甘藍(lán)β-淀粉酶基因家族的鑒定及其響應(yīng)低溫脅迫的表達(dá)分析

收稿日期：2024-03-25

基金項(xiàng)目：2024年度江蘇省青年科技人才托舉工程項(xiàng)目（JSTJ-2024-610）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（BE2021399）

作者簡介：山 溪（1990-）， 女， 河南洛陽人， 碩士， 助理研究員， 主要從事甘藍(lán)類蔬菜遺傳育種研究。（E-mail）saiwaicanxue1990@163.com

通訊作者：戴忠良，（E-mail）daizhongliang2008@126.com

摘要： β-淀粉酶（BAM）是植物水解淀粉的重要酶類，在植物應(yīng)對非生物脅迫響應(yīng)中有重要作用。本研究基于甘藍(lán)BRAD參考基因組的全基因組序列，分離鑒定得到20個BolBAM基因，并對其家族成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白質(zhì)特征分析、基因結(jié)構(gòu)分析、不同器官/組織中的相對表達(dá)量分析、低溫（2 ℃）脅迫下的基因表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，從甘藍(lán)中共鑒定得到20個BolBAM蛋白，BolBAM蛋白的氨基酸序列長度范圍是193 aa（BolBAM3c）～678 aa（BolBAM7）；甘藍(lán)BAM蛋白家族成員兼有弱酸性、弱堿性蛋白質(zhì)；除BolBAM11、BolBAM12、BolBAM14外，其他BolBAM蛋白均為親水性蛋白質(zhì)。RNA-Seq（轉(zhuǎn)錄組）分析結(jié)果表明，BolBAM1b、BolBAM5a、BolBAM9b在7個組織/器官中的相對表達(dá)量均較高，在花中BolBAM1b的相對表達(dá)量最高，在角果中BolBAM5a的相對表達(dá)量最高，在愈傷組織中BolBAM9b的相對表達(dá)量最高。本研究還發(fā)現(xiàn)，在甘藍(lán)耐冷材料923、冷敏材料D9中，14個BolBAM基因受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)；冷敏材料D9中BolBAM3a的相對表達(dá)量在低溫處理6 h時高于耐冷材料923，但在低溫處理24 h時，其相對表達(dá)量顯著低于923；耐冷材料923中BolBAM3b的相對表達(dá)量在低溫處理6 h、24 h時均顯著高于冷敏材料D9。本研究結(jié)果為后續(xù)開展BolBAM3a、BolBAM3b基因調(diào)控甘藍(lán)應(yīng)對低溫脅迫的研究提供了重要參考。

關(guān)鍵詞： 甘藍(lán)；BAM基因家族；低溫脅迫；亞細(xì)胞定位

中圖分類號： S635.01"" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2025）02-0345-10

Identification of β-amylase gene family in cabbage and the expression analysis in response to low temperature stress

SHAN Xi， TAO Meiqi， PAN Yongfei， QIN Wenbin， ZHANG Zhenchao， YAO Yuemei， DAI Zhongliang

（Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences of the Ning-Zhen Hilly District， Jurong 212400， China）

Abstract： β-amylase （BAM） is an important enzyme in the hydrolysis of plant starch， playing a crucial role in the response of plants to abiotic stress. This study， which was based on the whole genome sequence of the cabbage BRAD reference genome， identified 20 BolBAM genes. The phylogenetic analysis， protein characteristics， gene structure， and expression levels in different organs or tissues of its family members were analyzed. Additionally， the gene expression patterns under 2 ℃ low temperature stress were also examined. The results showed that a total of 20 BolBAM proteins were identified in cabbage. The amino acid sequence length of BolBAM proteins ranged from 193 aa （BolBAM3c） to 678 aa （BolBAM7）. Members of the cabbage BAM protein family included both weakly acidic and weakly alkaline proteins. Except for BolBAM11， BolBAM12， and BolBAM14， all other BolBAM proteins were hydrophilic. The RNA-Seq results showed that BolBAM1b， BolBAM5a， and BolBAM9b had relatively high expression levels in seven tissues or organs， with BolBAM1b showing the highest expression in flowers， BolBAM5a in pods， and BolBAM9b in callus tissue. This study found that the expression of 14 BolBAM genes in the cold-resistant material 923 and cold-sensitive material D9 of cabbage was induced by low temperature. The relative expression of BolBAM3a in cold-sensitive material D9 was higher than that in cold-resistant material 923 at 6 h of low temperature treatment， but it was significantly lower than that in cold-resistant material 923 at 24 h of low temperature treatment. The relative expression of BolBAM3b in cold-resistant material 923 was significantly higher than that in cold-sensitive material D9 at 6 h and 24 h of low temperature treatment. This study provides important insights for further research on the regulation of low temperature response in cabbage by the BolBAM3a and BolBAM3b genes.

Key words： cabbage;BAM gene family;low temperature stress;subcellular localization

甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata L.）為十字花科蕓薹屬二年生蔬菜作物。甘藍(lán)葉片從里面充實(shí)形成葉球，食用部分不接觸農(nóng)藥，因而具備阻隔外界污染的生長特性。此外，甘藍(lán)富含蘿卜硫素、維生素，因而成為深受人們喜愛的安全保健型蔬菜。甘藍(lán)適應(yīng)性、抗逆性強(qiáng)，易貯藏，耐運(yùn)輸，產(chǎn)量高，在中國廣泛種植^[1]。

低溫是制約植物地理分布、生產(chǎn)和產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一^[2]，在低溫脅迫下，植物中各種酶活性減弱，從而造成光合作用、呼吸作用減弱，進(jìn)而引起代謝失調(diào)。甘藍(lán)適宜的生長溫度是15～20 ℃，近年來，在極端低溫和“倒春寒”的影響下，甘藍(lán)受到低溫冷害的現(xiàn)象逐年增加，造成甘藍(lán)抽薹^[3]，當(dāng)溫度低于甘藍(lán)的耐受程度時，會直接造成幼苗直接凍死或凍傷葉球等后果，嚴(yán)重時還會影響甘藍(lán)的產(chǎn)量^[4-5]。

植物代謝產(chǎn)物與植物對脅迫的響應(yīng)有很大關(guān)系，特別是可溶性糖類、氨基酸、有機(jī)酸、多胺類和脂質(zhì)類物質(zhì)。當(dāng)植物受到冷脅迫時，受到顯著影響的是碳水化合物代謝，特別是糖代謝^[6-10]。淀粉是植物中分布最廣泛的非結(jié)構(gòu)型碳水化合物，α-淀粉酶（AMY）、β-淀粉酶（BAM）介導(dǎo)的淀粉降解在碳水化合物代謝中起到重要作用，與植物的脅迫響應(yīng)有密切關(guān)系^{[7，11-12]}。目前，擬南芥中已知的BAM基因有9個，其中5個BAM（BAM1、BAM2、BAM3、BAM5、BAM6）具有酶催化活性^[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠誘導(dǎo)植株產(chǎn)生β-淀粉酶^[14-15]。此外，Seki等^[16]篩選到低溫誘導(dǎo)的AtBAM3；Kaplan等^[17]已證實(shí)，在5 ℃處理6 h后，擬南芥中AtBAM3的表達(dá)量達(dá)到峰值。有研究發(fā)現(xiàn)，BAM在低溫轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)下可能加速淀粉降解^[18]。此外，AtBAM3及其同源基因在增強(qiáng)低溫耐性方面也表現(xiàn)出相同功能。另外，研究者也發(fā)現(xiàn)油菜、馬鈴薯、茶樹、獼猴桃、梨等植物中的BAM基因具有冷誘導(dǎo)的表達(dá)特征^[13，19-24]。雙子葉植物、單子葉植物中的BAM基因均與低溫脅迫相關(guān)，植物中的BAM基因在響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮的作用相對保守。

本研究通過對BolBAM基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育、編碼蛋白質(zhì)特征、基因結(jié)構(gòu)、不同器官/組織中的表達(dá)量、低溫（2 ℃）脅迫下的基因表達(dá)模式分析，篩選出候選的低溫誘導(dǎo)基因，分析其在甘藍(lán)中是否具有冷誘導(dǎo)特性，以期為進(jìn)一步開展BolBAM基因?qū)Φ蜏仨憫?yīng)的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)BAM家族成員的鑒定

擬南芥的AtBAM1～AtBAM9蛋白序列是從TAIR數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）中得到的。甘藍(lán)、白菜的全基因組序列分別參考BRAD（http：//brassicadb.cn/#/）、Chiifu-401-42 V3.0^[25]。使用隱馬爾科夫模型（HMM）在甘藍(lán)、白菜的全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索在N端有糖結(jié)合域14（PF01373）的序列，從而獲得候選甘藍(lán)BolBAM、白菜BraBAM蛋白序列。用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）、美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）batch CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）檢測BolBAM、BraBAM蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，確定甘藍(lán)BolBAM、白菜BraBAM家族成員。甘藍(lán)BolBAM基因、白菜BraBAM基因則根據(jù)其與AtBAM基因的同源性及共線性關(guān)系，通過添加后綴（a、b……等）進(jìn)行命名。

1.2 甘藍(lán)BolBAM系統(tǒng)發(fā)育分析和基因結(jié)構(gòu)分析

用MEGA 7.0對擬南芥、甘藍(lán)、白菜的BAM蛋白序列進(jìn)行聚類分析，采用鄰接法（設(shè)置Bootstrap值為1 000），繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。分別從甘藍(lán)923基因組中搜尋獲得BolBAM的DNA編碼序列（CDS），用GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）工具繪制BolBAM基因結(jié)構(gòu)圖。

1.3 BolBAM蛋白理化性質(zhì)和保守基序分析

用ExPaSy（https：//web.expasy.org/protparam/）工具分析BolBAM蛋白的特性，如相對分子量、脂肪族氨基酸數(shù)量、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)疏水性等。用MEME（http：//meme-suite. org/）模體分析工具對BolBAM蛋白進(jìn)行保守基序分析（最大基序設(shè)置為10）。

1.4 BolBAM基因的物理位置和共線性分析

用MapChart軟件^[26]根據(jù)BolBAM的物理位置信息繪制BolBAM的染色體位置圖譜。根據(jù)TAIR（擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫）、甘藍(lán)BRAD基因組和白菜Chiifu-401-42 V3.0基因組中擬南芥、甘藍(lán)、白菜的BAM信息，用TBtools^[27]對它們之間的直系、旁系同源基因關(guān)系進(jìn)行分析，并繪制共線性圖。

1.5 BolBAM在不同器官/組織及低溫脅迫下的表達(dá)分析

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載甘藍(lán)02-12在愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果中的RNA-Seq（轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)（SRA accession 數(shù)據(jù)集： GSE42891）^[28]，分析BolBAM在不同器官/組織中的轉(zhuǎn)錄水平，用每千堿基轉(zhuǎn)錄本每百萬映射讀長（Reads）的片段數(shù)（FPKM）表示BolBAM的表達(dá)豐度，分析BolBAM在7個器官/組織中的相對表達(dá)量。

以冷敏甘藍(lán)D9（CS-D9）、耐冷甘藍(lán)923（CT-923）為試驗(yàn)材料，將五葉一心期的幼苗轉(zhuǎn)入春化室，進(jìn)行2 ℃低溫處理，對照幼苗仍處于正常生長狀態(tài)。分別取處理6 h、24 h的葉片，用錫箔紙包裹后立即冷凍于液氮中，保存于-80 ℃冰箱，用于RNA-Seq分析。用FPKM值繪制BolBAM的低溫表達(dá)圖。

1.6 BoBAM3a、BoBAM3b的亞細(xì)胞定位

分別在本氏煙草葉片表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)BoBAM3a-GFP（綠色熒光蛋白）、BoBAM3b-GFP融合表達(dá)蛋白質(zhì)，研究BoBAM3a、BoBAM3b基因的亞細(xì)胞定位特性。分別用帶有Sac I限制性酶切位點(diǎn)的正向引物、Xba I限制性酶切位點(diǎn)的反向引物進(jìn)行擴(kuò)增（引物序列見表1），再用Sac I、Xba I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，隨后將酶切產(chǎn)物連接到pCAMBIA2300-GFP載體中，分別將成功構(gòu)建的載體、空載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，用農(nóng)桿菌侵染煙草倒三葉、倒四葉，侵染3 d后，用FV10-ASW激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)BolBAM家族成員的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對甘藍(lán)、白菜全基因組數(shù)據(jù)庫的BLASTP搜索和N端糖結(jié)合域14的驗(yàn)證，共篩選得到20個BolBAM蛋白和14個BraBAM蛋白。使用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和NCBI batch CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，這20個BolBAM蛋白和14個BraBAM蛋白均含有Glyco_hydro_14保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其與AtBAM基因的同源性來添加后綴（a、b……）進(jìn)行命名，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖1顯示，這些BAM蛋白被分為4個不同的亞組，亞組Ⅱ中含有最多的BolBAM蛋白（7個），亞組I含有最多的BraBAM蛋白（5個）。

2.2 甘藍(lán)BolBAM家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)特征分析

由表2可以看出，BolBAM蛋白的氨基酸序列長度范圍是193 aa（BolBAM3c）～678 aa（BolBAM7），對應(yīng)的開放閱讀框（ORF）長度范圍是582 bp（BolBAM3c）～2 037 bp（BolBAM7），相對分子量范圍是21 590（BolBAM3c）～76 340（BolBAM4a），BolBAM蛋白的理論等電點(diǎn)范圍是4.90（BolBAM5b）～9.58（BolBAM13），BolBAM蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)范圍是25.85（BolBAM5a）～58.07（BolBAM13），有10個BolBAM蛋白不穩(wěn)定指數(shù)超過臨界值40.00。此外，甘藍(lán)BolBAM家族成員脂肪族氨基酸指數(shù)范圍是62.06（BolBAM3a）～107.02（BolBAM14），親水性平均系數(shù)范圍是-0.649（BolBAM3c）～0.554（BolBAM14），除了BolBAM11、BolBAM12和BolBAM14外，其他BolBAM蛋白均為親水性蛋白質(zhì)。

用MEME在線分析工具分析BolBAM蛋白的結(jié)構(gòu)多樣性。由圖2可以看出，亞組Ⅰ中的BolBAM蛋白基序相似，同一亞組中大多數(shù)BolBAM蛋白基序具有保守基序區(qū)域。

用GSDS繪制BolBAM基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖，來分析BolBAM基因的結(jié)構(gòu)多樣性。BolBAM基因含有3個（BolBAM9a、BolBAM9b）～12個（BolBAM4a）個外顯子（圖2）。BolBAM基因在外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)上存在差異，這可能是其具有功能多樣性的原因之一。

2.3 甘藍(lán)BolBAM家族成員的物理位置和共線性分析

如圖3所示，20個BolBAM家族成員基因被定位在8條染色體上，其中BolBAM5a、BolBAM5b串聯(lián)分布在8號染色體上，1號染色體、5號染色體上各只有1個BolBAM基因，2號、7號、9號染色體上各有2個BolBAM基因，其他染色體上均有BolBAM基因。

用BRAD數(shù)據(jù)庫分別分析甘藍(lán)、擬南芥和白菜之間BAM基因的直系、旁系同源關(guān)系，繪制BolBAM、BraBAM、AtBAM基因之間的共線性關(guān)系圖。如圖4所示，甘藍(lán)、白菜的BAM基因在蕓薹屬特有的全基因組三倍化事件中均被保存下來，且4個BolBAM（BolBAM1、BolBAM4、BolBAM5和BolBAM9）保留了雙拷貝，BolBAM3保留了3個拷貝，白菜中4個BraBAM（BraBAM1、BraBAM3、BraBAM4和BraBAM9）保留了雙拷貝。與擬南芥相比，甘藍(lán)BAM基因家族擴(kuò)展了5個BolBAM，白菜BAM基因家族擴(kuò)展了1個BraBAM。

2.4 甘藍(lán)BolBAM基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)特性分析

本研究從甘藍(lán)愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果中BolBAM基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析了BolBAM基因。圖5顯示，BolBAM11～BolBAM14在各個組織/器官中均沒有表達(dá)（圖5A中未展示）；BolBAM10僅在芽中表達(dá)，且相對表達(dá)量較低；BolBAM1b、BolBAM5a、BolBAM9b在7個組織/器官中的相對表達(dá)量均較高；BolBAM1b在花中的相對表達(dá)量最高；BolBAM5a在角果中的相對表達(dá)量最高；BolBAM9b在愈傷組織中的相對表達(dá)量最高。

本研究還分析了不同耐寒性甘藍(lán)材料中BolBAM基因在2 ℃低溫脅迫下的表達(dá)模式。圖5顯示，BolBAM3c、BolBAM10～BolBAM14的相對表達(dá)量均為0，2個甘藍(lán)材料中BolBAM1b的相對表達(dá)量

在低溫處理6 h、24 h時均較CK顯著上調(diào)，且冷敏材料D9中BolBAM1b的相對表達(dá)量顯著高于耐冷材料923；冷敏材料D9中BolBAM3a的相對表達(dá)量在低溫處理6 h時高于耐冷材料923，但在低溫處理24 h時，其相對表達(dá)量顯著低于923；耐冷材料923中BolBAM3b的相對表達(dá)量在低溫處理6 h、24 h時均顯著高于冷敏材料D9。

2.5 BolBAM3a和BolBAM3b蛋白的亞細(xì)胞定位

用Plant-mPLoc進(jìn)行在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)BolBAM3a、BolBAM3b蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。為了進(jìn)一步明確BolBAM3a、BolBAM3b蛋白的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了BolBAM3a、BolBAM3b基因和GFP的融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片。共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，BolBAM3a定位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜，BolBAM3b定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核（圖6）。

3 討論

在非生物脅迫下，BAM基因具有調(diào)節(jié)植物體內(nèi)糖平衡的作用^[29-30]。本研究利用全基因組分析鑒定得到20個BolBAM基因，均含有糖結(jié)合域14。根據(jù)氨基酸序列比對，將擬南芥、甘藍(lán)和白菜的BAM蛋白分為4個亞組。甘藍(lán)BolBAM基因家族在進(jìn)化過程中擴(kuò)大了家族成員，通過同源性分析發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)、白菜的BAM基因均發(fā)生了基因復(fù)制，這可能是全基因組多倍化產(chǎn)生的，全基因組三倍化事件^[31-32]豐富了蕓薹屬植物中的BAM家族。由于甘藍(lán)中BolBAM1、BolBAM3、BolBAM4和BolBAM9與擬南芥中同源的AtBAM1、AtBAM3、AtBAM4和AtBAM9發(fā)生了基因復(fù)制現(xiàn)象，導(dǎo)致加倍后的同源BolBAM1、BolBAM3、BolBAM4和BolBAM9不在同一條染色體上，加倍后僅BolBAM5a、BolBAM5b串聯(lián)分布在8號染色體上。通過基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在全基因組三倍化事件后，BolBAM3a、BolBAM3b基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中未發(fā)生變異，基因結(jié)構(gòu)比較相似，而BolBAM3c出現(xiàn)了較多的外顯子，這可能會導(dǎo)致其基因功能發(fā)生變化。

BAM基因已被證明參與多種非生物脅迫，BAM蛋白作為信號調(diào)節(jié)因子在應(yīng)對非生物脅迫中起著積極的調(diào)節(jié)作用^[33-35]。已有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtBAM1、AtBAM3參與應(yīng)激反應(yīng)^[36]，AtBAM4可協(xié)助淀粉水解^[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)923、D9中14個BolBAM基因受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，甘藍(lán)923、D9中BolBAM1b的相對表達(dá)量在低溫處理6 h、24 h時呈上升趨勢，甘藍(lán)923中BolBAM3b的相對表達(dá)量在低溫處理6 h顯著高于D9，BolBAM3a的相對表達(dá)量在低溫處理24 h時達(dá)到峰值。甘藍(lán)923中BolBAM3a、BolBAM3b的相對表達(dá)量在低溫處理24 h時高于低溫處理6 h時，D9中BolBAM3a、BolBAM3b的相對表達(dá)量則表現(xiàn)出相反的趨勢。在冷敏材料D9中，BolBAM3a、BolBAM3b響應(yīng)低溫誘導(dǎo)最迅速，而在耐冷甘藍(lán)923中，BolBAM3a、BolBAM3b可以持續(xù)被低溫誘導(dǎo)。這些結(jié)果為后續(xù)開展BolBAM3a、BolBAM3b基因調(diào)控甘藍(lán)低溫響應(yīng)的研究提供了重要參考。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）