），與其他藜屬植物一致。18個(gè)基因有2個(gè)拷貝，包括7個(gè)PCGs（rpl2、rpl23、rps7、rps12、ndhB、ycf1和ycf2），7個(gè)tRNA（trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG和trnV-GAC），以及4個(gè)rRNA（rrn16S、rrn23S、rrn4.5S和rrn5S），其他基因?yàn)閱慰截?。莧色藜葉綠體基因組的大部分基因沒有內(nèi)含子，除了8個(gè)PCGs（atpF、petB、petD、ndhA、ndhB、rpl16、rps16和rpoC1）和6個(gè)tRNA（trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA和trnV-UAC）有1個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)PCGs（ycf3、clpP和rps12）有2個(gè)內(nèi)含子。matK基因位于trnK-UUU的內(nèi)含子中。rps12基因?yàn)榉词郊艚踊颍?′端和重復(fù)3′端分別位于LSC和IR區(qū)域（圖1）。

2.3 密碼子偏好分析

分析藜屬植物葉綠體CDS的GC含量在25.93%～50.00%，平均38.02%。密碼子不同位置GC含量差異較大，GC1含量31.03%～65.62%，平均45.96%，GC2和GC3含量平均39.78%和28.34%，GC3含量最低（圖2），表明藜屬植物葉綠體基因組偏好以A和U堿基結(jié)尾。RSCU分析顯示，值大于1的密碼子有30種，除UUG（Leu）外，其它29個(gè)均以A/U堿基結(jié)尾，說明高頻密碼子的第三個(gè)堿基偏向A/U（圖3）。

2.4 重復(fù)序列分析

MISA分析藜屬植物葉綠體基因組中的SSR，結(jié)果顯示所有種中均只有單堿基至五堿基重復(fù)，數(shù)量為44～54（圖4）。單堿基重復(fù)的數(shù)目最多，占比最低的為小藜57.45%。其次為二堿基重復(fù)7～12個(gè)以及四堿基重復(fù)5～9個(gè)。三堿基和五堿基重復(fù)較少，共1～3個(gè)。從堿基組成看，除蒼白莖藜有（C）₁₁和（G）₁₁各1個(gè)外，其他的單堿基重復(fù)和所有的三堿基以及五堿基重復(fù)全部由A、T堿基組成。二堿基和四堿基重復(fù)中，所有物種都含有2個(gè)（CG）₅和各1個(gè)（AGGT）₃、（CTAC）₃，位于IR區(qū)的兩個(gè)rrn23S基因中，其他重復(fù)以AT堿基為主。分析SSRs在莧色藜葉綠體基因組四分體結(jié)構(gòu)的分布，LSC有36個(gè)，SSC有9個(gè)，IRa和IRb各4個(gè)。從基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的角度來看，32個(gè)位于基因間隔區(qū)，7個(gè)位于內(nèi)含子，14個(gè)位于外顯子。

Reputer分析其中的散在重復(fù)，數(shù)量在50～72個(gè)之間，幾乎全部為正向重復(fù)（Forward repeat，F(xiàn)）和回文重復(fù)（Palindrome repeat，P）。重復(fù)的長度以30～39 bp為主，其次為40～49 bp長度，絕大部分物種中二者占比多于60%（圖5）。

2.5 藜屬植物葉綠體基因組的共線性與核苷酸多樣性分析

使用Mauve軟件進(jìn)行多重基因組比對分析11個(gè)藜屬植物和市藜屬植物灰綠藜的葉綠體基因組中的重排和共線性。結(jié)果顯示，藜屬植物的葉綠體基因組有5個(gè)局部共線區(qū)域，序列具有較高的相似性，而灰綠藜的LSC區(qū)rbcl-trnV-UAC間的序列發(fā)生了倒置（圖6）。從葉綠體基因組的4個(gè)組分看，IR區(qū)序列的變異較低，LSC和SSC區(qū)的變異程度較高。

滑動(dòng)窗口分析11個(gè)藜屬植物葉綠體基因組的核苷酸多樣性指數(shù)Pi值在0～0.0244，平均0.0057，從四分體結(jié)構(gòu)看，SSC區(qū)0.0093gt;LSC區(qū)"0.0062gt;IR區(qū)0.0012。Pi最高值0.0244在trnT-UGU-trnF-GAA處，大于0.015的區(qū)域還有LSC區(qū)的基因間隔區(qū)matk-rps16、psbI-trnS-GCU、psaA-ycf3、ycf3-trnS-GGA、rps4-trnT-UGU、trnT-UGU-trnF-GAA、psbE-petL、psaJ-rpl33和rpl33-rps18和SSC區(qū)的基因間隔區(qū)ndhF-rpl32和rpl32-trnL-UAG，以及基因ndhF和ycf1內(nèi)部（圖7）。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育

以灰綠藜為外群分析藜屬植物的進(jìn)化關(guān)系，分別構(gòu)建最大似然法（ML）和貝葉斯方法（BI）系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果兩個(gè)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（圖8），且ML進(jìn)化樹分支上支持值均大于50%，BI系統(tǒng)發(fā)育樹除莧色藜和臺灣藜的聚合位點(diǎn)外，也都大于50%，說明分析結(jié)果較為可靠。兩個(gè)進(jìn)化樹中，莧色藜均與臺灣藜聚合，與麻籽藜和尖頭葉藜、藜和菱葉藜聚合的分支互為姊妹群。小藜和瑞典藜聚合在一個(gè)分支，藜屬重要的糧食作物藜麥和蒼白莖藜以及C. petiolare一起位于進(jìn)化樹的基部，與傳統(tǒng)的進(jìn)化分類一致。

2.7 藜麥和莧色藜單拷貝核基因和葉綠體基因的遺傳距離

以藜麥為參照，easy353組裝獲得符合條件的莧色藜單拷貝核基因64個(gè)，分別計(jì)算二者所有單拷貝核基因的遺傳距離在0～0.738之間，其中小于0.1和0.1～0.2的基因數(shù)分別27和22個(gè)，二者占比76.56%（圖9）。同時(shí)計(jì)算二者葉綠體基因的遺傳距離最大值0.023，大部分基因（59個(gè)，占比76%）的遺傳距離小于0.01，說明核基因的遺傳距離大于葉綠體基因。

3 討論

莧色藜在野外的種群密度非常低，常被用作病毒指示植物，其遺傳信息十分匱乏，也缺乏有效的基因標(biāo)簽。本研究通過MGISEQ-200RS高通量測序技術(shù)獲得了莧色藜葉綠體基因組為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈分子，由LSC、SSC和兩個(gè)IR區(qū)組成，序列長152 193 bp，GC含量37.25%，注釋蛋白編碼基因86個(gè)，與目前公布的同屬植物葉綠體基因組特征較為一致。

堿基突變和自然選擇是影響密碼子偏好的重要因素，其中，植物線粒體和葉綠體基因組密碼子的偏好主要受自然選擇的影響^［26］。本研究分析藜屬不同種植物的葉綠體基因組密碼子不同位置的GC含量都是GC1gt;GC2gt;GC3，說明該屬植物密碼子第3位偏好使用A、U結(jié)尾，即為NNA或NNU型，這一特征與其它綠色植物葉綠體基因組的特征一致。RSCU分析藜屬植物葉綠體20種氨基酸均有密碼子顯示出使用偏好（RSCUgt;1），說明開展藜屬植物葉綠體基因工程研究時(shí)，最優(yōu)密碼子應(yīng)選擇A/U堿基結(jié)尾，能夠提高外源基因表達(dá)水平。

基因組中的重復(fù)序列，一般具有很好的重復(fù)性和豐富的多態(tài)性，在種屬遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源鑒定等方面具有重要應(yīng)用。本研究藜屬植物的SSR分布在LSC、SSC和IR區(qū)，單核苷酸重復(fù)占比最高，IR區(qū)較為保守，LSC區(qū)和SSC區(qū)的具有較高的多態(tài)性，可開發(fā)為藜屬內(nèi)物種分子鑒定的標(biāo)簽。共線性分析獲得藜屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)較保守，而是藜屬灰綠藜LSC區(qū)rbcl-trnV-UAC間的序列倒置，這種情況也發(fā)生在澤瀉目植物的部分科^［27］、豆科苜蓿^［28］等中?；瑒?dòng)窗口分析核苷酸多樣性Pi指數(shù)獲得具有高多態(tài)性的區(qū)域，多態(tài)性位點(diǎn)主要在基因間隔區(qū)和少量基因的內(nèi)部，可作為藜屬植物種質(zhì)資源鑒定研究的候選。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究莧色藜與臺灣藜的親緣關(guān)系最近，同時(shí)二者也具有相似的長度和堿基組成，這些均為利用葉綠體鑒定其種質(zhì)提供了數(shù)據(jù)支持。

大多數(shù)被子植物都經(jīng)歷了全基因組復(fù)制或多倍化，甚至大規(guī)模的重復(fù)序列，這導(dǎo)致植物基因組的特征復(fù)雜，也為基于核DNA序列的遺傳分析和種質(zhì)鑒定帶來一定的困難^［29］。同時(shí)基因組中也存在拷貝數(shù)較少，只有1個(gè)或幾個(gè)但獲取比較困難的單拷貝核基因。該類基因大多為組成性表達(dá)持家基因，能更準(zhǔn)確進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的重建和估算。目前藜麥的單拷貝核基因已被鑒定，并被上傳被子植物單拷貝核基因網(wǎng)站。我們以其為參考，鑒定獲得了64個(gè)莧色藜的核單拷貝核基因，這為從核的角度鑒定莧色藜提供了依據(jù)。同時(shí)我們計(jì)算了莧色藜和藜麥核單拷貝核基因的遺傳距離最高0.738，大部分為0～0.2，而大部分葉綠體基因的遺傳距離小于0.01，這與植物葉綠體基因進(jìn)化速度快于線粒體，而慢于核基因的結(jié)論一致^［30］。

4 結(jié)論

莧色藜葉綠體基因組全長152 193 bp，為典型的四分體結(jié)構(gòu)，GC含量37.25%，共編碼131個(gè)基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因86個(gè)，密碼子偏好以A/U結(jié)尾。SSR位點(diǎn)分布不均衡，單核苷酸重復(fù)為主要組成。共線性分析莧色藜沒有基因重排現(xiàn)象，與其他物種的差異主要在基因間隔區(qū)。在系統(tǒng)發(fā)育上，莧色藜與臺灣藜的親緣關(guān)系最近，與藜屬內(nèi)其他植物的遺傳距離也較近，與傳統(tǒng)分類學(xué)一致?；谇{色藜與藜麥葉綠體基因的遺傳距離小于核基因，這說明葉綠體基因在研究種屬的分類中具有優(yōu)勢。

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（責(zé)任編輯""彭露茜）

引用格式：孔衛(wèi)青， 禚蘇， 楊金宏.莧色藜葉綠體基因組的解析與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].草地學(xué)報(bào)，2025，33（3）：739-747

Citation：KONG Wei-qing， ZHUO Su， YANG Jin-hong.Chloroplast Genome Characteristics and Phylogenetic Analysis of"Chenopodium amaranticolor[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（3）：739-747

基金項(xiàng)目：陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020NY-138）；陜西省教育廳重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（20JS003）資助

作者簡介：孔衛(wèi)青（1980-），女，漢族，山東菏澤人，博士，研究員，主要從事植物病害與資源開發(fā)利用研究，E-mail：275455929@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yangjinhong@aku.edu.cn